Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Литературный обзор 8
2.1. Номенклатура 8-азапуринов 8
2.2. Методы синтеза 8-азапуринов 8
2.2.1. Синтез 8-азапуринов с функциональными заместителями в положении 2 (метод Траубе) 9
2.2.1.1. Получение 2,4,6-замещенных пиримидинов 9
2.2.1.2. Введение аминогруппы в положение 5 пиримидина 10
2.2.1.3. Замыкание 8-азапуринового цикла 12
2.2.2. Другие методы синтеза 8-азапуринов из пиримидинов 12
2.2.3. Синтез 8-азапуринов из 5-амино-1,2,3-триазолов 15
2.2.3.1. Получение азидов 15
2.2.3.2. Азиды в реакциях диполярного 1,3-Циклоприсоединения 16
2.2.3.3. Синтез 1,4-замещенных 5-амино-1,2,3-триазолов 17
2.2.3.4. Реакционная способность азидов и границы их применения в синтезе 5-амино-1,2,3-триазолов 19
2.2.3.5. Перегруппировка Димрота в гетероциклических системах 20
2.2.3.6. Способы построения 8-азапуринового гетероцикла исходя из замещенных 5-амино-1,2,3-триазолов 22
2.3. Способы модификации гетероцикла 26
2.3.1. Нуклеофильное замещение в положении 6 8-азапурина 26
2.3.2. Построение трициклических аннелированных гетеросистем на основе 8-азапурина 28
2.3.3. Изомерия трициклических соединений на основе 8-азапурина 30
2.3.4. Получение других аннелированных гетероциклов на основе 8-азапурина 32
2.3.5. Изомерия 6-замещенных 8-азапуринов 32
2.4. Биологические свойства 8-азапуринов 35
2.4.1. Антивирусная активность 8-азапуринов 35
2.4.2. Биологическая активность 8-азапуринов по отношению к рецепторам семейства GPCR 36
2.4.3. Противоаллергическая активность некоторых 8-азапуринов 39
3. Обсуждение результатов 41
3.1. Синтетический путь получения 8-азапурин-6-онов 41
3.1.1. Оптимизация методики получения исходных 8-азапурин-6-онов (8-азагипоксантинов) 41
3.1.2. Строение и физико-химические свойства 8-азапуринов-6-онов 43
3.1.3. Синтез 2-алкилтиозамещенных 8-азапурин-6-онов 46
3.1.4. Закономерности масс-спектрального распада 2-метилтио-замещенных 8-азапурин-6-онов 48
3.2. Синтез 6-замещенных 8-азапуринов 51
3.2.1. Синтез 6-хлор-8-азапуринов 51
3.2.2. Синтез 6-аминозамещенных 8-азапуринов 52
3.2.3. Проблема изомерии 6-аминозамещенных 8-азапуринов 55
3.2.4. Синтез 6-оксипроизводных 8-азапуринов 57
3.2.5. Синтез 6-тиопроизводных 8-азапуринов 59
3.2.6. NH-SH таутомерия 8-азапурин-6-тиона 60
3.2.7. Синтез 6-карбозамещенных 8-азапуринов 61
3.2.8. Установление структуры 6-С-замещенных 8-азапуринов 64
3.2.9. Изомерия 6-С-замещенных 8-азапуринов илиденового типа 68
3.3. Синтез аннелированных трициклических структур на основе 8-азапурина 71
3.3.1. Синтез 5-замещенных 1Я-тетразолов 72
3.3.2. Синтез ЗН-[1,2,3]триазоло[4,5-е][1,2,4]триазоло[3,4-с]пирими-динов 72
3.3.3. Синтез ЗН-[ 1,2,3]триазоло[5,4-е] [ 1,2,4]триазоло[ 1,5-с]пирими-динов 74
3.3.4. Восстановление производных 8-азапурина 78
3.4. Биологические свойства 8-азапуринов 81
3.4.1. Этапы биотестирования соединений. Виртуальный скрининг 81
3.4.1.1. Применение методов компьютерного моделирования для виртуального скрининга 81
3.4.1.2. Создание виртуальной библиотеки соединений с использованием дескрипторов 82
3.4.1.3. 8-Азапурины - потенциальные ингибиторы киназ 83
3.4.1.4. Потенциальная биологическая активность 8-азапуринов к рецепторам семейства GPCR 84
3.4.2. Биологические испытания in vitro 86
4. Экспериментальная часть 89
Выводы 126
- Методы синтеза 8-азапуринов
- Биологические свойства 8-азапуринов
- Синтез 6-замещенных 8-азапуринов
- Биологические свойства 8-азапуринов
Введение к работе
Актуальность работы. Настоящее исследование связано с поиском и направленным синтезом новых биологически активных веществ, являющихся азааналогами пуринов — важнейшего класса азотистых оснований. Работа посвящена химии 8-азапурина (3#-1,2,3-триазоло[4,5-d]-пиримидина), поскольку изоструктурные лекарственные препараты на основе пурина обладают широким спектром биологической активности.
