Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами 8
2.1. Общая характеристика блеомицинов 8
2.2. Структура блеомицинов 9
2.3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа 10
2.4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами 12
2.5. Специфичность расщепления нуклеиновых кислот блеомиципом 14
2.6. Эффективность расщепления РНК блеомицином 23
2.6.1. Сравнение эффективности расщепления различных РНК 23
2.6.2. Зависимость эффективности расщепления от концентрации ионов магния 23
2.7. Продукты расщепления нуклеиновых кислот блеомицином 25
2.8. Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами 30
2.8.1. Синтез конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами 30
2.8.2. Стабилизация комплементарных комплексов конъгогагмишень остатком блеомицина 30
2.8.3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК 30
2.8.4. Каталитическое расщепление одпоцепочечной ДНК олигонуклеотидным конъюгатом блеомицина 31
2.8.5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса 32
3. Расщепление нуклеиновых кислот блеомициновыми производными олигонуклеотидов 34
3.1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов 34
3.1.1. Синтез стандартных конъюгатов 35
3.1.2. Синтез линкерсодержащих конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами 36
3.2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъгагатами блеомицина с олигонуклеотидами 39
3.2.1. Расщепление одноцепочечных ДНК коиъюгатами блеомицина с протяженной оли гонуклеотидной частью 39
3.2.2. Расщепление ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотндами вприсутствии олигонуклеотидных эффекторов 42
3.2.2.1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотндами в составе тандемных комплексов 47
3.2.3. Влияние гидрофобных и гетероциклических группировок Б составе конъюгата и эффекторов на эффективность расщепления одноцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотндами в составе тандемных комплексов 57
3.3. Субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных с участием тандемов производных коротких олигонуклеотидов по отношению к рибонуклсазе Н Е, coli 60
3.3.1. Гидролиз РНК рибонуклеазой Н Е. coli в составе гибридного дуплекса, образованного с участием немодифицированного тандема коротких олигодезоксирибонуклеотидов 60
3.3.2. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блеомицина с короткими олигонуклеотндами, по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli67
3.4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами 76
3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс- формирующими олигонуклеотидами (ТФО) 80
3.6. Заключение 83
4. Экспериментальная часть 85
4.1. Исходные материалы 85
4.2. Основные методы работы 85
4.2.1. Хроматографические методы 86
4.2.2. Электрофорез 86
4.2.3. Спектрофотометрия 87
4.3. Методики эксперимента 88
Выводы 91
- Структура блеомицинов
- Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
- Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотндами в составе тандемных комплексов
- Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами
Введение к работе
Реакцнонноспособные производные олигонуклеотидов (РПО) широко применяются в исследовательской практике для изучения структуры и функций важнейших биополимеров - белков и нуклеиновых кислот. Направленная модификация нуклеиновых кислот при помощи РПО является одним из основных подходов к решению целого ряда задач. В их числе - исследование нукл ей ново-белковых взаимодействий, манипулирование генетическим материалом, регуляция экспрессии гена, генная конверсия. К настоящему времени создан широкий спектр РПО, включающий ол иго нукл еотиды, несущие различные алкилирующие группы, фотоактивные остатки, металлокомплексы. Среди последних наибольший интерес представляют металлокомплексы, принимающие участие в циклических процессах окисления -восстановления. К числу таких группировок принадлежит остаток гликопептидного антибиотика блеомицина, обладающий рядом уникальных свойств. Наиболее важными из них являются:
- способность вызывать прямое (наблюдаемое без дополнительных обработок) расщепление ДНК и РНК;
- высокая селективность окисления дезоксирибозы и рибозы (гетероциклические основания практически не модифицируются);
- относительно низкая токсичность, позволяющая применять антибиотик как противоопухолевое средство в терапевтической практике.
В ЛХНК НИБХ СО РАН впервые были созданы блеомициновые производные олигонуклеотидов. Был разработан способ конъюгирования блеомицина А5 и олигонуклеотидов с сохранением способности олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы, а остатка блеомицина - осуществлять селективное расщепление ДНК. Первые исследования показали, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами обладают рядом уникальных свойств. Они могут эффективно расщеплять одноцепочечные ДНК в составе комплементарных дуплексов. В зависимости от условий одна молекула конъюгата может повреждать до трех молекул ДНК или наносить несколько повреждений одной молекуле мишени. Кроме того, было выявлено, что остаток блеомицина в составе олиготимидилата способен осуществлять прямые разрывы двуцепочечных ДНК в триплексах. До сих пор неизвестны другие конъюгаты олигонуклеотидов, обладающие столь уникальными свойствами. Полученные результаты безусловно свидетельствовали о том, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами являются одними из наиболее перспективных реакционноспособных производных олигонуклеотидов. Такие конъюгаты могут найти применение в антисенс- и антигенном подходах к регуляции экспрессии гена, для генной конверсии, а также могут быть использованы в молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективных искусственных нуклеаз с уникальной специфичностью. Низкая токсичность блеомицина позволяет также надеяться на возможность использования его конъюгатов с олигонуклеотидами в качестве терапевтических средств.
