Содержание к диссертации
Введение
1. Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами - реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот 9
1.1. Механизмы образования активных форм кислорода 10
1.1.1. Каталитическая активация молекулы кислорода 10
1.1.2. Образование активных комплексов с ионами переходных металлов 13
1.1.3. Механизм образования синглетного кислорода 15
1.1.3.1. Фотосенсибилизаторы на основе порфирина и его аналогов 17
1.2. Реагенты для окислительной модификации нуклеиновых кислот на основе конъюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами 21
1.2.1. Производные олигонуклеотидов с группами, способными сенсибилизировать образование синглетного молекулярного кислорода 22
1.2.1.1. Порфирины 23
1.2.1.2. Хлорины 29
1.2.1.3. Тексафирин и сапфирин 31
1.2.2. Производные олигонуклеотидов с группами каталитически активными в условиях окисления нуклеиновых кислот молекулярным кислородом и пероксидом водорода 34
1.2.2.1. Порфирины 34
1.2.2.2. Корриновый комплекс кобальта(П) 47
1.2.2.3. Тексафирин диспрозия(Ш) 49
1.3. Заключение 52
2. Экспериментальная часть 53
3. Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами: синтез, термодинамические свойства и реакционная способность 60
3.1. Синтез конъюгатов фталоцианинов с олигонуклеотидами 60
3.1.1. Строение фталоцианинов и олигонуклеотидов, используемых в синтезе конъюгатов 61
3.1.2. Синтез конъюгатов в растворе 62
3.1.3. Синтез конъюгатов на твердом носителе 64
3.1.4. Анализ электронных спектров полученных соединений 67
3.1.5. Анализ масс-спектров полученных соединений 69
3.1.6. Определение молярного коэффициента поглощения остатка фталоцианина кобальта(Н) в составе конъюгата 70
3.2. Изучение комплексообразования конъюгата олигонуклеотида с фталоцианином кобальта(П) с различными структурами ДНК методами кругового дихроизма и термической денатурации 71
3.2.1. Комплексообразование с одноцепочечными ДІЖ 72
3.2.2. Комплексообразование с двухцепочечными ДНК 75
3.2.3. Комплексообразование с трехцепочечными ДНК 80
3.3. Исследование способности конъюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами вызывать селективную модификацию ДНК 83
3.3.1. Каталитическая модификация ДНК 84
3.3.1.1. Изучение химической стабильности остатка фталоцианина кобальта(ІІ) в условиях проведения окислительной модификации ДНК 85
3.3.1.2. Оптимизация условий проведения реакции каталитической модификации 87
3.3.1.3. Модификация ДНК-мишени в составе двухдепочечного комплекса 96
3.3.1.4. Модификация модельного олигонуклеотида-мишени в составе трехцепочечного комплекса ДНК 99
3.3.1.5. Модификация модельного олигонуклеотида-мишени в составе четырехцепочечного комплекса ДНК 100
3.3.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНК 101
3.3.2.1. Модификация при облучении светом ртутной лампы 101
3.3.2.2. Модификация при облучении светом гелий-неонового лазера 104
Заключение 107
Выводы 110
- Реагенты для окислительной модификации нуклеиновых кислот на основе конъюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами
- Корриновый комплекс кобальта(П)
- Изучение комплексообразования конъюгата олигонуклеотида с фталоцианином кобальта(П) с различными структурами ДНК методами кругового дихроизма и термической денатурации
- Модификация ДНК-мишени в составе двухдепочечного комплекса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание реагентов, способных направленно
модифицировать нуклеиновые кислоты, является одной из важнейших задач
физико-химической биологии. Среди таких реагентов широко исследуются
производные олигонуклеотидов, содержащие реакционноспособные группы.
Особый интерес представляют фотоактивируемые и каталитически активные группы, способные многократно воздействовать на биомолекулы. К таким группам относятся синтетические аналоги порфиринов - фталоциани-ны (тетрабензотетраазапорфирины).
Фталоцианины и их комплексы с ионами диамагнитных металлов (Zn(II), А1(Ш), Pd(II) и др.) могут возбуждаться длинноволновым светом и сенсибилизировать генерацию синглетного молекулярного кислорода '02. В тоже время, комплексы фталоцианинов с ионами переходных металлов (Со(П), Fe(II), Mn(II) и др.) способны катализировать возникновение свободных и координированных радикалов кислорода о:2 и *ОН при
взаимодействии с Ог, Н2Ог и другими окислителями. Все эти активные формы кислорода могут вызывать окислительную деструкцию нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы являлась разработка методов синтеза конъю-гатов фталоцианинов с олигодезоксирибонуклеотидами, изучение термодинамических характеристик их взаимодействия с ДНК, а также исследование их способности выступать реагентами для направленной каталитической или сенсибилизированной окислительной модификации ДНК.