Несмотря на то, что первые синтетические работы появились уже в 50х годах XX века, химия 8-азапурина получила свое второе рождение лишь в конце 80х в работах итальянских ученых с открытием принципиально нового подхода к синтезу системы 8-азапурина исходя из 1,2,3-триазолов. Такой подход позволил модифицировать положения 2 и 9, однако периферия описанных в литературе соединений не выходила за рамки тривиальных заместителей. Биологические исследования 8-азапуринов показывают, что наиболее активными являются соединения, содержащие в положении 9 заместитель бензильного типа, что связано с возможностью их ферментативного расщепления в организме с образованием структур, аналогичных по своему химическому строению аденину, гипоксантину и другим азотистым основаниям. Сообщается, однако, что такие соединения достаточно гидрофобны и имеют низкие показатели растворимости в воде. Сведения о 6-функциональнозамещенных 8-азапуринах крайне отрывочны. Интерес представляет введение в положение 6 8-азапурина различных фармакофорных заместителей, а также синтез 6-С-замещенных 8-азапуринов, пуриновые аналоги которых проявляют противоопухолевую и противовирусную активность. Более того, такие соединения интересны как биологические зонды для установления механизма взаимодействия с ферментами. Особый интерес представляет собой синтез аннелированных трициклических структур на основе 8-азапурина, единичные представители
которых проявляют чрезвычайно высокую биологическую активность в качестве ингибиторов А і и Аг подтипов аденозиновых рецепторов и обладают противоаллергическими свойствами. Совокупность этих обстоятельств делает актуальной проблему систематического подхода к синтезу разнообразных производных 8-азапурина, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, в положении 2 - заместитель алкильного типа, в положении 6 - связь С(6)-элемент (С, N, О, S), как потенциально активных соединений.
Цель работы. Целью диссертационного исследования является:
1. Создание обширной группы соединений, включающей:
синтез новых производных 8-азапурина, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, а также имеющих разнообразные фармакофорные заместители в положениях 2 и 6, в том числе повышающие растворимость данного класса веществ,
синтез новых трициклических соединений на основе 8-азапурина.
Установление детального строения всех новых веществ.
Оценка биологической активности новых производных 8-азапурина с помощью виртуального и реального биологического скрининга.
Научная новизна и практическая ценность. Разработан удобный подход к синтезу потенциально биологически активных производных 8-азапурина, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, в положении 6 - связь С(6)-элемент (С, N, О, S). В качестве исходных веществ использованы простые и доступные бензилгалогениды, цианацетамид и эфиры карбоновых кислот.
Изучены пути распада молекул 8-азапурин-6-онов под действием электронного удара. Установлены общие закономерности распада, на основе которых предположены наиболее вероятные пути метаболизма соединений такого типа в живом организме.
Предложен новый способ синтеза трициклических структур на основе 8-азапурина, основанный на взаимодействии 5-арил и 5-гетарил 1Я-тетра-золов с б-хлор-8-азапуринами, и проведено изучение устойчивости таких систем по отношению к различным восстановителям.
Всесторонне изучена структура всех соединений с использованием современных физико-химических методов, установлено их геометрическое строение. Показано, что 6-оксо и 6-тиозамещенные 8-азапурины находятся в амидной (тиоамидноЙ) форме, 6-карбозамещенные 8-азапурины — в илиденовой.
Проведен виртуальный скрининг всех синтезированных соединений по схеме LBD (Ligand-Based Design) и TBD (Target-Based Design) с помощью лицензионной программы SYBIL 6.9, а также биологические испытания in vitro некоторых б-аминозамещенных 8-азапуринов.
Структура диссертационной работы. Представленная диссертация написана в традиционном ключе и включает следующие разделы: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, список литературы и приложение.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.х.н. О.Г. Родину, а также благодарит д.х.н. B.C. Пашкова, д.х.н. А.И. Белоконя, к.х.н. А.Х. Булай за помощь при записи и обсуждении спектров ЯМР и LC/MS, к.х.н. И.И. Афанасьева за помощь при использовании методов компьютерного моделирования и биологических испытаний.
Методы синтеза 8-азапуринов
Первый синтез 8-азапуринов был осуществлен в 50х годах XX века наряду с получением пуринов из пиримидинов [1] и до начала 70х годов оставался единственным способом получения этой гетероциклической системы. Позднее был разработан метод получения 8-азапуринов из 5-амино-1,2,3-триазолов [2]. Большой вклад в развитие этого метода внесли итальянские ученые фармохимического университета В.Скартони, Д.Бьяджи, О.Оливи и др. [3,4]. 2.2.1. Синтез 8-азапуринов с функциональными заместителями в положении 2 (метод Траубе). Получение замещенных в положении 2 8-азапуринов удобно проводить по схеме Траубе [5]. Метод, являющийся наиболее распространенным в синтезе пуринов, нашел широкое применение и в синтезе их 8-азааналогов [6-8]: Удобство метода состоит в том, что в качестве исходных реагентов для синтеза используют самые различные 2,4,6-замещенные пиримидины, химия которых хорошо изучена. Синтетический путь получения 8-азапуринов из пиримидинов включает следующие стадии: 1. Получение замещенных пиримидинов. 2. Введение аминогруппы в положение 5 пиримидина. 3. Замыкание цикла путем диазотирования аминогруппы в положении 5 пиримидина. 2.2.1.1. Получение 2,4,6-замещенных пиримидинов. В качестве исходных соединений используют такие доступные реагенты, как тиобарбитуровая кислота (2-тио-4,6-дигидроксипиримидин) [9], урацил и другие 2,4,6-функциональнозамещенные пиримидины [6-8,10]. Последние, в свою очередь, легко получаются конденсацией амидиновых аналогов с дикарбонильными соединениями [11,12]. Для введения S-функ-ции в положение 2 8-азапурина используют 2-тиобарбитуровую кислоту и ее производные [9]. Непосредственное алкилирование тиофункции на стадии пиримидина приводит к получению 2-8-алкилзамещенных пиримидинов. Синтез аминозамещенных пиримидинов проводят по стандартной методике нагреванием гидроксипроизводных пиримидина в избытке хлорокиси фосфора в присутствие МТУ-диметиланилина с последующим нуклеофильным замещением атома хлора аминами [13-14]. Выбор аминов в качестве нуклеофилов достаточно велик: в реакцию вступают как алифатические амины, так и слабонуклеофильные анилины. В частности, авторы [10] сообщают о возможности селективного замещения одного атома хлора в соединении 2 различными аминами с выходами 50-70%.