В данной работе исследовано взаимодействие блеомициновых производных олигонуклеотидов в составе тандемных комплексов с одноцепочечной ДНК, в составе триплексов с двуцепочечной ДНК и впервые показана возможность расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами. Также в работе показано, что остаток блеомицина не препятствует гидролизу РНК РНКазой Н Е.соїі в составе гибридных дуплексов.
Научная новизна и практическая ценность
В настоящей работе впервые исследовано расщепление фрагментов ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами в тандемных комплексах с олигонуклеотидными эффекторами. Показано, что в тандемных комплексах одна молекула конъюгата блеомицина с тетрануклеотидом может расщепить свыше 6 молекул ДНК-мишени. Обнаружено, что максимальную эффективность проявляют конъюгаты с коротким олигонуклеотадным адресом (4-5 нуклеотидов), повреждающие ДНК-мишень в сайте связывания конъюгата.
Впервые показана возможность расщепления РНК (30-звснного фрагмента) конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.
Разработан метод синтеза новых конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами, содержащих линкеры на основе гексаэтиленгликольфосфата. Показано, что такие конъюгаты более эффективно расщепляют двуцепочечные ДНК в составе триплексов. Также показано, что использование линкерсодержащих конъюгатов позволяет существенно повысить эффективность направленного расщепления РНК за счет формирования в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина, и его доставки к таким сайтам при помощи линкера оптимальной длины.
Выявлено, что субстратные свойства блеомициновых производных коротких олигонуклеотидов в составе тандемных гибридных дуплексов по отношению к рибонуклеазе Н E.coli близки к таковым для протяженных олигонуклеотидов. Результаты этого исследования позволяют рассчитывать на успешное применение разработанных конъюгатов в качестве искусственных иуклсаз, а также эффективных ген-направленных соединений.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура блеомицинов
Установление структуры блеомицина - сложное и продолжительное исследование - было блестяще проведено группой ученых, руководимой первооткрывателем блеомицина - Н. Umezavva [36]. Предложенная ими структурная формула была окончательно подтверждена в 1982 встречным синтезом блеомицина [37]. Общий для всех блеомицинов фрагмент структуры - блеомициновая кислота включает в себя остатки пиримидобламиновой кислоты, fi-оксиги ста дина, 4-амино-З-окси-2-метилпснтановой кислоты, треонина, 2 -(2-аминоэтил-2,4 -битиазол-4-карбоновой кислоты), 3-(0-карбамоил)-0-маннозы и L-гулозы. В структуре блеомицина выделяют четыре домена [38]. На N-конце молекулы находится металлсвязывающий домен, аминогруппы которого участвуют в хелатировании ионов переходных металлов [8] (Fe, Си, Со, Ni, Zn, Cd, V) [39-42], N-концевой фрагмент молекулы также участвует и в связывании с ДНК; подробнее об этом см. 2,4. Дисахаридный фрагмент, включающий остатки 3-(0-карбамоил)-0-маннозы и L-гулозы, связан с гидроксмльной группой р-оксигистидина. Хотя дисахаридный фрагмент и не является необходимым для проявления ДНК-расщепляющей активности антибиотика, его удаление приводит к снижению эффективности расщепления ДНК. Предположительно, дисахаридный фрагмент облегчает связывание молекулярного кислорода металлокомплексами блеомицина, а также облегчает проникновение молекулы блеомицина в клетки. Линкерный участок, состоящий из остатков метилвалерата и треонина по данным ряда исследований может быть ответственным за конформационпую гибкость блеомицина, и, следовательно, за оптимальную эффективность расщепления ДНК. Замена остатка метилвалерата на его производные с жесткой структурой (так называемые конформационно-ограниченные) приводит к снижению эффективности и к потере природной сиквенс-специфичности расщепления [43]. Битиазольный остаток и С-концевой амин отвечают за связывание молекулы антибиотика с ДНК. Индивидуальные блеомицины отличаются строением концевого амина, связанного с карбоксильной группой битиазольного остатка. Блеомицины подгруппы А (кроме А] и А2) содержат в концевом амине первичные и вторичные аминогруппы, а блеомицины В - гуанидиниевые группировки. Наиболее часто используются блеомицины А2, В2, их смесь - бленоксан - и А5. Несмотря на структурные отличия, указанные блеомицины проявляют сходные свойства.