Научная новизна в практическая ценность. Впервые синтезированы конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с фталоцианинами А1(Ш) и Zn(IT) как в растворе, так и на твердом носителе, а также с фталоцианином Со(П) на твердом носителе. Методами спектроскопии кругового дихроизма и термической денатурации исследовано влияние остатка фталоцианина на образование дуплексов, триплексов и тетраплексов; впервые получены термодинамические параметры образования дуплексов и триплексов, содержащих остаток фталоцианина. Показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианином Со(П) селективно модифицируют модельные ДНК-мишени в темновых условиях, а конъюгаты с фталоцианинами А1(Ш) и Zn(II) - при облучении светом ртутной лампы или гелий-неонового лазера.
Полученные данные свидетельствуют о том, что конъюгаты олигонукле-
отидов с фталоцианинами Со(ІГ), А1
III) и Zn(II) могут быть использованы в
РОС. НАЦИОНАЛЬ-
СПе 8
качестве реагентов для направленной модификации ДНК в темновых условиях и при облучении светом, а также могут найти практическое применение в антисенс- и антиген- подходах к регуляции экспрессии генов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на III Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002 г.; Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, 2005 г.; международных конференциях: «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference», Новосибирск, 2003 г.; 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference «The Protein World. Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization», Будапешт, Венгрия, 2005 г.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 47 рисунков, 26 схем и 17 таблиц. Библиография включает 156 литературных источников.
Реагенты для окислительной модификации нуклеиновых кислот на основе конъюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами
Созданию терапевтических препаратов селективного действия на основе олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособпые группы, посвящено большое число исследований (см., например, обзоры [2, 74-76]). Олигонуклеотиды, представляющие собой синтетические фрагменты нуклеиновых кислот, обладают уникальной способностью образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми кислотами за счет комплементарных взаимодействий между гетероциклическими основаниями. Благодаря этой способности можно создавать препараты для направленного воздействия на генетические структуры. Для повышения эффективности действия олигонуклеотидов к ним можно присоединять химические группы, необратимо модифицирующие нуклеиновую кислоту вблизи участка связывания олигонуклеотида [1]. По этой причине олигонуклеотиды, их производные, содержащие химические группы различной природы, а также аналоги олигонуклеотидов широко исследуются как возможные противовирусные и противоопухолевые препараты для подавления экспрессии генов [77-79]. Среди химически активных групп представляют интерес соединения порфиринов и их аналогов как в форме металлокомплексов, так и не содержащие ионов металлов. Они обладают широким спектром полезных свойств: І) некоторые типы порфиринов обладают высоким сродством к нуклеиновым кислотам [80]; 2) в отличие от большинства металлокомплексов, генерирующих свободные гидроксильные радикалы, которые свободно диффундируют в раствор, в металлопорфиринах активные кислородные частицы могут не выходить из координационной сферы металлокомплекса [81], что может приводить к высокоселективной модификации нуклеиновых кислот; 3) порфириновые группы нетоксичны для живых организмов и способны эффективно проникать в клетки [82] и, вероятно, могут способствовать проникновению в клетки олигонуклеотидных производных. И, как уже упоминалось ранее, металлокомплексы порфиринов и их аналогов способны, в зависимости от координирующего металла, генерировать образование АФК по различным механизмам. 1.2.1. Производные олигонуклеотидов с группами, способными сенсибилизировать образование синглетиого молекулярного кислорода Свободные порфирины и их аналоги уже используются в фотодинамической терапии — методе лечения онкологических заболеваний [66]. Основой ФДТ служит способность реагентов локализоваться в опухолях и разрушать их под действием света.