Существует несколько способов синтеза 5-аминозамещенных пиримидинов: путем введения нитро-, нитрозо- или арилдиазогруппы с последующим восстановлением. Выбор метода введения аминогруппы зависит от природы заместителей в пиримидин овом цикле. Так, нитрование и нитрозирование обычно используют при наличии ОН- и ЫНг- заместителей в положениях 2,4,6 пиримидина [6-Ю], а введение диазогруппы - в различных хлорзамещенных пиримидинах [18,19]. Проводя нитрование азотной кислотой в течение 1 часа в мягких условиях, авторам [9, 10] удалось выделить ряд 5-нитропроизводных 5a-d с выходом порядка 70%. Так, конденсируя этил-2-нитрозоцианацетат 10 с различными бензамидинами с последующим восстановлением нитрозогруппы, авторам [22] удалось выделить ряд 2-арил-4,5-диаминопиримидинов 12а-с. Восстановление нитрозо- и нитрогруппы пиримидина обычно проводят цинковой или железной пылью в кислой [6] или нейтральной водно-спиртовой среде [8]. Возможно также восстановление водородом с использованием Ni Ренея [9], однако наличие S-функции в молекуле пиримидина сильно замедляло реакцию. В ряде случаев нитрозогруппу восстанавливали бисульфитом натрия [7,10,22]. Диазогруппу обычно восстанавливают цинком в разбавленной уксусной кислоте [18,19]. 2.2.1.3. Замыкание 8-азапуринового цикла. Замыкание 8-азапурина обычно проводят нитрозированием 5-амино-группы пиримидина изоамилнитритом в ацетонитриле при 80С [8-9]. Альтернативным способом является замыкание 8-азапуринового цикла путем взаимодействия с нитритом натрия в разбавленной (1:2) уксусной кислоте при охлаждении [6-7]. В обоих случаях продукт выделяли с невысоким выходом (30-40%). 2.2.2. Другие методы синтеза 8-азапуринов из пиримидинов. Интересный способ получения 8-азапуринов предложен бельгийскими учеными [23] исходя из 4,6-дихлор-5-нитропиримидина 13 по схеме: Канадские исследователи Г. Флит и Дж. Флеминг [26] предложили способ синтеза подобных соединений путем аминирования 8-азапурина 27, активированного гидридом натрия, О-мезитилсульфанил гидроксиламином (МСГА). Основным продуктом являлся продукт 25, изомеры 28-29 были выделены хроматографически в следовых количествах. Авторы отметили, что нитрозирование незащищенной группы гидразина в 5-амино-4-гидразинопиримидине 22 не приводит к продуктам 25, 28-29. Реакцию с ТозЫз проводили в достаточно мягких условиях при 20С в ТГФ в отсутствие щелочных катализаторов с образованием замещенных 5-амино-4-ацил-1,2,3-триазолов 40а-с. Было отмечено, что в процессе реакции частично происходит перегруппировка Димрота с образованием изомерных продуктов. Недостатком метода следует считать трудность получения исходных ААК, а также вероятность перегруппировки Димрота в условиях реакции. 2.2.3.4. Реакционная способность азидов и границы их применения в синтезе 5-амино-1,2,3-трназолов.