Далее по тексту для обозначения всех представителей семейства будет использовано общее обозначение - BIm. 2.3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа Несмотря на то, что данные по влиянию кислорода и ионов металлов на расщепление ДНК блеомицином появились практически сразу после открытия антибиотика [5], механизм расщепления ДНК блеомицином оставался невыясненным достаточно продолжительное время. Существовали предположения о гидролитической природе данной реакции. И лишь спустя десятилетие стало ясно, что ДНК-расщепляющей активностью обладает система блеомицин-Ре(И)-02 [44, 45]. Это открытие стимулировало интенсивные исследования процесса окисления ДНК. Одним из направлений этих исследований стало изучение процесса активации металлокомплексов блеомицина в присутствии молекулярного кислорода, пероксида водорода, восстановителей, а также процесса фотоактивации. Основная масса исследований механизма активации блеомицина была выполнена в присутствии ионов двухвалентного железа и молекулярного кислорода. Комплекс блеомицина с Fe(ll) был первым из металлоблеомицинов, для которого было продемонстрировано окислительное расщепление ДНК [46, 47]. Также описано окислительное расщепление ДНК другими металлоблеомицинами, среди которых комплексы с Cu(I), Mn(ll), VO(IV), Co(III), Ru(II), Ni(III) [40]. В присутствии Fe(II) блеомицин образует комплекс Blm-Fe(tl), способный взаимодействовать с молекулярным кислородом [48]. В результате взаимодействия возникает диамагнитный комплекс 02 -Fe(lII)Blm, содержащий супероксид-радикал [49]. Далее данный комплекс диспропорционирует [50] с образованием 02 Fc(III)B1m и «активированного блеомиципа», который является последним из детектируемых. комплексов, образующихся при взаимодействии Fe(II)Blm и молекулярного кислорода [51]. Известно, что реакция диспропорционирования подавляется в присутствии высоких концентраций ДНК, возможно, за счет изоляции супероксидного комплекса при связывании с ДНК [52, 53]. В этом случае образование активированного блеомицина возможно за счет окисления другой молекулы комплекса Fe(II)Blm до Fe(IIl)BIm. Присутствие в системе других восстановителей также способствует этой реакции. Альтернативным путем образования активированного блеомицина является взаимодействие Fe(III)Blm с пероксидом водорода или системой супероксид/дополнительный электрон [54, 55] с образованием комплекса, спектроскопически идентичного активированному блеомицину, полученному при взаимодействии Fe(II)Blm и 02 [56]. Природа комплекса, известного под названием «активированный блеомиции», стала известна относительно недавно. Согласно данным исследований с использованием методов масс-спектрометрии и кинетических изотопных эффектов, активированный блеомицин представляет собой пероксокомплекс состава [HOO-Fe(HI)Blm]. Хотя этот комплекс и является последним из регистрируемых в цепи превращений Fe(II)Blm и Ог, предполагают, что он может спонтанно разлагаться [54, 56] через гетеролиз либо гомолиз связи О-О, с образованием монооксигенированного комплекса железа с блеомицином. При этом гомолизу связи 0-0 соответствует комплекс 0=Fe(IV)-BIm, а гетеролизу -O FetV BIm. Предполагается [54], что один из этих комплексов и является конечным окислителем молекулы ДНК.
Последние данные, полученные при исследовании пероксокоплексов железа, образованных с лигандами, моделирующими металлсвязывающий домен блеомицина, свидетельствуют в пользу гетеролитического расщепления связи 0-0 [57]. 2.4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами Связывание блеомицина с ДНК является одной из наиболее изученных стадий их взаимодействия. Методами тушения флюоресценции, равновесного диализа [58-60], гель-фильтрации [60] и спектроскопии кругового дихроизма [61-63] показано, что блеомицин обладает высоким сродством к двуцепочечной ДНК. Первые доказательства связывания блеомицина с ДНК были получены в 1970 г, [64]. Однако систематические исследования этого процесса с использованием физико-химических методов начались лишь во второй половине 70х годов. Один из важнейших методов определения сродства блеомицина к ДНК основан на тушении флуоресценции блеомицина при связывании с ДНК [65]. При возбуждении на длине волны 300 нм в спектре испускания блеомицина наблюдаются две полосы с максимумами при 353 и 405 нм. Первая полоса соответствует флуоресценции битиазольного остатка антибиотика и превышает по интенсивности полосу испускания 4-аминопиримидинового кольца при 405 нм. Добавление ДНК тимуса теленка приводит к существенному (до 50%) тушению флюоресценции при 353 нм. Это позволило определить содержание связанного и свободного блеомицина, а при использовании разных концентраций ДНК вычислить кажущуюся равновесную константу связывания (Кь) и число нуклеотидов ДНК на одну связанную молекулу антибиотика (п). В зависимости от вида координированного иона металла константа связывания может достигать значений от 3.5-105 л-моль"1 (для комплекса с трехвалентным железом) до 1-Ю7 л-моль"1 (для комплексов с трехвалентным кобальтом). Для апо-блеомицина (не содержащего иона металла) в 10 мМ фосфатном буфере (рН=7.0) величина Кь составляет 0.5-10 л-моль" . Число пар оснований ДНК на связанную молекулу антибиотика в большинстве случаев составляет 3-Ю пар. При исследовании связывания медь- или кобальтсодержащих комплексов блеомицина с ДНК было показано, что повышение ионной силы раствора существенно уменьшает Кь, что свидетельствует о вкладе электростатических взаимодействий в данный процесс [66]. В последнее десятилетие спектроскопические исследования взаимодействия металл оком плексов блеомицина с ДНК приобрели более глубокий характер. Использование явления магнитного кругового дихроизма (MCD) и спектроскопии рентгеновского поглощения (XAS) позволило сделать выводы о существенных изменениях в структуре металлсвязывающего центра блеомицина при связывании антибиотика с ДНК, обусловленном, по-видимому стерическими факторами [67].
Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
Конъюгаты блеомицина с короткими фрагментами нуклеиновых кислот впервые были синтезированы в 90х годах прошлого века в ЛХНК НИБХ СО РАН (ныне - ЛХНК ИХБФМ СО РАН). Сложная синтетическая задача конъюгирования молекул со множеством нуклеофильных центров была решена Сергеевым с соавторами [104, 105]. Селективная активация концевой фосфатной группы олигонуклеотида была выполнена при помощи трифенилфосфина и 2,2 -дипиридилдисульфида в присутствии 4-N,N-диметиламинопиридин-Ы-оксида. Полученная таким образом цвиттер-ионная группа легко взаимодействует с алифатическими аминогруппами [106]. Аминогруппы металлсвязывающего центра блеомицина защищали хелатированием иона меди [107]. В полученном комплексе доступными для взаимодействия с активированным фосфатом остаются лишь аминогруппы концевого спермидинового остатка. Структура образующихся конъюгатов была подтверждена методами электронной [105] и ЯМР-спектроскопии [108]. Согласно этим данным, при взаимодействии хелатного комплекса Си(П)-блеомицина с активированной фосфатной группой образуются конъюгаты со стехиометрией 1:1, причем присоединение протекает селективно по концевой аминогруппе спермидинового остатка. 2.8.2. Стабилизация комплементарных комплексов конъюгат-мишень остатком блеомицина Ранее отмечалось [109], что при связывании с нуклеиновыми кислотами блеомицин стабилизирует дуплексные структуры. Оказалось, что остаток блеомицина в составе конъюгата стабилизирует комплементарный комплекс, образованный олигонуклеотидпой частью конъюгата с целевым участком ДНК [104, 105]. Стабильность комплекса гептапуклеотидного конъюгата блеомицина с 14-звенной ДНК-мишенью на 11 С превышает стабильность комплекса, образуемого с этой же мишенью немодифицировапным гептануклеотидом (22 С). 2.8.3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК В работе [ПО] было показано, что остаток блеомицина в составе конъюгатов с 12-и 14-звенными олигонуклеотидами способен расщеплять одноцепочечную ДНК-мишень. В качестве ДНК-мишени был использован 302-звенный фрагмент ДНК, представляющий собой копию фрагмента РНК вируса клещевого энцефалита.
В условиях образования комплементарных комплексов оба конъюгата вызывали расщепление ДНК-мишени по ближайшим к месту расположения антибиотика GT-последовательностям (Т272 и Т277). Расщепление данной мишени неконъюгированным блеомицином или конъюгатом, не имеющим сайта комплементарного связывания протекает по множеству сайтов, причем сайты Т272 и Т277 не являются основными. Таким образом, расщепление мишени комплементарными конъюгатами является сайт-специфическим, то есть обусловлено образованием правильных комплементарных комплексов между оли гонуклеотидной частью конъюгатов и участком ДНК-мишени. Эксперимент по конкурентному ингибированию расщепления ДНК-мишени 7-звенным конъюгатом в присутствии комплементарной 14-звенной цепи [105] также показывает, что для эффективного расщепления ДНК-мишени необходимо образование комплементарного комплекса между оли гонуклеотидной частью конъюгата и ДНК-мишенью. 2.8.4. Каталитическое расщепление ДНК олнгонуклеотидным конъюгатом блеомицина Ранее уже была отмечена способность блеомицина к повторной активации в присутствии восстановителя [54]. Это свойство позволяет молекуле антибиотика осуществлять расщепление различных субстратов в каталитическом режиме [111]. В работе [112] показано, что при избытке ДНК мишени одна молекула конъюгата способна повредить в среднем около трех молекул ДНК-мишени. При этом расщепление протекает по единственному нуклеотидному остатку (на схеме слева). Таким образом, остаток антибиотика и в составе коньюгата сохраняет способность к повторной активации. При эквивалентном соотношении концентраций ДНК-мишени и конъюгата происходит повторное расщепление одной и той же ДНК мишени с последовательным образованием укороченных продуктов (на схеме справа). 2.8.5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса В работе [113] продемонстрирована возможность повреждения двуцепочечной ДНК-мишени коныогатом блеомицина с гексадекатимидилатом в составе триплекса. Ниже приведена схема расщепления двуцепочечной ДНК-мишени конъюгатами гексадекатимидилатов, содержащими остаток блеомицина на 5 - (вверху) или на З -конце (внизу). Стрелки указывают расщепляемые нуклеотидные остатки, длина стрелок приблизительно соответствует интенсивности расщепления по указанному сайту. ДНК мишень для данного исследования была выбрана в соответствии со следующими критериями: наличие гомопуриновой и гомопиримидиновой последовательностей для формирования прочного триплекса при в области нейтральных значений рН; наличие в области расположения связывания остатка блеомицина динуклеотидных последовательностей, являющихся сайтами эффективного расщепления. Было показано, что конъюгаты, содержащие остаток блеомицина на 5 - или на З -конце, индуцируют расщепление обеих цепей ДНК мишени преимущественно в области расположения остатка блеомицина в составе триплекса в соответствии с параллельной ориентацией третьей цепи. При этом степень повреждения индивидуальных цепей ДНК составляет от 25 до 47 % в зависимости от вида конъюгата. Суммируя приведенные данные по взаимодействию олигопуклеотидных конъюгатов блеомицина с ДНК, можно заключить, что такие конъюгаты обладают рядом уникальных свойств.