В отличие от радиационной и химиотерапии, ФДТ обладает незначительной мутагенностью. За исключением высокой светочувствительности кожи в первый период после курса лечения этот метод не имеет тяжелых побочных эффектов. В настоящее время он разрешен к применению во многих странах и продолжает интенсивно развиваться. Развитие метода ФДТ направлено как на улучшение фотофизических характеристик сенсибилизаторов, так и на повышение селективности и эффективности их действия на опухолевые клетки. Улучшение фотофизических свойств сенсибилизаторов заключается в поиске соединений, обладающих поглощением в более длинноволновой части спектра видимого света, чем порфирины, то есть в области 600-700 нм и выше. Увеличение селективности и эффективности достигается присоединением фотосенсибилизаторов к каким-либо векторам, например, остаткам Сахаров, стероидов, специфических транспортных белков и др. [83-87], способствующим их накоплению опухолевыми клетками и направляющим их действие на определенные клеточные мишени. Это расширяет возможности метода ФДТ и уменьшает светотоксичность препаратов. 1.2.1.1. Порфнрины Интерес к порфиринам, как активным группировкам в производных одигонуклеотидов, возник давно. Это было связано с тем, что порфирины могут служить сенсибилизаторами для фотогенерации синглетного молекулярного кислорода Ог по механизму фотопроцесса типа II. При взаимодействии синглетного кислорода с ДНК в основном в реакцию вступают гуанины, приводя к различным продуктам окисления (Рис. 7) [88, 89]. Кроме того, возможно протекание прямой реакции возбужденного порфирипа с нуклеиновой кислотой [90]. Первое фотоактивируемое производное олигонуклеотида на основе порфирина описано в работе [91]. В этой работе авторы проводили двухстадийный синтез 17-звенного олигонуклеотида pCTTAGTTCTGGGTGCC (Ol ) с Pd(II)-копропорфирином I для получения конъюгата К1. Для исследования модификации мишени GGCACCCAGAACTAAGAATGAAGGTGGAGAGGT (Ml) реагентом (Kl) в составе комплекса Д1 проводили облучение растворов светом ртутной лампы высокого давления в области спектра 330-410 нм.
Было показано, что между мишенью и реагентом образуются ковалентные сшивки, которые после обработки 1 М пиперидином дают продукты расщепления олигонуклеотида-мишени преимущественно по основанию G и, в меньшей степени, по Т16. Положение модифицированных нуклеотидов в мишени свидетельствовало о протекании реакции в комплексе, образованным в результате взаимодействия олигонуклеотидного фрагмента реагента с комплементарным ему участком ДНК-мишени. Общий выход реакции модификации достигал 30 %. Косвенные доказательства образования в ходе реакции синглетного молекулярного кислорода были получены в экспериментах с использованием D20 вместо НгО. В этих условиях наблюдали повышение уровня неспецифического расщепления мишени, что может быть обусловлено большим временем ЖИЗНИ 02 в D20 [92] и, следовательно, большим расстоянием, на которое может диффундировать эта молекула по сравнению с реакцией в НгО. В работе [93] авторы использовали в качестве реакционноспособных групп свободные или содержащие ионы Zn(II) метилпирропорфирин XXI (2) и протопорфирин IX (3). В молекулах порфиринов 2 и 3 имеются один и два остатка пропионовой кислоты, соответственно. Наличие второй карбоксильной группы в соединении 3 приводило в ходе синтеза конъюгатов к образованию двух изомеров, не отличающихся по химическим свойствам. Реакционные смеси облучали в течение 10 минут светом Nd:YAG лазера на длине волны 532 нм. Для всех конъюгатов, содержащих в структуре порфирина как неметилированный (К6-К7), так N-метилировапный остаток пиридина (К8-К9), было показано, что в результате реакции модификации образуются продукты сшивки с выходом 20 %. После обработки пиперидином было обнаружено, что модификация преимущественно протекала вне дуплекса: по основаниям G1 , G -G в случае 22-звенного олигонуклеотида-мишени МЗ и по основаниям G , G 16-звенной мишени М4. Общий выход щелочелабильной модификации олигонуклеотида МЗ составлял 77 % и 84 % в случае конъюгатов Кб и К8, соответственно. Положения модифицированных нуклеотидов свидетельствовали о протекании реакции в комплементарных комплексах. 1.2.1.2. Хлорины В работе [95] авторы использовали в качестве реакционноспособной группы хлорины 6 и 7, получив их путем восстановления протопорфирина и гептаэтилвинилпорфирина. Хлорины характеризуются сильным возрастанием интенсивности длинноволновой полосы спектра поглощения и ее батохромным смещением по сравнению с порфиринами, что удобно для проведения ФДТ.