Среди азидов наиболее реакционноспособными в реакциях циклоприсоединения, катализируемых основаниями, являются ацилазиды. Последние реагируют с метиленактивными соединениями в очень мягких условиях, давая 1,2,3-триазолы [45]. Отмечено, что наиболее перспективно введение в реакцию алифатических азидов [46,47]. Однако использование азидов с небольшой молекулярной массой имеет ряд недостатков: а) сравнительно низкая реакционная способность в реакциях циклоприсоединения, катализируемых основаниями; б) триазолы, полученные из производных малоновой кислоты, неустойчивы в щелочной среде и претерпевают перегруппировку Димрота; в) использование малондинитрила может привести к побочным продуктам, т.к. интермедиат 41 может выступать в роли нитрила с образованием димера 42 [3,46]: В случае использования на первой стадии 2-цианацетамида образование таких димеров исключено; г) алифатические азиды, такие как метил-, этил- и винилазид, крайне неустойчивы и склонны к детонации [29]. Ароматические азиды, напротив, образуют 1-арил-1,2,3-триазолы уже при комнатной температуре. Перегруппировка Димрота происходит в последних при сравнительно высоких температурах [47,48]. Промежуточное положение занимают бензил, фенетил и другие подобные азиды с алифатическим мостиком. Они реагируют с малоновыми производными активнее, чем алкилазиды, но медленнее по сравнению с ароматическими азидами, вследствие электронных и стерических факторов [46,47,49]. Таким образом, скорость реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азидов к 1,3-диполярофилам уменьшается в ряду ацил » арил бензил фенетил алкил. 2.2.3.5. Перегруппировка Димрота в гетероциклических системах. Перегруппировка Димрота является классической для различных 2-ами-нозамещенных азотсодержащих гетероциклических систем, таких как пурин, пиримидин и 1,2,3-триазол. Механизм перегруппировки хорошо изучен и описан в учебной литературе [29,50]. Ниже приведена общая схема такой перегруппировки на примере 1,2,3-триазолов: Устойчивость 1-замещенных 5-амино-1,2,3-триазолов к перегруппировке Димрота зависит от природы заместителя R (т.е. от природы азида). Так, в случае RI= алкил, равновесие сдвинуто вправо, и соединение практически полностью находится в форме В. В случае R = арил, изомер А образуется только при нагревании, а в случае К] бензил, фенетил (или объемный алифатический заместитель), 5-амино-1,2,3-триазол существует только в форме А, перегруппировка Димрота не происходит. В свете изучения 8-азапуриновой гетероциклической системы следует рассмотреть особенности перегруппировки Димрота в пиримидинах и пуринах. Как и в аминотриазолах, наиболее легко подвергаются перегруппировке 1-алкилзамещенные2-иминопиримидины [51]:
Биологические свойства 8-азапуринов
Особый интерес к 8-азапуринам обусловлен их аналогией с пуриновыми основаниями. Некоторые производные 8-азапурина известны как антиметаболиты пуринов [99]. Открытие синтетических производных пуринов и пиримидинов, обладающих антивирусной активностью, таких как азидотимидин, рибавирин, ацикловир, цикларадин [100-103], привело к ощутимому прогрессу в области антивирусной терапии. В частности, ацикловир 101 является одним из наиболее эффективных препаратов, направленных против некоторых разновидностей вируса герпеса, таких как Herpes Simplex Virus J, //(HSV-I и HSV-II). Перспективным направлением в синтезе 8-азапуринов является создание синтетических аналогов природных азотистых оснований и соответствующих нуклеозидов. Одним из интересных примеров является синтез аналогов цитоцина 103а-Ь - природного экзоциклического аминонуклеозида, выделенного из гриба Citocybe inversa, проведенный независимо в двух лабораториях [15,104]. Биологические испытания соединений 103а-Ь выявили их ингибирующее действие на рост раковых клеток L1210 при лейкозе [105]. Наиболее интересным синтетическим аналогом цитоцина является 8-азанепланоцин 105: Биологические испытания показали активность 8-азанепланоцина против таких вирусов, как HSV-1 и HSV-2, вируса гриппа, однако наиболее важным является активность против двух видов цитомегаловируса человека (HCMV) в концентрациях значительно ниже порога цитотоксичности [106]. Такого же рода активность проявляют нуклеозиды 10ба-Ь — 107а-с [107,108]: В 70х годах XX века была обнаружена противоаллергическая активность у некоторых 9-арилзамещенных 8-азапурин-6-онов и 2-арил-9-алкил-замещенных 8-азагипоксантинов [48,60,72,111-113]. В работах [48,60] исследован ряд 6-амино-9-арилзамещенных 8-азапуринов на наличие разных видов биологической активности, в том числе и противоаллергической, и проведены предклинические испытания. Было установлено, что соединения 119a-f не оказывают влияние на центральную и периферическую нервную систему у мышей, не обладают и анальгезирующим действием. При проведении испытаний на крысах Wistar тестируемые вещества ингибировали анафилактическую реакцию. Показано, что 6-аминозамещенные азапурины активнее соответствующих 8-азапурин-6-онов (таблица 2.6). Таким образом, синтез 6-аминозамещенных 8-азапуринов с заместителями бензильного и арильного типа в положении 9 является перспективным направлением поиска новых биологически активных соединений. В литературе описаны два основных метода синтеза 8-азапурин-6-онов.