Они способны сайт-специфично и с высокой эффективностью осуществлять расщепление одно- и двуцепочечных ДНК. Вызываемые остатком блеомицина разрывы являются прямыми, то есть не требуют для выявления дополнительных обработок. Следует отметить, что во всех случаях эффективность расщепления ДНК конъюгатами была заметно ниже эффективности действия немодифицированного антибиотика. В частности, степень расщепления одной из цепей дуплекса неконъюгированным блеомицином превышает 80%. Поскольку эффективность действия является одной из важнейших характеристик реакционноспособных производных олигонуклеотидов, исследование возможности ее повышения представляло значительный интерес. Еще более важным представляется выяснение возможности расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами. Поскольку мРНК, находящиеся в цитоплазме являются более доступными клеточными мишенями для действия РПО Реакционноспособные производные олигонуклеотидов (РПО) находят применение в физико-химической биологии и биоорганической химии в качестве прецизионных инструментов исследования НК - НК и белок - нуклеиновых взаимодействий, а также рассматриваются в качестве основы для создания терапевтических препаратов нового поколения, способных селективно воздействовать на патогенные нуклеиновые кислоты. К настоящему времени создан целый ряд различных производных олигонуклеотидов. Важнейшими характеристиками РПО являются эффективность и специфичность воздействия на целевой объект. Химическая природа реакционноспособной группировки, протяженность и строение олигонуклеотидного адреса могут оказывать ключевое влияние на эффективность и специфичность РПО. В качестве реакционноспособных групп при создании РПО перспективно использовать соединения, способные к многократной реактивации и многократному взаимодействию с субстратом. Предполагается, что такие РПО смогут действовать подобно природным катализаторам - ферментам. Синтезированные ранее в ЛХНК НИБХ СО РАН конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами несомненно являются одними из самых перспективных РПО. Уже обнаруженные свойства этих конъюгатов позволяют заключить, что такие соединения способны к повторной активации и взаимодействию более чем с одной молекулой субстрата. Поэтому дальнейшее исследование свойств этих соединений представляет значительный научный и практический интерес. ЗЛ. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов Для выполнения данной работы был синтезирован набор конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами. Были синтезированы конъюгаты двух типов (Рис. 1). В конъюгатах первого типа (Рис. 1 а) остаток блеомицина непосредственно связан с концевой фосфатной группой олигонуклеотида.
Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотндами в составе тандемных комплексов
Исследование каталитической эффективности конъюгатов проводили при соотношении концентраций конъюгата и мишени 1:10. Максимальная степень модификации ДНК-мишени немодифицированным блеомицином в присутствии эффекторов и немодифицированного тетрануклеотида - 64%. При десятикратном избытке ДНК-мишени относительно реагента это означает, что одна молекула антибиотика повреждает в среднем около шести молекул ДНК-мишени. Все конъюгаты расщепляют мишень D20 специфично: сайты расщепления СЮ и А8 находятся вблизи расположения остатка антибиотика в комплексах 12-15 (см. рис. 16, 17). Во всех случаях преобладает расщепление по сайту СЮ, в комплексе 13 более 90% от суммарной степени расщепления приходится этот сайт. Таким образом, расщепление осуществляется высокоселективно. Немоднфицированный блеомицнн расщепляет мишень D20 преимущественно по сайтам С\0 и СЗ, причем оба сайта повреждаются в равной степени. Важно отметить, что около 50% модификации ДНК-мишени составляют прямые разрывы, не требующие дополнительной обработки для разрушения молекулы мишени. При этом каждому сайту расщепления соответствуют два пятна на радиоавтографе: продукт прямого расщепления, содержащий фосфогликолят, обладает меньшей электрофореческой подвижностью, чем продукт, получаемый при разрушении щелочелабильных сайтов обработкой 1-бутилам и ном. Конъюгат BlmpNn в комплексе 15 при 20 С демонстрирует наименьшую среди всех конъгогатов эффективность - 1.0 (Рис. 18 а, кривая 1). Повышение температуры реакции до 45 С приводит к возрастанию эффективности до 2.1. Аналогичную зависимость эффективности от температуры демонстрирует конъюгат BlmpNg: при увеличении температуры от 20 до 45 С происходит повышение эффективности от 1.2 до 3.5 (Рисунок 18 а, кривая 2). В случае конъюгата BlmpN4 наблюдается противоположная зависимость. Этот конъюгат демонстрирует максимальную эффективность - 6.4 - при 20 С (Рис. 18 6, кривая 1). Близкая зависимость эффективности расщепления от температуры наблюдается для нсконъюгированного блеомицина в присутствии эффектора PhnpN8(l)Phn и тетрануклеотида pCAGC (Рис.18 6, кривая 2). В присутствии дополнительного октануклеотидного эффектора PhnpNa(2)Phn, связывающегося с мишенью D20 в 5 -концевой области, высокая эффективность конъюгата BlmpN4 (6.5) сохраняется в интервале 20-35 С и лишь при более высоких значениях температуры снижается до 2.4 (Рис. 18 б, кривая 3).
Таким образом, наблюдаются две противоположных зависимости эффективности расщепления от температуры реакции. Эффективность длинных конъюгатов (BlmpNg, BlmpNg) увеличивается с повышением температуры, тогда как наиболее эффективный конъюгат BlmpN с ростом температуры частично теряет свою активность. Возможной причиной ограничения активности конъюгатов могло бы быть расщепление олигонуклеотидной части конъюгата его собственным остатком блеомицина. /7 Было исследовано расщепление мишени D20 32Р-мечелыми конъюгатами в присутствие эффекторов. Выяснилось, что олигонуклеотидная часть конъюгата BImpN4 в процессе реакции расщепляется незначительно ( 10%). Конъюгаты BlmpNg и BlmpNn расщепляются на 18-21%. Таким образом, саморасщепление конъюгатов не может существенно снижать их эффективность. Кроме того, предельная степень саморасщепления конъюгатов не зависит от температуры реакции, и практически одинакова при 25 и 45 С. Очевидно, что саморасщепление конъюгатов не может jm объяснить различий в зависимости эффективности конъюгатов от температуры. Была исследована стабильность комплементарных комплексов (выделенные участки в комплексах 12-15 на рис. 16), образуемых конъюгатами с ДНК в присутствии эффекторов. Конъюгат BlmpN4 в присутствии эффектора PhnpN8(l)Phn образует с мишенью D20 комплементарный комплекс с температурой плавления 31 С (комплекс 12). В присутствии дополнительно эффектора PhnpNs(2)Phn температура плавления этого комплекса возрастает до 45 С (комплекс 13). Следует отметить, что температура плавления комплекса конъюгат-мишень определялась по разнице дифференциальных кривых термической денатурации комплексов 12, 13, 14 и 15 и кривых термической денатурации комплексов, образованных эффекторами с ДНК в отсутствие конъюгата. -- Полученная кривая во всех случаях имеет выраженный максимум, по положению 7 которого и оценивали температуру плавления комплекса конъюгат-ДНК. Правильность такой оценки в случае комплекса 13 была дополнительно подтверждена разностной термической денатурацией. В этом случае кривая термической денатурации комплекса конъюгат-ДНК в присутствии эффекторов регистрировалась относительно комплекса эффекторов с ДНК, помещенного в кювету сравнения.