Корриновый комплекс кобальта(П)
В работе [123] корриновый комплекс кобальта 15 использовали как реакционноспособную группу для синтеза конъюгатов с олигонуклеотидами GACCACCGCGCTACp (017) и pGGACCACCGCG (018). Один из двух предложенных методов синтеза заключался во взаимодействии свободной аминогруппы Со(П)-корринового комплекса с СООН-группой га-аминоэнантовой кислоты, предварительно присоединенной к олигонуклеотиду 017 (Схема XXI). Выход Со(И)-корринового производного К46 достигал 25-30 %. Связанный с полимером олигонуклеотид 018 фосфорилировали с использованием аминофосфитного производного 6-монометокситритил-аминогексанола с последующей конденсацией продукта реакции фосфорилирования с Со(П)-корриновым комплексом, содержащим свободную карбоксильную группу (Схема XXII). Удаление олигонуклеотидного производного с полимера и гидролиз защитных групп проводили по стандартной методике. Выход целевого продукта К47 составлял 80-90 %. Олигонуклеотиды GACCACCGCGCTACp (017) и pGGACCACCGCG (018), входящие в состав конъюгатов К46 и К47, были полностью комплементарны участкам 13-26 и 17-27 5S рибосомальной РНК из Е. coli. А в качестве мишени выбрали фрагмент 42-120 5S рибосомальной РНК из Е. coli, имеющий участки частичной комплементарности олигонуклеотидам 017 и 018. Соединение К46 авторы использовали только для отработки метода синтеза в растворе, модификацию мишени в его присутствии не изучали. Модификацию мишени проводили в составе неполных дуплексов Д18-Д21 (см. Рис. 8 на стр. 24), образование которых возможно при использовании конъюгата К47. Было показано, что окисление мишени молекулярным кислородом в присутствии аскорбиновой кислоты как сопряженного восстановителя происходило в составе данных комплексов с общим выходом реакции модификации 30-40 %. 1.2.23. Тексафирин диспрозия(ІІІ) Среди соединений, используемых для модификации ДНК, присутствуют аналоги порфиринов с расширенным циклом, например, тексафирин. Синтез и исследование конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с тексафирином диспрозия(Ш) 16 описаны в работе [124]. Синтез конъюгатов проводили через образование фосфамидного производного тексафирина диспрозия(Ш), которое присоединяли к 5 -концу олигонуклеотида, полученного стандартным твердофазным методом. Выход продукта синтеза достигал 75 % (Схема XXIII).
Для синтеза конъюгатов использовали олигонуклеотид pCATCTGTGAGCCGGGTGTTG (019), комплементарный фрагменту мишени CAACACCCGGCUCACAGAUGAAGUCUCCAAAAUAAA (М20). Модификацию проводили конъюгатами К48-К52 (Табл. 9) в составе дуплекса Д22 в присутствии дитиотреита как сопряженного восстановителя. Было установлено, что модификация, в основном, проходит по основаниям G и А21. Показано, что скорость реакции модификации падала с увеличением длины линкера. Такую зависимость скорости модификации от длины линкера можно объяснить возрастанием вероятности расхода активных форм кислорода в побочных процессах в растворе при увеличении длины линкера. Общий выход реакции модификации составлял около 50 % в случае конъюгата К48 и 70-80 % в случае конъюгатов К49-К52. В работе [125] авторы синтезировали вышеописанным методом (Схема XXIII) два различных конъюгата тексафирина диспрозия (III) с олигонуклеотидами pCATCTGTGAGCCGGGTGTTG (019) и TGGAGACTXCATCTGTGA (O20). В случае 019 реакционноспособную группу присоединяли к 5 -концу олигонуклеотида, а в случае 020 - через ненуклеотидную вставку X: -СНг-СН(СНгОІ1)-0-, находящуюся внутри олигонуклеотидной последовательности. Для синтеза конъюгатов К53 и К54 использовали олигонуклеотиды 019 и 020, соответственно, а в качестве мишени - олигодезоксирибонуклеотид CAACACCCGGCUCACAGAUGAAGUCUCCAAAAUAAA (М20). Модификацию проводили в составе дуплексов Д22 и Д23 в присутствии дитиотреита, как сопряженного восстановителя. Было показано, что мишень, в основном, подвергалась модификации по основаниям А21, А22 и G23. Выход реакции модификации в обоих случаях составлял около 80 %. При добавлении в раствор 25-кратного избытка немеченой РНК наблюдали различия в степени модификации: 5 % в случае К53 и 67 % в случае К54. Такой результат позволил авторам сделать вывод о том, что конъюгат К54 способен работать в каталитическом режиме, тогда как конъюгат К53 - нет. Таким образом, литературные данные свидетельствуют о большом интересе к производным олигонуклеотидов, содержащих остатки металлопорфиринов и их аналогов и способных вызьшать направленную окислительную модификацию нуклеиновых кислот. Модификация может протекать как в темповых условиях, так и при облучении светом в зависимости от типа металлокомплекса. В обоих случаях окисление нуклеиновых Кислот происходит с помощью активных кислородосодержащих частиц, которые генерируются путем каталитической или фотосенсилибированной активации молекулярного кислорода. Из представленных данных следует, что эффективность модификации нуклеиновых кислот зависит от строения металлокомплексов и их реакционной способности. Поэтому постоянно ведется поиск новых химически активных групп, обладающих преимуществами по сравнению с уже использующимися. Фталоцианины (или тетрабензотетраазапорфирины), являются синтетическими, более стабильными аналогами порфиринов.