Первый, аналогичный получению пуринов из пиримидинов, достаточно трудоемок и ограничен небольшим выбором заместителей в положении 2 гетероцикла [6,7,10]. Он в основном применим для введения разнообразных заместителей в положение 9. Второй, менее изученный путь, основанный на конденсации 5-амино-4-кароксамидо-1,2,3-триазолов с эфирами карбоновых кислот, дает практически неограниченные возможности модификации положения 2 8-азапурина [3,4,27]. В литературе имеется немного примеров подобных соединений, как правило, с тривиальными заместителями в этом положении [25-28, 45-49], поэтому актуальной задачей являлась разработка новых подходов к синтезу таких структур. Исходные бензилазиды 1-7 с высокими выходами получали из соответствующих бензилгалогенидов кипячением в смеси ацетона и ацетонитрила с избытком азида натрия. Известно [27,30], что при нуклеофильном замещении хлора (брома) в алифатическом ряду обычно добавляют иодид калия в качестве катализатора, однако эксперимент показал, что реакция хорошо протекает и в его отсутствие. В случае бензилбромидов реакция проходила практически полностью уже через 2 часа после начала нагревания (по данным LC/MS). Для замещения атома хлора время реакции увеличивалось до 8 часов. Бензилазиды практически не отличались по подвижности от исходных галогенидов, поэтому контроль полноты проведения реакции осуществляли при помощи LC/MS. Во всех масс-спектрах основным сигналом являлся пик (М+Н-28), соответствующий частице, образующейся в результате элиминирования молекулы азота в процессе анализа (см.табл.4.1,с.90). Наличие пиков "М+Н+2" в LC/MS спектрах азидов 2 и 4 указывало на наличие изотопов С1 и СІ в соотношении 3:1, что соответствовало природному изотопному соотношению. Бензилазиды 1-7 были выделены в виде светло-желтых жидкостей, которые использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Трехкомпонентную конденсацию азидов 1-7 с 2-цианацетамидом и эфирами карбоновых кислот алифатического ряда проводили в спирте в присутствии алкоголята натрия. В оригинальной методике синтеза 8-аза-пурин-6-онов авторы [3,4], проводя конденсацию в этаноле и метаноле, не достигли высоких выходов (20-40%). Изначально для получения 8-азагипо-ксантинов на примере соединений 9 и 13 мы проводили реакцию, руководствуясь этой методикой. Однако в обоих случаях была выделена смесь продукта с 5-амино-4-карбоксамидо-1,2,3-триазольным производным, отделиться от которого получалось только после нескольких перекристаллизации или переосаждения из горячего водно-щелочного раствора. Выходы целевых продуктов при этом не превышали 30%.
Увеличение времени проведения реакции до 12-ти и более часов не привело к ощутимому изменению выхода. Известно [46,47], что образование производных 1,2,3-триазола в качестве интермедиатов проходит сравнительно легко, в то время как для последующей циклизации требуются более жесткие температурные условия. Нами было исследовано влияние растворителя на выход продукта в результате конденсации. На примере соединений 9 и 13 было показано, что в более высоко кипящих растворителях (изопропанол, н-бутанол), реакция протекает с большими выходами (порядка 30-40%). Однако циклизация также не проходила до конца, и было необходимо очищать продукт от интермедиата. Введение в реакцию большого избытка натрия (5 экв.) неожиданно привело к желаемому результату: выделенный из реакционной смеси продукт по данным LC/MS практически не содержал 5-амино-1,2,3-триазола и после перекристаллизации из спирта выходы продуктов 9 и 13 составили 85% и 81%, соответственно. Мы отказались также от использования в качестве растворителя н-бутанола по причине его ограниченной смешиваемости с водой, что приводило к расслоению реакционной массы и затрудняло выделение продукта. Таким образом, в дальнейшем для синтеза исходных 8-азапурин-6-онов 8-21 мы проводили трехкомпонентную циклизацию в изо пропан оле с пятикратным избытком натрия. Выходы продуктов при этом, за исключением соединения 10, варьировались в пределах 60-80% (см.табл.4.2, с. 92), что значительно превышало таковые в оригинальной методике [3]. 3.1.2. Строение и физико-химические свойства 8-азапуринов-б-онов. Соединения 8-21 представляли собой кристаллические вещества светло-желтого цвета, хорошо растворимые в метаноле, диметилформамиде, водно-спиртовой щелочи; плохо - в апротонных растворителях (бензол, хлороформ). Исключение составило соединение 10, содержащее объемную третбутильную группу в положении 2, хорошо растворимое во всех перечисленных растворителях. Нами была прослежена зависимость температуры плавления от характера заместителя в положении 2 8-азапурин-6-она. В ряду соединений 8-10 температуры плавления уменьшаются от 248 до 152С при переходе от R=H к R=t-C4H9. В ряду заместителей Н- СН3- С2Н5 на примере соединений 12-14 наблюдали аналогичную закономерность, хотя в этом случае такого большого перепада температур не было (см.табл.4.2,с.92). Следует отметить, что температуры плавления соединений 8, 9, 11 и 12, уже описанных в работах [3, 47-48] точно совпадали с литературными данными. Соединения 10,13-20 были синтезированы и описаны впервые. Из литературных источников [91-92] известно, что пурины и 8-аза-пурины, содержащие окси-группу в положении 6, могут находиться в виде различных таутомерных форм: Соотношение форм зависит от свойств заместителя R, физического состояния вещества и индивидуально для каждой гетероциклической системы.
