Олиго(2`-O-метилрибонуклеотиды), содержащие терминальную 3`-3`-межнуклеотидную связь, и их конъюгаты: синтез и свойства Новопашина Дарья Сергеевна

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7
Глава 1. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕН! IE КОНЪЮГАТОВ ОЛИГО(2'-0-
МЕТИЛРИБОНУКЛЕОТИДОВ) (Обзор литературы)

2'-0-Метилрибонуклеотиды - минорный компонент природных РНК 10

Свойства олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) 11

Конформация рибозы в олиго(2'-0-метилрибонуклеотидах) и их 12

дуплексах

Стабильность комплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с НК 13

Стабильность дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с ДНК 14

и РНК

1.2.2.2. Стабильность триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 15
дцДНК

1.2.2.3. Квадруплексы с участием олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) 16
1.2.3. Устойчивость олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) к действию 18

нуклеаз

1.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) 19

1.3.1. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с репортерными 21
группировками

1. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с биотином 21

2. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с флуоресцентными 24 группировками

2. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) со стероидами 28

3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 33 интеркалирующими группировками

4. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 36 реакциошюспособными группировками

1. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с алкилирующими 36 группировками

2. Конъюгаты олпго(2'-0-мегилрибонуклеотидов) с 37 фотореакционноспособными группировками

5. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с пептидами 39

6. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с комплексами 43 металлов

7. Радиоактивно меченые конъюгаты олиго(2'-0- 47 метилрибонуклеотидов)

1.4. Применение олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их конъюгатов 48

1. Аффинная хроматография РНК и РНК-белковых комплексов 49

2. Изучение и регуляция процессов сплайсинга 50

3. Локализация РНК в клетке 52

4. Изучение пространственной структуры РНК 57

5. Ингибирование экспрессии генов 59

6. Антисенс-подход 60

7. Антиген-подход 63

8. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) как эффекторы при воздействии 63 на структурированные РНК

6. Изучение механизма действия микроРНК и siPHK 64

7. Конструирование функциональных НК с использованием 2'-0- 65 метилрибонуклеозидов

Глава 2. 0ЛИГ0(2'-0-МЕТИЛРИБ0НУКЛЕ0ТИДЬ1), СОДЕРЖАЩИЕ ТЕРМИНАЛЬНУЮ З'-З'-МЕЖНУКЛЕОТИДНУЮ СВЯЗЬ, И ИХ КОНЪЮГАТЫ: СИНТЕЗ И СВОЙСТВА (Результаты и обсуждение)

2.1. Синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих 68
терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

1. Получение полимерных носителей с присоединенными 3'- 69 диметокситритил дезоксирибонуклеозидами

2. Твердофазный синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 71 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

2. Исследование устойчивости олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 77 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, к действию нуклеаз

3. Изучение структуры и стабильности комплексов олиго(2'-0- 80 метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с нуклеиновыми кислотами

1. Структура и стабильность дуплексов олиго(2'-0- 81 метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

2. Стабильность триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 95 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с двуцепочечной ДНК

4. Синтез и изучение свойств «химерных» 2'-0- 98 метилрибо/дезоксирибо-олигонуклеотидов, содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

5. Синтез и изучение свойств конъюгатов олиго(2'-0- 103 метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

2.5.1. Фотоактивируемые конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и 103
их 3'-«инвертированных» аналогов

1. Синтез фотоактивируемых конъюгатов олиго(2'-0- 104 метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов

2. Свойства фотоактивируемых конъюгатов олиго(2'-0- ПО метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов

2.5.2. Синтез и свойства 5'-пиренилметилфосфамидных и 5'-бис- 118
пиренилметилфосфодиамидных конъюгатов олиго(2'-0-
метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-
межнуклеозидную фосфодиэфирную связь

3. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'- 119 «инвертированных» аналогов с пиреном

4. Свойства 5'-пирснильных конъюгатов олиго(2'-0- 124 метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов

2.5.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'- 133
«инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки: дизайн,
синтез и изучение свойств

5. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклсотидов) и их 3'- 134 «инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки

6. Стабильность триплексов конъюгатов олиго(2'-0- 141 метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки с дцДНК

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

7. Исходные материалы 148

8. Основные методы работы 150

9. Методики эксперимента 156 ВЫВОДЫ 172 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 174

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и международного союза биохимиков (ШВ), а также следующие обозначения:

В - гетероциклическое основание нуклеозида или нуклеотида р - концевой фосфат N^m - 2'-0-метилированный нуклеозид

i_nvA - дезоксирибоаденозин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью

;_nvT - тимидин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью

i_nvG - дезоксирибогуанозин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью

i„_vC - дезоксирибоцитидин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью Me - метил Тг -тритил

МеОТг - монометокситритил (МеО^Тг - диметокситритил bz - бензоил ibu — изобутирил Ас - ацетил

Fmoc- Ы-(9-фторметил)оксикарбонил Im - имидазол НК - нуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклсиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота (2'-0-метил)РНК - 2'-0-метилированная РНК siPHK - малая интерферирующая РНК ТФО - триплексформирующие олигонуклеотиды ТСХ - тонкослойная хроматография

офВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ - полиакриламидный гель

УФ - ультрафиолетовое излучение

FRET - резонансный перенос флуоресцентной энергии (Fluorescence Resonance Energy

Transfer)

ЛМБ - лиганд малой бороздки

Ах. - оптическое поглощение раствора на длине волны А,

Т_пл - температура плавления комплементарного комплекса

КД - круговой дихроизм

ед. акт. - единица активности фермента

ФДЭ - фосфодиэстераза

BSA - бычий сывороточный альбумин

PivCl - пивалоилхлорид

TPS - 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид

TEA - триэтиламин

N-Melm - N-метилимидазол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

Трис — трис(оксиметил)аминометан

ТЕААс - ацетат триэтиламмония

SDS - додецилсульфат натрия

MES - 2-(Н-морфолин)-этансульфоновая кислота

HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этансульфоновая кислота

Ру - пиридин

DMFA - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

THF - тетрагидрофуран

B1Q - 6-[(3-аминопропил)амино]-10-амино-13Н-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин

DMAP - 4-М,]Ч'-диметиламиноггиридин

РРпз - трифенилфосфин

(PyS): - 2,2'-дипиридилдисульфид

ВР - бромфеноловый синий

МПС - макропористое стекло

CPG - стекло с контролируемым размером пор

Введение к работе

Синтетические олигонуклеотиды, их аналоги и производные рассматриваются в настоящее время как высокоселсктивные инструменты для изучения молекулярно-биологических процессов, а также как перспективные терапевтические средства для лечения вирусных, онкологических и наследственных заболеваний. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) обладают рядом достоинств, полезных для создания реагентов, направленных на РНК и дцДНК: повышенным сродством к РНК, высокой скоростью комплексообразования с РНК-мишенями, способностью образовывать прочные триплексы с дцДНК [ 1 ], стабильностью к ДНК и РНК специфическим эндонуклеазам [ 2 ], способностью эффективно дискриминировать мисматчи [3], а также простотой синтеза [4] и низкой токсичностью [5]. Для решения задач современной молекулярной биологии необходимо создание конъюгатов олигонуклеотидов с различными группировками, обладающими рядом уникальных свойств. Конъюгирование олигонуклеотидов позволяет модулировать их биосовмесгимость, коплексообразующие свойства, устойчивость к действию нуклеаз, токсичность, фармакокинетические свойства, способность проникать в клетки, сродство к определенному типу клеток, способность расщеплять и/или модифицировать НК и др. Конструкции на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) используются для выяснения функций определенных генов и некодирующих малых P1IK [6, 7], регуляции экспрессии генов путем воздействия на уровне мРНК, микроРНК и геномной ДНК [8,9, 10], детекции НК in vitro и in vivo [11, 12], определения мутаций [3, 12], а также для решения ряда других задач молекулярной биологии, бпонанотехнологии и медицины.

Однако, обладая устойчивостью к действию эндонуклеаз, олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) являются уязвимыми к действию экзонуклеаз. Ранее Веньяминовой А.Г. с соавт. [ 13 ] было показано, что введение в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) З'-концевого тимидина посредством З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связи делает их устойчивыми и к действию З'-экзонуклеаз.

Целью данной работы являлся синтез и изучение свойств олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеотидную связь, и создание на их основе реакционноспособных, триплексформирующих и флуоресцентных конъюгатов как перспективных зондов и реагенюв для использования в антисмысловой и антигенной биотехнологиях.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- синтез и изучение физико-химических и биологических свойств олиго(2'-0-меишрибонуклеотидов), содержащих на З'-конце дезоксирибонуклеозиды

(дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин или тимидин), присоединенные З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью;

- создание на основе 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) новых конъюгатов с реакдионноспособными и флуоресцентными группировками, а также с лигандами малой бороздки, и изучение их свойств на модельных системах.

Можно ожидать, что сочетание двух минимальных модификаций, а именно, замена 2'-гидроксила рибозы на 2'-0-метильную группу и «инверсия» З'-концевой межнуклеозидной фосфодиэфирной связи позволит создать универсальную платформу для конструирования широкого спектра конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), направленных на решение ряда задач в области молекулярной биологии, диагностики и терапии.

Похожие диссертации на Олиго(2`-O-метилрибонуклеотиды), содержащие терминальную 3`-3`-межнуклеотидную связь, и их конъюгаты: синтез и свойства

Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинамиЧерноносов Александр Анатольевич

Конъюгаты моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с соединениями, содержащими функциональные группы природных аминокислот: синтез и исследование свойствСерпокрылова, Инна Юрьевна

Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондовАстахова Ирина Владимировна

Синтез и изучение свойств пептидных антигенов 2 - гликопротеина-IПалькеева, Марина Евгеньевна

Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойстваХомякова, Елена Алексеевна

Олиго(2'-о-метилрибонуклеотиды) и их производные: синтез и свойстваСергеева, Зинаида Александровна

Синтез и спектральные свойства олигонуклеиновых конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцетных красителейДюбанкова Наталья Николаевна

Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцентных красителей Дюбанкова Наталья Николаевна

Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцентных красителейДюбанкова Наталья Николаевна

Синтез, свойства и биологическая активность аминоакридиновСувейздис, Ян Иванович