Они способны генерировать активные формы кислорода в темновых условиях и под действием света. К началу настоящей работы в литературе отсутствовали данные о получении и изучении свойств фталоцианиновых производных олигонуклеотидов. Целью настоящей работы явилась разработка методов синтеза конъюгатов фталоциаиипов с олигодезоксирибонуклеотидами, изучение термодинамических характеристик их взаимодействия с ДНК в составе дуплексов, триплексов и тетраплексов, а также исследование их способности выступать реагентами для направленной каталитической или сенсибилизированной окислительной модификации ДНК. В работе были использованы акриламид, г4,М -метиленбисакриламид, мочевина (SERVA Electrophoresis GmbH, Германия), ацетонитрил, DMSO, DMF (Fluka, Швейцария). Все буферные растворы готовили на дважды дистиллированной воде с использованием отечественных реактивов степени чистоты о.с.ч. Тетра-4-карбоксифталоцианины Со(П), А1(Ш) и Zn(II) были любезно предоставлены Е. А. Лукьянцом (ГНЦ РФ "НИОПИК", г. Москва). 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза из Е. coli была любезно предоставлена А. А. Ищенко (ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). Олигонуклеотиды d(TGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT), d(ATGGGAAGAGGG), pd(TCTTCCCATT), pd(TCTTCCCA), d(CCCTCTTCCCTTTTGGGAAGAGGG), pd(TCTCTCTCTCTCT), d(GGGGGAGAGAGAGAGAGA), d(GGGAAGAGGGTCAG), d(AGTTAGGGTTAGGGTTAGGG), d(GGGAAGAGGGTTTTCCCTCTTCCC), NH2-(CH2)6-0-pd(TCTTCCCATT), NH2-(CH2)6-0-pd(TCTCTCTCTCTCT), NH2-(CH2)3-0-pd(TCTTCCCA),NH2-(CH2)6-0-pd([A]o.5GGGTTACT),NH2-(CH3)6-0-pd(TCTTCCCA) и pd([A]0.5GGGTTACT) были синтезированы Д. В. Пышным (ИХБФМ СО РАН) на автоматическом синтезаторе ASM-700 (ООО "БИОССЕТ", Россия) с использованием стандартного фосфитамидного метода. Продукты очищали с помощью ионообменной ВЭЖХ на колонке (4,6x250 мм) Nucleosil 100-5 SB с последующей обращенно-фазовой хроматографией на колонке (4,6x250 мм) Nucleosil 100-7 Сів (Macherey-Nagel GmbH, Германия). N-гидриксисукциничидные эфиры тетра-4-карбоксифталоцианинов Со(П), А1(Ш) и Zn(II) были синтезированы Т. М. Ивановой (ИХБФМ СО РАН) по методике, описанной в работе [126]. Производное NH2-(CH2)3-NH-pd(TCTTCCCA) синтезировали по методу [127]. Для этого активировали 5 -концевую фосфатную группу олигонуклеотида смесью трифенилфосфииа и 2,2 -дипиридилдисульфида в присутствии 4-]ЧДЧ-димстиламинопиридина. Сначала олигонуклеотид переводили в его СТАВ-соль.
Изучение комплексообразования конъюгата олигонуклеотида с фталоцианином кобальта(П) с различными структурами ДНК методами кругового дихроизма и термической денатурации
Являясь плоскими и гидрофобными молекулами, фталоцианины в водных растворах могут иметь повышенное сродство к азотистым основаниям нуклеиновых кислот. Разумно было предположить, что наличие остатка фталоцианина в составе различных комплексов ДНК будет стабилизировать их образование. Для проверки этой гипотезы было исследовано взаимодействие с ДНК конъюгатов олигонуклеотидоа с фталоцианином Со(П) 17 в составе одно-, двух-, трех- и четырехнитевьгх комплексов. Исследование влияния остатка фталоцианина на процессы образования дуплексов, триплексов и тетраплексов, содержащих и не содержащих остаток фталоцианина, проводили с помощью термической денатурации с регистрацией оптического поглощения (оптические кривые плавления) и методом кругового дихроизма (КД). Методом термической денатурации были получены термодинамические параметры устойчивости дуплексов и триплексов. Оптические кривые плавления комплексов регистрировали на длинах воли 260, 270, 280, 300 и 360 нм. Из вида электронных спектров поглощения ДНК и свободного фталоцианина видно, что на 300 нм оптическое поглощение есть только у фталоцианина (см. Рис. 13 на стр. 67), поэтому кривые плавления, регистрируемые на 300 нм, описывали процессы термической денатурации комплексов, образованных с участием молекулы фталоцианина. Спектры кругового дихроизма комплексов регистрировали в диапазоне температуры от 10 С до 95 "С. Для каждого комплекса сравнивали результаты, полученные из температурных серий спектров КД и дифференциальных кривых плавления. Для исследования термодинамических параметров взаимодействия конъюгатов в составе одно- и двухцепочечных комплексов ДНК были выбраны олигонуклеотид рТСТТСССА (ОЗ) и конътогат PtcCo(II)-NH-(CH2)6-0-pTCTTCCCA (К58), которые при взаимодействии с олигонуклеотидом-мишенью ATGGGAAGAGGG (М21) образовывали дуплексы Д24 и Д25, соответственно (Рис. 17). В качестве контроля исследовали термическую денатурацию олигонуклеотида ОЗ. При этом на дифференциальных кривых плавления не наблюдали явного перехода, что означало, что такой олигонуклеотид не образует вторичной структуры. Исследование олигонуклеотида ОЗ методом КД не проводили. Дифференциальные кривые плавления конъюгата К58 (Рис. 18а) содержали слабовыраженный переход с максимумом 18 С.