Синтез 6-замещенных 8-азапуринов
Синтезу 6-замещенных 8-азапуринов посвящено значительно меньшее количество работ, несмотря на то, что замещение окси-группы на галоген с последующим его замещением различными нуклеофилами является распространенным способом введения заместителей в гетероциклическую систему. 3.2.1. Синтез 6-хлор-8-азапуринов. Для получения 6-хлорпроизводных 8-азапуринов мы использовали два альтернативных метода, широко применяемых для получения хлор производных гетероциклов (схема 5). Первый способ заключался в продолжительном нагревании исходных 8-азапурин-б-онов 8-21 с РОС13 в присутствии ДІУ-диметиланилина в качестве катализатора, второй — в кипячении 8-азапурин-6-онов с SOC . Таким образом, все исходные 8-азапурин-6-оны 8-21 были переведены в соответствующие хлорпроизводные 50-63. Проведение реакции в РОС13 имело ряд недостатков. Во-первых, применение столь агрессивного реагента приводило к частичному осмоленню продукта, и даже при небольшом перегревании выход последнего падал до 10-20%. Во-вторых, при нейтрализации РОСІз, а именно выливании реакционной смеси на лед с последующей экстракцией дихлорметаном, уже при низких температурах имел место гидролиз продукта. По этой же причине пришлось отказаться от использования PCIj как еще более "жесткого" хлорирующего реагента. Даже небольшое нагревание реакционной смеси в толуоле или РОСЬ с РС1д приводило к осмоленню продукта. Использование SOCb в качестве хлорирующего агента позволило существенно увеличить выход продукта до 50-80% одновременно с уменьшением времени проведения синтеза. Этот способ позволил избежать контакта б-хлор-8-азапуринов с водой в процессе выделения, и время реакции (4-6 часов) в большей степени зависело от природы заместителей, влияющей на растворимость исходного соединения в хлористом тиониле. Хлорпроизводные 50-63 выделяли в виде масел, которые постепенно кристаллизовались. Соединения 50-63 очень неустойчивы, в присутствии влаги быстро гидролизуются, поэтому попытки регистрации ЯМР Н и масс-спектров приводили к регистрации сигналов преимущественно продуктов гидролиза (см.табл.4.4,с.99). В связи с этим, чистоту полученных соединений контролировали хроматографически, полупродукты 50-63 сразу использовали в дальнейших превращениях. 3.2.2. Синтез 6-аминозамещенных 8-азапуринов.
Способ синтеза 6-аминозамещенных 8-азапуринов по методу Траубе путем введения аминофункции на стадии пиримидина [25-28] крайне трудоемок и, как правило, малопригоден для широкого варьирования заместителей в положениях 2 и 6. Способы получения 6-аминозамещенных 8-азапуринов из 1,2,3-триазолов, предложенные в 1987г. итальянскими учеными [3], показали возможность введения аминофункции в положение 6 8-азапурина на конечной стадии. Тем не менее, анализ баз данных Beil stein выявил наличие всего лишь 45 соединений, содержащих в положении 6 такие тривиальные заместители, как аминогруппа, бензиламин, фенетиламин и др. Более того, синтез этих соединений был основан на термической конденсации 5-амино-4-карбоксамидо-1,2,3-триазолов с формамидом [48, 59-60], вследствие чего описанные соединения не содержали заместителей в положении 2. Из большого набора коммерчески доступных аминов мы выбрали те, которые наиболее часто прослеживаются в лекарственных препаратах в качестве фармакофорных фрагментов (например, морфолин, пиперазин, циклопропиламин и др.). В случае использования бензил- и фенетиламинов наиболее вероятным путем метаболизма замещенных 8-азапуринов является расщепление связи N-бензил (фенетил) не только в положении 9, но и в положении б, что приводит к образованию производных б-амино-8-азапурина (8-азааденина). Литературные данные [53,60] показывают, что некоторые 6,9-дибензил замещенные 8-азааденины обладают активностью по отношению к аденозиновым рецепторам, поэтому ряд аминов бензильного и фенетильного типа также был использован для эксперимента. Известно [48,60], что некоторые 6-ариламино-замещенные 8-азапурины обладают активностью в отношении аденозиновых рецепторов, различных типов киназ и др. Забегая вперед, отметим, что данные виртуального скрининга показали наличие гипотетической активности по отношению к киназам, дофаминовым рецепторам и другим представителям рецепторов семейства GPCR. В результате просмотра баз данных ACD и Beilstein нами было обнаружено, что все замещенные в положении 6 такими аминами 8-азапурины не описаны в литературе. На с.54 приведена схема синтеза и описание продуктов реакции. Нуклеоф ильное замещение атома хлора в молекуле 8-азапурина в зависимости от природы амина проводили по двум методикам. С различными алифатическими аминами, как первичными, так и вторичными, нуклеофильность которых значительно выше, чем у анилинов, реакция достаточно энергично проходила в этаноле в присутствии триэтил амина уже при комнатной температуре. Использование в качестве растворителя ДМФА и ацетонитрила не повлияло ни на ход реакции, ни на выход продуктов, которые достигали 40-80% (см.табл.4.5,с.Ю6). С анилинами реакцию проводили в диметилформамиде с добавлением К2С03 при слабом нагревании (70-80С). Мы исследовали также возможность нуклеофильного замещения хлора гидразином и аммиаком.