Полученная дифференциальная кривая термической денатурации (жирная линия) практически совпадает с расчетной (тонкая линия) (Рис. 19). Конъюгат BImpNs в присутствии эффектора PhnpNs(l)Phn образует с мишенью D20 комплекс с температурой плавления 57 С (комплекс 14). Наибольшая температура плавления у комплекса, образуемого конъюгатом BlmpNu с мишенью в присутствии эффектора PhnpNs(l)Phn - 63 С (в комплексе 15). Из данных термической денатурации следует, что степень ассоциации комплексов, образуемых конъюгатом BlmpN4 с мишенью D20, приближается к 1 лишь в узком интервале температур 20-25 С в составе комплекса 12 и 20-35 С в комплексе 13. Как видно на рис. 18, в этих температурных интервалах достигается максимальная эффективность расщепления мишени D20 в комплексах 12 и 13. Логично предположить, что снижение эффективности конъюгата BlmpN4 за пределами этих температурных интервалов вызвано снижением степени ассоциации комплекса конъюгат-мишень. Степень ассоциации исходных комплексов конъюгатов BlmpNg и BlmpNi2 по данным термической денатурации близка к 1 во всем исследованном интервале температур. Очевидно, низкая эффективность этих конъюгатов в составе комплексов 14 и 15 при 20-35 С и повышение их эффективности с ростом температуры определяются другими факторами. Для выяснения природы наблюдаемых различий в эффективности конъюгатов мы рассмотрели возможные варианты протекания процесса в каталитической системе исходя из общих представлений о химизме взаимодействия блеомицина с ДНК. Как уже отмечалось в разделе 2.7.1., окислительное воздействие блеомицина на ДНК заключается в гомолитическом разрыве С-Н связи при С(4 ) атоме дезоксирибозы [8]. Образование радикала далее инициирует ряд последовательных превращений, приводящих в конечном счете либо к разрыву цепи ДНК (прямое расщепление), либо к отщеплению гетероциклического основания с образованием щелочелабильного сайта. При прямом расщеплении образуются укороченные фрагменты, один из которых (5 -концевой) содержит на 3 -конце в точке разрыва фосфогликолят, а другой - 5 -фосфат. Во втором случае образуется полноразмерный олигопуклеотид, содержащий в месте повреждения гидроксилированный по С(4 ) остаток дезоксирибозы. Как упоминалось выше, при расщеплении D20 всеми исследованными конъюгатами регистрируется два сайта расщепления - СЮ и А8, причем нуклеотидный остаток СЮ повреждается в значительно большей степени, чем AS (Рис. 17). Поэтому рассмотрение возможных вариантов протекания процесса мы проводили на примере расщепления D20 по нуклеотидному остатку СЮ, считая, что при его модификации образуются продукты pNjrNio и pN9 (Рис. 20).
Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами
Неоднократно было показано, что блеомицин способен расщеплять не только ДНК, но и РНК. Однако, как следует из приведенного обзора литературы, количество сайтов, «узнаваемых» блеомицином, в РНК значительно меньше, чем в ДНК. Ранее не была продемонстрирована возможность расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами. В качестве РНК-мишени для исследования такой возможности был выбран фрагмент R30, гомологичный фрагменту D30 (Рис. 42). Было установлено, что данный фрагмент не расщепляется свободным блеомицином в интервале концентраций 1-10 1СГ6 М (данные не приведены). Известно, что расщепление рибосомальной 5S РНК дрожжей протекает по нуклеотидным остаткам U в 5 -GU-3 последовательностях, расположенных перед однопуклеотидньши петлями [32]. Для формирования подобной петли в мишени R30 был использован 16-звенный олнгодезоксирибонуклеотид N(6 (Рис. 34, комплекс 38). В данном комплексе мишень R30 расщепляется неконъюгированным блеомицином по нуклеотидному остатку Мб, прилегающему к петле, содержащей остаток U7, Степень расщепления составляет 30%. Здесь и далее регистрировались только прямые разрывы цепи РНК, наблюдаемые без дополнительных обработок. Следует отметить, что в составе совершенного гибридного дуплекса, образуемого РНК-мишенью и 17-звенным олигодезоксирибоиуклеотидом 3 - dGCCTCAACCTTTTGTTA -5 мишень R30 не расщепляется неконъюгированным блеомицином (данные не представлены). Как видно из рис. 45, в присутствии конъюгатов Ni6(pL)2pBlm, ІЧіб(рЬ)зрВ1т и ГЧіб(рЬ)4рВ1т, наблюдается расщепление мишени R30 по нуклеотидному остатку U6. Эффективность расщепления зависит от длины линкера, связывающего остаток блеомицина с олигонуклеотидом. Степень расщепления РНК-мишени в комплексе с конъюгатом Ni6(pL)2pBIm, достигает 8%, с конъюгатом Ni6(pL)3pBlm - 12%, а максимальная эффективность расщепления (18%) достигается в комплексе с олигонуклеотидом Ni6(pL)4pBlm, содержащим в линкере четыре остатка гексаэтиленгликольфосфата. Очевидно, конъюгаты ІЧіб(рЬ)2рВІт, ІЧіб(рЬ)зрВ1ііг и Ni6(pL)4pBlm, как и олигонуклеотид Nie, образуют с мишенью R30 дуплекс, содержащий в цепи РНК однонуклеотидную петлю. Степень расщепления РНК-мишени конъюгатом Ni6(pL)4pBlm снижается при добавлении олигонуклеотида N(6, который конкурирует с конъюгатом Ni6(pL)4pBlm за сайт связывания на РНК-мишени (Рис. 46). Полное подавление расщепления достигается при концентрации олигонуклеотида Ni6 1 10"5 М Это указывает, что расщепление РНК-мишени конъюгатами Ni6(pL)2pBlm, Ni6(pL)3pBlm и Ni6(pL)4pBlm носит комплементарно адресованный характер.