Наличие такого перехода свидетельствовало о том, что остаток фталоцианина взаимодействовал с олигонуклеотидной частью конъюгата К58 с образованием внутримолекулярного комплекса. Форма спектров КД этого конъюгата соответствовала стандартному спектру В-формы ДНК [139] с отрицательным и положительным максимумами около 240 и 260 нм, соответственно. Изменение формы спектров КД в зависимости от температуры (Рис. 186) подтверждало наличие внутримолекулярного комплекса конъюгата К58. То есть фталоцианиновая группировка достаточно прочно взаимодействовала с собственной ДНК-цепью. Дифференциальные кривые плавления олигонуклеотида ATGGGAAGAGGG (М21), так же как и в случае олигонуклеотида рТСТТСССА (ОЗ), не содержали явного перехода (Рис. 18в). Это позволило исключить возможность образования вторичной структуры олигонуклеотидом-мишенью М21. Спектры КД олигонуклеотида М21 содержали одну полосу малой интенсивности с максимумом при ж 255 нм. Такая форма спектра КД соответствовала сумме спектров отдельных нуклеотидов и указывала на отсутствие регулярной структуры ДНК [133]. Изменение спектра КД в зависимости от температуры было невелико и не соответствовало плавлению внутримолекулярного комплекса (Рис. 18г). Скорее всего, такие незначительные изменения в спектре КД были вызваны сильным изменением гидрофобности вследствие нагревания. Влияние остатка фталоцианина на термодинамические параметры образования дуплексов изучали, сравнивая двухцепочечные комплексы Д24 и Д25. Эти дуплексы были образованы мишенью М21 и олигонуклеотидами, не содержащими или содержащими остаток фталоцианина на 5 -концевой фосфатной группе. Дифференциальные кривые плавления комплексов содержали единственный четко выраженный переход с Тт около 30 С (Рис. 19а, 19в). Для дуплекса Д25, содержащего остаток фталоцианина, температура плавления комплекса составила 34 С, что на 6 С выше по сравнению с температурой плавления комплекса Д24 (Tm = 28 С). Такие данные служили доказательством стабилизирующего влияния остатка фталоцианина на образование двухцепочечных комплексов ДНК. Еще одним доказательством взаимодействия остатка фталоцианина с ДНК являлась дифференциальная кривая термической денатурации, регистрируемая на длине волны 300 нм. Форма кривой и положение максимума перехода были идентичны форме дифференциальных кривых плавления, регистрируемых на длинах волн 260, 270 и 280 нм. Из сопоставления кривых плавления на 260-280 нм и на 300 нм можно было сделать вывод, что они описывали один тот же процесс.