В этих случаях конкурентной реакцией являлся гидролиз: выделить индивидуальные соединения удалось только после двух перекристаллизации из спирта, что отразилось на выходе целевых продуктов (порядка 20%). Дж. Бьяджи и соавторы [77] столкнулись с той же проблемой при синтезе 6-гидразинпроизводных 8-азапуринов, но, несмотря на попытки использования перегнанного над щелочью гидразина, содержащего не более 2% воды, так и не смогли достичь высоких выходов (менее 20%). В целом, при синтезе 6-аминозамещенных 8-азапуринов не возникло каких-либо аномалий, выделенные продукты в большинстве случаев представляли собой объемные ватообразные вещества в виде длинных игольчатых кристаллов. Таким образом, нами был разработан удобный метод синтеза 6-аминозамещенных 8-азапуринов, содержащих в положении 9 заместитель бензильного типа, а в положении 2 - алкил. 3.2.3. Проблема изомерии 6-а ми незамещенных 8-азапуринов. н A Общеизвестно [93-98], что амино-иминная таутомерия характерна для аминозамещенных гетероциклических систем. Особенно наглядно она проявляется в 2-аминозамещенных пиридинах [93]. Авторами [93, 98] отмечено, что равновесие сильно зависит от природы заместителя (амина) и сольватирующих свойств растворителя. В системе 8-азапурина также можно В настоящей работе мы специально изучили данную проблему и выяснили детальную структуру 6-аминопроизводных 8-азапуринов. Для установления структуры были рассмотрены ЯМР спектры 8-азапуринов, содержащих в положении 6 заместители трех типов: ариламино-, алкиламино- а также свободную NH2- группу. Анализ ЯМР!Н спектров соединений, содержащих в положении 6 NH-группу, показал интересную закономерность. В спектрах алкиламино- замещенных 8-азапуринов (65,67-69,72-74) сигнал протона NH-группы в слабом поле (8-9 м.д.) представлял собой суперпозицию двух уширенных пиков. Следует отметить, что с таким необычным спектральным поведением столкнулись и итальянские авторы при изучении некоторых производных 8-азапуринов [2], однако объяснение этого факта не было предложено. Известно [123], что связь N-гетарил в структуре А аналогична амидной связи N-C(O), вращение вокруг которой заторможено, вследствие чего протоны двух конформеров неэквивалентны и обладают различным спектральным поведением. Альтернативным объяснением может являться наличие син-анти изомерии относительно двойной связи в структурах В и С. В случае присутствия -CH2NH- фрагмента сигналы протона NH-группы расщеплялись в виде двух триплетов с соотношением интегралов 1:2:1, причем интегральная интенсивность триплета в слабом поле была выше. С другой стороны, сигналы СН2- протонов в «-положении к аминогруппе во фрагменте RCH2NH в соединениях 67,69,71,73 неизменно представляли собой суперпозицию двух уширенных триплетов.
Биологические свойства 8-азапуринов
Важным этапом нашей работы являлся виртуальный скрининг замещенных 8-азапуринов с целью выявления потенциально активных соединений и постановки синтетической задачи. Литературные данные биологических испытаний [105-109] указывают на широкий спектр активности пуринов и 8-азапуринов по отношению к киназам, NO-синте-тазам, а также к семейству рецепторов, ассоциированных с G-белком (GPCR). 3.4.1.1. Применение методов компьютерного моделирования для виртуального скрининга. Совместно с лабораторией компьютерного моделирования компании "Asinex" было реализовано два подхода к поиску так называемых Drug-like molecules. Первый метод (Structure-Based Method) [126,127] основан на моделировании структурного и пространственного соответствия виртуальных соединений активным центрам белка, при этом структура биологической мишени (молекулы белка) должна быть достоверно известна. Второй подход (Ligand-Based Method) [109,128], основанный на структурном сходстве виртуальных соединений с уже известными лекарствами или их фармакофорными фрагментами, использовали для предсказания связывания с рецепторами G-белков, структура которых неизвестна. Первоначально нами была представлена комбинаторная база соединений размером около 10000 структур, синтетически воспроизводимая из коммерчески доступных реагентов. Далее для обработки баз вводили так называемые дескрипторы - характеристики структуры, позволяющие выделить наиболее перспективные соединения. В качестве основного критерия отбора мы выбрали эмпирическое "правило пяти", введенное Липински [129], согласно которому все потенциально активные соединения должны удовлетворять следующим условиям: 1. молекулярный вес 500 2. количество доноров протонов 5 3. количество акцепторов протонов 10 4. расчетный logP 5, где Р - липофильность молекулы (коэффициент разделения в системе вода-н-октанол) Расчет статистических параметров мы проводили с помощью программы FlexX. Результат был оформлен в виде электронных таблиц с количественной характеристикой дескрипторов (см. приложение 13). Немецкие авторы [109] отмечают, что невыполнение двух из этих условий является показателем низкой сорбируемости вещества и его неспособности связываться с рецептором. Кроме основных критериев мы использовали наборы второстепенных дескрипторов, такие как водорастворимость (logSw), число атомов N+0, двумерные и трехмерные размеры кластера, число свободно вращающихся связей, рКа и другие (всего использовали 14 дескрипторов).