Приведенные данные позволяют заключить, что использование олигонуклеотидной части блеомицинсодержащих конъюгатов для формирования несовершенных комплексов, содержащих участки предпочтительного расщепления PI 1К блеомицином, позволяет осуществлять достаточно эффективное комплементарно адресованное расщепление РНК такими конъюгатами. 3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формируюшими олигонуклеотндами (ТФО) Ранее, в работе [113] было показано, что конъюгаты блеомицина с гексадекатимидилатами способны в составе гриплексов расщеплять двуцепочечную ДНК-мишень с умеренной эффективностью. Возможность прямого расщепления обеих цепей двуцепочечной ДНК особенно важна, поскольку такие повреждения наиболее сложны для репарации. Репарация таких повреждений возможна только за счет гомологичной рекомбинации. При наличии корректного доморного фрагмента можно ожидать конверсии мутантного гена, индуцируемой сайт-специфическими двуцепочечными разрывами, наносимыми конъюгатами блеомицина с ТФО, Как было отмечено в разделе 2.8.5., степень расщепления двуцепочечной ДНК немодифицированным блеомицином значительно превышала степень ее расщепления триплекс-формирующими конъюгатами. Мы предположили, что протяженность природного спермидинового линкера, соединяющего остатки блеомицина и олигоиуклеотида, ограничивает способность остатка блеомицина в составе копъюгата связываться с ДНК Б необходимой конформации, В этом случае увеличение длины линкера могло бы облегчить связывание блеомицина в малой бороздке ДНК и привести к увеличению эффективности се расщепления блеомицином.
Ниже представлены данные по повышению эффективности расщепления двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующим олигонуклеотидом за- счет введения дополнительного линкера между остатками олигоиуклеотида и блеомицина. Эксперименты по расщеплению двуцепочечной ДНК триплекс-формирующими конъюгатами блеомицина проводились с использованием синтетической двуцепочечной 30-звенной ДНК МЗО (Рис. 47), удовлетворяющей ряду критериев [113]. Во-первых, она должна содержать протяженную гомопуриновую последовательность, необходимую для образования триплекса. Во-вторых, образующийся триплекс должен быть стабилен при нейтральных значениях рН, поскольку блеомицин наиболее эффективен в интервале рН 7 - 9. В-третьих, последовательность мишени, вовлеченная в образование триплекса, должна быть фланкирована последовательностями, благоприятными для узнавания остатком блеомицина, например GT, GC, AT или GA. Для определения эффективности расщепления конкретной цепи ДНК использовали 3 Р-меченые пурин-богатую (АЗО) или пиримидин-богатую (ТЗО) цепь. Было исследовано расщепление мишени МЗО традиционными конъюгатами ТібрВІш, ВІтрТіб и новыми линкерсодержащими конъюгатами ТібрЬрВІт, BlmpLpT]6, синтез которых описан в разделе 3.1.2. В условиях образования триплекса и в присутствии Fe2+ и р-меркаптоэтанола конъюгаты вызывают расщепление ДНК-мишени. Все конъюгаты расщепляют мишень МЗО вблизи расположения остатка блеомицина. Расщепление цепи АЗО показано на рис. 48, аналогичная картина (данные не приведены) наблюдается для цепи ТЗО. По расщеплению цепей ДНК можно сделать вывод, что третья цепь (конъюгат) связывается параллельно пурин-богатой цепи ДНК, что согласуется с ранее опубликованными данными по расщеплению двуцепочечной ДНК триплекс-формирующими конъюгатами олигонуклеотидов с этилендиаминтетраацетатом железа(Ш) [129]. Расщепление МЗО конъюгатами T pLpBlm и BlmpLpTie протекает по тем же сайтам, что и расщепление конъюгатами ТібрВІш и В1трТі6 (Рис. 48). Конъюгаты Ti6pLpBlm и ВІтрЬрТіб расщепляют обе цепи МЗО более эффективно, чем конъюгаты T,6-BIm и BIm-Тіб (Рис.49). Например, конъюгат Ti6pLpBIm расщепляет 61% цепи АЗО, тогда как степень расщепления этой же цепи конъюгатом Ti6-Blm составляет лишь 41%. В условиях избытка конъюгата обе цепи мишени подвержены слабому неспецифическому расщеплению. Эти «неспецифические» сайты повреждаются также в реакции с неконъюгированным блеомицином (степень расщепления достигает 34 %, рис. 48, дорожка 6) и контрольным конъюгатом, не образующим триплекса (до 5 %, рис. 48, дорожка 7).
Похожие диссертации на Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами
![Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола](/i/i/4301/324197.png "Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола Белоглазова Наталья Геннадьевна")