Другими словами, "плавление" остатка фталоцианина происходило одновременно с плавлением олигонуклеотида. Спектры КД комплексов Д24 и Д25 содержали две полосы: отрицательную и положительную. В обоих случаях максимум отрицательной полосы находился на 240 нм (Рис. 196, 19г). Тут следует отметить, что "классическим" для В-формы ДНК является спектр КД с приблизительно равными интенсивностями отрицательной (240 нм) и положительной (270-280 нм) полос [140, 141]. Для комплекса Д24 соотношение интенсивностей отрицательной и положительной полос было примерно одинаково, однако, положительная полоса была шире. Максимум положительной полосы находился на длине волны примерно 275 нм при 10 С и не менялся с ростом температуры, что соответствовало кооперативному характеру плавления комплекса Д24 (Рис. 196). В случае комплекса Д25 интенсивность положительной полосы была больше интенсивности отрицательной примерно в два раза. Положение максимума положительной полосы менялось в процессе плавления: от 267 нм при 15 С до 276 нм при 65-85 С (Рис. 19г), Такое изменение положения максимума могло быть обусловлено наложением спектра индуцированного КД, вызванного взаимодействием фталоцианина с олигонуклеотидой частью конъюгата, на спектр КД комплекса Д25. Таким образом, поведение спектров КД дуплексов Д24 и Д25 в зависимости от температуры подтверждало результаты, полученные при исследовании данных комплексов методом термической денатурации. 3.2.2. Комплексообразование с двухцепочсчными ДНК Влияние молекулы фталоцианина на образование трехцепочечных комплексов ДНК изучали на триплексах Т4-Т7 (Рис. 20), образованных в результате взаимодействия двухцепочечных участков олигонуклеотидов Д26 и Д27, имеющих форму шпилек, с олигонуклеотидом виде шпильки, были выбраны для того, чтобы однозначно разделить переходы, соответствующие плавлению дуплекса и триплекса в составе одного комплекса. Последовательности Д26 и Д27 были выбраны так, чтобы в триплексе остаток фталоцианина располагался либо в месте перехода стебельного района в петлю шпильки в комплексе Т7, либо в районе 3 -, 5 -концов шпильки в комплексе Т6.
Модификация ДНК-мишени в составе двухдепочечного комплекса
После определения оптимальных условий протекания реакции модификации были проведены эксперименты по определению и распределению основных сайтов модификации. Модификацию детектировали после обработки 22-звенного олигонуклеотида-мишени TGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT (МЗ) как 1 М пиперидином (см. Рис. 36), так и Fpg-белком. Реакционные смеси инкубировали в присутствии 2-меркаптоэтанола, как сопряженного восстановителя, или пероксида водорода при 25 С в течение 48 часов. Анализируя продукты реакции гель-электрофорезом в 20 % ПААГ, обнаружили, что, в основном, модифицируются основания G13-G15 , расположенные в предполагаемом месте локализации реакционноспособной группы (Рис. 37). Состав модифицированных оснований, получаемых при действии конъюгатов PtcCo(II)-NH-(СН2)6-0-рТСТТСССА (К58) и PtcCo(II)-NH-(CH2)6-0-pTCTTCCCATT (К61), похож, однако, в случае К61 модификация была более локализована в области Gn-G15, тогда как для К58 наблюдалась более выраженная модификация по основаниям G6-G8, G19, G20 относительно основного модифицированного основания G13. Рис. 36. Радиоавтограф, полученный при разделении в 20 % денатурирующем ПААГ продуктов окислительной модификации мишени TGAATGGGAAGAGGGTCAGGTT (МЗ) конъюгатами PtcCo(II)-NH-(CH2)6-0-pTCTTCCCA (К58) и PtcCo(II)-NH-(CH2)6-0-pTCTTCCCATT (К61) в составе дуплексов ДЗ (дорожки 1, 2, 5) и Д28 (дорожки 3, 4, 6) после обработки пиперидином. Концентрация мишени во всех дорожках - 1,0x10"8 М, конъюгата К61 (дорожки 1,2)- 1,0x10"5 М; конъюгата К58 (дорожки 3, 4) - 1,0x10"5 М; концентрация Н202 (дорожки 1, 3, 5, 6) - 1,0x10"2 М. Дорожки 7 и 8 - олигонуклеотид МЗ, расщепленный по методу Максама-Гилберта по основаниям G и A + G, соответственно. Причиной этого, по-видимому, являлось преимущественное протекание реакции модификации по пути образования продуктов, окисленных по 8-ому положению гуанозина. Общий выход щелочелабильной модификации при использовании 2-меркаптоэтанола и пероксида водорода составил 18 % и 50 %, соответственно, тогда как выход модификации, детектируемой Fpg-белком, при использовании 2-меркаптоэтанола и пероксида водорода - 25 % и 60 %, соответственно. Поскольку Fpg-белок может не выявлять сайты модификации, которые выявляются пиперидином, то степень модификации может представлять сумму этих величин, то есть достигать 100 % при окислении пероксидом водорода. Для того, чтобы показать, что конъюгат олигонуклеотида с фталоцианином Со(И) способен модифицировать ДНК в составе трехцепочечного комплекса, были использованы олигонуклеотиды GGGGGAGAGAGAGAGAGA (М26) и рТСТСТСТСТСТСТ (022).