Такого рода дескрипторы уже были апробированы в международной практике [109,128] на многих биологических мишенях и показали свою обоснованность. Статистические исследования показали, что вероятность положительного предсказания определенного вида активности в случайно выбранной базе составляет доли процента, в то время как наложение дескрипторов повышает вероятность на несколько порядков [109]. Таким образом, из гипотетической библиотеки соединений нами была отобрана база (Targeted Library) размером примерно в 500 структур. 3.4.1.3. 8-Азапурины - потенциальные ингибиторы киназ. Анализ литературы показал, что многие 8-азапурины проявляют киназную активность [109]. В частности, одними из наиболее распространенных объектов исследования являются серин-треониновые и тирозиновые киназы [109,126-129]. В качестве объектов для виртуального скрининга мы использовали 6 различных подтипов тирозиновых и 5 подтипов серин-треониновых киназ, информацию о структуре которых импортировали из электронной базы данных рентгеноструктурного анализа белковых молекул , содержащей 25115 структур по состоянию на 13.04.04. Следующим этапом являлся процесс докинга (docking) с использованием лицензионной программы SIBYL 6,9. Он заключался в виртуальной подстановке различных структур в область активного центра белка и определении оптимальной конформации, отвечающей минимуму потенциальной энергии при взаимодействии с активным центром (с учетом донорно-акцепторных и гидрофильно-гидрофобных взаимодействий). Графический результат докинга гипотетической структуры наглядно представлен на рисунке 1 (с.84). Значения энергии связывания (в относительных единицах) получали в виде таблиц (см. приложение 14). Было обнаружено, что практически все представленные к рассмотрению соединения гипотетически активны в отношении киназ. Представители рецепторов класса GPCR (рецепторов, ассоциированных с G-белком) играют важную роль во многих физиологических и патологических процессах в организме человека [109,110]. С тех пор как в рамках программы "Геном человека" было детерминировано несколько сотен новых генетических аллелей этого класса рецепторов, появились широкие возможности для развития и совершенствования терапевтических методов регулирования данных процессов. Природные лиганды рецепторов GPCR чрезвычайно разнообразны [109] и включают в себя олигопептиды (ангиотензин, брадикинин), кортикостероиды, биогенные амины (адреналин, дофамин, гнетами н, серотонин), нуклеозиды, их ди- и трифосфаты и нуклеотиды (аденозин, ATP, уридинтрифосфат (UTP), ADP), эйкозаноиды (лейкотриены, простагландины, тромбоксаны) и другие (глутамат, Са2+-ионы). Нашей задачей являлся виртуальный скрининг целевых продуктов на наличие различных видов GPCR-активности и биологические испытания in vitro потенциально активных соединений. Поскольку структура большинства рецепторов GPCR достоверно не определена, использовали широко известный метод Ligand-Based Design [109]. С этой целью мы проводили поиск структур, обладающих активностью к определенным GPCR- мишеням, в доступных электронных базах Belstein, MDDR и CMC. В качестве стандарта использовали базу примерно из 10000 соединений с известной активностью к дофаминовым, серотониновым и аденозиновым рецепторам.
На основе данных об этих соединениях была сконструирована модель, с которой мы проводили сравнение исследуемых молекул. Объектом наших исследований являлись 4 подтипа дофаминовых рецепторов (D1-D4), 2 подтипа серотониновых (5-HTj и 5-НТ2) и 3 - аденозиновых (А]-А3), а также ряд опиоидных и других рецепторов (всего 8 типов и 16 подтипов). Результаты виртуального биоскрининга некоторых наиболее перспективных соединений представлены в табл.3.4. Следующим этапом биологических исследований явились тесты некоторых 6-аминозамещенных 8-азапуринов на активность по отношению к киназам, а также к дофаминовым и серотониновым рецепторам in vitro, проводимые в научной лаборатории AsinexBioLabs . Для этих целей использовали коммерчески доступный материал, представляющий собой лиофилизированную мембрану клетки с определенным типом рецептора. В качестве стандарта сравнения использовали радиол иганд с тритиевои меткой [3Н]-8-ОН-ОРАТ(8-гидрокси-2-(ди-н-пропиламино)тетралин). Совместно с к.х.н. Афанасьевым И.С. Первоначально количественно определяли связывание с рецептором стандартного лиганда, а затем смеси исследуемого вещества и стандартного лиганда. Происходило конкурентное связывание с активным центром рецептора (ингибирование связывания стандартного лиганда исследуемым веществом), степень которого определяли по остаточному содержанию з несвязанного лиганда [ HJ-8-OH-DPAT. Таким образом, был вычислен параметр 1С5о, отражающий концентрацию вещества, обеспечивающую 50%-ное связывание. Данные биологических испытаний, проведенных для некоторых 6-аминозамещенных 8-азапуринов, приведены в таблице 3.5. Полученные нами результаты показали возможность связывания некоторых 8-азапуринов, содержащих в положении 6 фенетиламиногруппу, с серотониновыми рецепторами на уровне концентраций 2-20 мкМ. Низкие показатели активности по отношению к серотониновым рецепторам определены для 6-анилинозамещенных 8-азапуринов 75 (1С5о 200мкМ) и 79 (1С5о 150мкМ). В настоящее время на стадии биотестирования находятся все полученные соединения. Таким образом, синтезированные нами новые 8-азапурины являются перспективными объектами для биологических исследований, в том числе по отношению к аденозиновым, дофаминовым и серотониновым рецепторам.
