Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к конструированию реагентов, направленных на воздействие на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов. За последние десятилетия достигнут значительный прогресс в олигонуклеотидном синтезе, что делает получение синтетических нуклеиновых кислот с широким спектром модификаций рутинной процедурой. Однако синтез конъюгатов олигонуклеотидов с молекулами, содержащими различные реакционноспособные группы, по-прежнему представляет сложную научную задачу, зачастую требующую в каждом конкретном случае поиска индивидуального решения. В настоящее время для получения таких конъюгатов преимущественно используют две принципиально разные стратегии, основанные на модификациях олигонуклеотидов во время (пресинтетическая модификация) и после (постсинтетическая модификация) олигонуклеотидного синтеза. Наибольшее распространение получила первая стратегия, подразумевающая предварительный синтез соответствующих амидофосфитов. Однако в случае молекул, содержащих различные функциональные группы, синтез таких амидофосфитов превращается в специальную задачу, решение которой требует значительных усилий. Постсинтетическая модификация является более привлекательной, поскольку не требует получения соответствующих амидофосфитов и позволяет получать серии конъюгатов на основе одного базового олигонуклеотида-предшественника.
Наиболее удачным примером постсинтетической модификации является метод, основанный на активации 5'- или 3'- концевых фосфатов с последующим либо прямым введением молекул, содержащих алифатические аминогруппы, либо с промежуточным введением линкерных групп на основе алифатических диаминов (В. Зарытова с сотр., 1989 г). Данный подход получил широкое распространение, однако в случае получения конъюгатов олигонуклеотидов с короткими пептидами или пептидоподобными молекулами, содержащими остатки гистидина, этот метод оказался неприемлемым, в основном из-за низких выходов и невоспроизводимости результатов синтеза.
Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время разработан целый ряд подходов, позволяющих получать конъюгаты олигонуклеотидов с различными лигандами, синтез олигонуклеотидных производных с молекулами, содержащими несколько функциональных групп (в первую очередь, остатки имидазола), по-прежнему остается актуальной задачей.
Целью данной работы являлась разработка стратегии и методов синтеза конъюгатов моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с соединениями,
содержащими алифатические аминогруппы и функциональные группы боковых радикалов природных аминокислот.
В ходе исследования решались следующие задачи:
1. Изучение возможностей метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидных
конъюгатов с молекулами, имеющими в своем составе алифатические
аминогруппы и остатки имидазола, путем активации концевого фосфата парой
Ph3P/(PyS)2 в присутствии нуклеофильных катализаторов:
изучение взаимодействия активированных фосфатных групп в монодезоксирибонуклеотидах с гистамином, карцинином и его аналогами;
исследование стабильности фосфамидной связи в зависимости от структуры полученных соединений.
2. Разработка протоколов твердофазного синтеза олигонуклеотидных
производных с использованием амидофосфитов, содержащих прекурсорные
группы на основе слабоактивированных эфиров (монометиловые и
моноцианметиловые эфиры моноамидов дикарбоновых кислот):
оптимизация метода получения олигодезоксирибонуклеотидов-предшественников в зависимости от числа и места расположения прекурсорных групп, температуры, времени конденсации, катализатора;
синтез конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с низкомолекулярными лигандами, содержащими первичные алифатические аминогруппы.
3. Разработка новых методов получения олигодезоксирибонуклеотидных
конъюгатов с использованием оригинальных прекурсорных групп на основе
полициклических ароматических соединений:
конструирование и синтез новых прекурсорных групп на основе феназина и антрацена. Получение олигодезоксирибонуклеотидных производных, несущих в своей структуре прекурсорные группы на их основе;
синтез конъюгатов пептидов с олигодезоксирибонуклеотидными производными путем взаимодействия прекурсорной группы на основе феназина с алифатической аминогруппой пептида;
синтез пептид-олигодезоксирибонуклеотидных конъюгатов путем взаимодействия прекурсорной группы на основе антрацена с остатком малеимида, предварительно присоединенного к пептиду.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной работы, на примере полученных конъюгатов монодезоксирибонуклеотидов с природным дипептидом карцинином и его аналогами, было продемонстрировано, что фосфамидная связь в конъюгатах нуклеотидов с молекулами, содержащими остатки гистамина, неустойчива при нейтральных значениях рН. Впервые было показало, что устойчивость связей в группе -0-P(0)2-NH-, объединяющей мононуклеотидную и пептидную части
конъюгата, зависит от природы гетероциклического основания нуклеотида и падает в ряду dTMP>dCMP>dAMP.
Разработаны методы автоматического синтеза олигодезоксирибонуклео-тидов, содержащих различное число прекурсорных групп на основе слабо активированных эфиров. С их использованием получены серии олигонуклеотидных производных, имеющих различное количество групп-предшественников на 5'-конце, а также олигонуклеотиды, содержащие прекурсорные группы внутри олигонуклеотидной цепи. На основе синтезированных производных олигонуклеотидов были предложены и опробованы методы твердофазного синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с различным числом остатков гистамина.
Впервые предложены прекурсорные группы на основе бисчетвертичных солей феназиния, позволяющие получать олигодезоксирибонуклеотидные конъюгаты с лигандами, содержащими алифатические аминогруппы в присутствие других функциональных групп (-ОН, -имидазольная и др.). Метод не требует какой-либо активации обеих компонентов и позволяет следить за образованием конъюгатов по изменению электронного спектра поглощения в видимом диапазоне.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты были представлены на международных конференциях "RNA as Therapeutic and Genomic Target", (Новосибирск, Россия, 2001), "Chemical probes in biology" (Греция, 2002), XV International Round Table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Бельгия, 2002), 7th Young Scientist Forum: "Molecular Networks" и 32nd FEBS Congress "Molecular Machines" (Австрия, 2007), IV Конгресс Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 18th International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids and 35th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (Япония, 2008), 34th FEBS Congress: "Life's Molecular Interactions" (Чешская Республика, 2009) и др. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 130 страницах, содержит 65 рисунков и 6 таблиц. Библиография включает 283 литературных источника.