Был синтезирован конъюгат PtcCo(II)-NH-(CH2)6-0-рТСТСТСТСТСТСТ (К62), который мог образовывать с олигонуклеотидом-мишенью М26 как дуплекс ДЗО, так и триплекс Т10 (см. Рис. 28 на стр 90), причем в образовании трехцепочечного комплекса участвовали две молекулы конъюгата К62. Образование комплексов регулировали буферными условиями (см. раздел "Материалы и методы"). Модификацию проводили при температуре 25 С в течение 24 часов в присутствии пероксида водорода. Продукты реакции модификации, детектируемые после обработки 1 М пиперидином, анализировали гель-электрофорезом в 20 % ПААГ. Распределение по сайтам модификации, выявляемой пиперидином, определялось местом локализации реакционноспособной группы, то есть зависело от того, в каком комплексе ДНК, двух- или трехцепочечном, протекала модификация (Рис. 41). П 1 "7 Если в дуплексе модификации подвергались основания G -G с 3 -конца олигонуклеотида-мишени, то в триплексе модифицировались преимущественно основания А6-А10 и немного G15-G17. Наличие модификации на З -конце мишени в триплексе объяснялось расположением остатка фталоцианина одного из двух конъюгатов, входящих в состав комплекса. Выход модификации, выявляемой пиперидином, был примерно одинаков и в обоих случаях составлял около 30 %. Выход модификации, проводимой в составе триплекса и детектируемой Fpg-белком, был гораздо ниже по сравнению с модификацией, выявляемой пиперидином, и составлял 5 %. 3.3.1.5. Модификация модельного олигонуклеотида-мишени в составе четырехцепочечного комплекса ДНК Модификацию ДНК в составе четырехцепочечного комплекса ДНК Т9 проводили при температуре 25 С (Рис. 42). Анализируя продукты реакции гель-электрофорезом в 20 % ПААГ, в тетраплексе, в отличие от модификации в дуплексах и триплексах, наблюдали неспецифичную модификацию, которая была обусловлена структурной особенностью комплекса.
Гуанозины, участвующие в образовании четырехцепочечного комплекса, были сближены в пространстве, и поэтому они все оказывались досягаемыми для радикалов, продуцируемых молекулой фталоцианина. Так как мишень состояла всего из 20 нуклеотидов, модифицированные основания были распределены по всему олигонуклеотиду (см. Рис. 37 на стр. 97). Выход модификации, детектируемой пиперидином, составлял около 10 %. Таким образом показано, что конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианином Со(П) способны катализировать окислительную модификацию ДНК в составе различных комплексов; дуплексов, триплексов и тетраплексов. Максимальная степень модификации достигается в случае дуплексов и может составлять 80 - 100%. 3.3.2. Фотосенсибилшированная модификация ДНК Сенсибилизированную модификацию ДНК проводили в условиях образования полного дуплекса ДЗ (см. Рис. 28 на стр. 85). В качестве реагентов использовали конъюгаты PtcZn(II)-NH-(CH2)3-0-pTCTTCCCA (К56), PtcAl(III)-NH-(CH2)3-0-pTCTTCCCA (К57), PtcZn(II)-NH-(CH2)6-0-pTCTTCCCA (K59) и PtcAl(III)-NH-(СНг)б-О-рТСТТСССА (K60), различающиеся природой центрального атома в молекуле фталоцианина и линкера, соединяющего остаток фталоцианина с олигонуклеотидом ОЗ. Спектр поглощения фталоцианинов Zn(II) и А1(Ш) содержит полосу Соре на длине волны 340 нм и две Q-полосы на 630 и 680 нм. Поэтому остатки фталоцианинов можно фотоактивировать светом ртутной лампы (Хтах = 365 НМ) ИЛИ СВеТОМ ГеЛИЙ-НеОНОВОГО Лазера ( .тах = 633 нм). 3.3.2.1. Модификация при облучении светом ртутной лампы Облучение образцов светом с длиной волны 365 нм проводили в течение 3 часов в прямоугольной кварцевой кювете с длиной оптического пути 0,1 см. Кювета была помещена в термостатированную при 5 С кварцевую кювету большего объёма, заполненную дистиллированной водой. Источником света служила ртутная лампа высокого давления ДРШ-1000 (Россия) мощностью 1000 Вт. Для вырезания из спектра ртутной лампы ультрафиолетовой области, использовали фильтр БС-4 (Россия), который не пропускает свет с длиной волны ниже 340 нм. Спектр ртутной лампы высокого давления состоит из отдельных полос, и только одна полоса (X = 365) выше 340 нм может возбуждать реагенты, так как она перекрывается с полосой Соре фталоцианинов. Спектр излучения лампы приведён на Рис. 43.
Похожие диссертации на Конъюгаты олигонуклеотидов с металлофталоцианинами
![Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола](/i/i/4301/324197.png "Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола Белоглазова Наталья Геннадьевна")
