Содержание к диссертации
Введение
1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕДИ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (Обзор литературы)
1.1. Взаимодействие ионов меди с нуклеиновыми и кислотами
1.1.1. Связывание ионов меди с нуклеиновыми кислотами 11
1.1.2. Механизм реакции Фентона 12
1.1.3. Взаимодействие активных форм кислорода с нуклеиновыми кислотами
21
1.1.4. Реакция Фентона in vivo 21
1.1.4.1. Мутации в ДНК, возникающие под действием кислородных радикалов 24
1.1.4.2. Воспаление и окислительный стресс
1.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ И МЕДЬ-ЗАВИСИМЫМИ СИСТЕМАМИ 26
1.2.1. Комплексы меди, осуществляющие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот 26
1.2.1.1. Комплексы меди и медь-зависимые системы, осуществляющие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот в присутствии тиолов
1.2.1.2. Окислительная деструкция нуклеиновых кислот комплексами меди, действующими без активации экзогенными окислителями или восстановителями
1.2.2. Комплексы меди, осуществляющие гидролитическую деструкцию нуклеиновых кислот
1.3. САЙТ-НАПРАВЛЕННОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ 57
КИСЛОТ КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С
КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ
1.3.1. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 58 комплексами меди в двуцепочечном комплексе
1.3.2. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 62 комплексами меди в триплексе
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 64
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы и оборудование
2.1.2. Олигонуклеотиды
2.1.3. Буферные растворы, используемые в работе 65
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Введение [ Р]-метки по концу олигонуклеотида
2.2.2. Производные олигонуклеотидов
2.2.3. Выделение суспензионного хроматина из плаценты человека
2.2.4. Выделение растворимой фракции хроматина из плаценты человека
2.2.5. Отделение гистона НІ от хроматина
2.2.6. Выделение нуклеосом
2.2.7. Анализ препаратов на содержание коровых гистонов и ДНК нуклеосомной длины
2.2.8. Реконструкция нуклеосомной цепи на фрагменте ДНК
2.2.9. Депротеинизация
2.2.10. Приготовление компетентных клеток
2.2.11. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК 70
2.2.13. Амплификация фрагмента ДНК промотора гена c-fos 71
2.2.14. Очистка ПЦР-продуктов 72
2.2.15. Модификация ДНК алкилирующим производным олигонуклеотида
2.2.16. Реакция ДНК с DEPC 72
2.2.17. Картирование местоположения гистонового октамера микрококковой нуклеазой
2.2.18. Картирование местоположения гистонового октамера с помощью 0-бромбензойной кислоты
2.2.19. Расщепление фрагмента ДНК по пуринам методом Максама-Гилберта 73
2.2.20. Регистрация спектров ЭПР спиновой ловушки 73
2.2.21. Регистрация спектров ЭПР комплексов меди в присутствии остатков гуанина или олигонуклеотидов. 74
2.2.22. Расщепление ДНК плазмиды в системе арен/медь 75
2.2.22. Расщепление олигонуклеотидов в системе арен/медь
2.2.23. Модификация ДНК конъюгатом олигонуклеотида с фталоцианином кобальта(Н)
2.2.24. Расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с блеомицином As
2.2.25. Расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с 5-( амино-пропил-сульфамоилом)-2-бромбензойной кислоты
.РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК АРЕНАМИ И ИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ КОНЪЮГАТАМИ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Си(Н) (Результаты и
обсуждение) 777
3.1. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК ЗАМЕЩЕННЫМИ БЕНЗОЙНЫМИ 77
КИСЛОТАМИ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Си(П)
3.1.1. Расщепление ДНК аренами различной структуры в 77 присутствии ионов Cu(II)
3.1.2. Исследование закономерностей расщепления ДНК под действием 0-бромбензойной кислоты в присутствии ионов Cu(II) 88
3.1.3. Исследование специфичности расщепления ДНК под действием о-бромбензойной кислоты в присутствии ионов Cufll)
3.1.4. Исследование связывания ионов меди с ДНК в системе Си(11) бромбеюойная кислота
3.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ БРОМБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ В ПРИСУТСТВИИ ионов
Cu(II)
3.2.1. Выбор модели и синтез конъюгата олигонуклеотида с остатком 0-бромбензойной кислоты
3.2.2. Расщепление ДНК ареновым производны олигонуклеотида в дуплексе
3.2.3. Расщепление двуцепочечной ДНК ареновым производным олигонуклеотида в триплексе
3.3. САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК В СОСТАВЕ РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ НУКЛЕОСОМНОЙ ЦЕПИ
3.3.1. Применение системы Си(П)/о-бромбензойная кислота для 111 картирования ДНК-белковых взаимодействий на примере реконструированной нуклеосомной цепи.
3.3.2. Сайт-направленное алкилирование ДНК в составе 113 реконструированной нуклеосомной цепи в условиях образования специфического трехтяжевого комплекса
Выводы 116
Список литературы 118
- Взаимодействие ионов меди с нуклеиновыми и кислотами
- Введение [ Р]-метки по концу олигонуклеотида
- Расщепление ДНК аренами различной структуры в 77 присутствии ионов Cu(II)
Введение к работе
Создание химических соединений, способных расщеплять ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, необходимо для развития ряда областей молекулярной биологии и для разработки терапевтических препаратов регулирующих экспрессию генов [1, 2]. Такие соединения могут быть получены путем присоединения реакционноспособных групп к олигонуклеотидам, взаимодействующим с определенными нуклеотидными последовательностям ДНК [3, 4]. Важным, не решенным вопросом конструирования таких соединений, является разработка реакционноспособных групп, которые могли бы высокоэффективно расщеплять или химически модифицировать ДНК в физиологических условиях. На сегодняшний день создан широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группы, комплексы переходных металлов, катализирующие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот (EDTA-железо, порфирин-железо, 1,10-фенантролин-медь блеомицин-железо) [5-12]. Реагенты последнего типа способны расщеплять или модифицировать ДНК и РНК в аэробных условиях в присутствии восстановителей или доноров активного кислорода. Однако направленная модификация ДНК ни одним из описанных реагентов не достигает в физиологических условиях биологически значимых уровней.
В настоящее время не вполне выясненным является вопрос о формировании комплексов олигонуклеотидов с клеточной ДНК. ДНК клетки упакована в регулярно повторяющиеся нуклеопротеиновые структуры - нуклеосомы, и расплетение её цепей является редким событием [13,14]. Уотсон-Криковское связывание олигонуклеотидов может происходить только по расплетенным одноцепочечным участкам ДНК, появляющимся в составе активного хроматина [15]. С нерасплетенной двуцепочечной ДНК олигонуклеотиды могут образовывать комплексы путем формирования трехтяжевых структур, в районах с гомопуриновыми-гомопиримидиновыми последовательностями. Большая бороздка ДНК, упакованной в нуклеосому, периодически обращена к поверхности гистонового октамера [16], и в этом случае экранирована коровыми гистонами, что должно препятствовать образованию комплекса с олигонуклеотидом. Поэтому, исследование влияния упаковки ДНК в нуклеосому на ззаимодействие с олигонуклеотидами является актуальной задачей. Локализация гистоновых октамеров на ДНК и экранированность белками последовательностей-мишеней ДНК могут быть определены методами футпринтинга: с помощью ферментов, ДНКазы I, микрококковой нуклеазы и химических реагентов [17, 18] В качестве реагентов для такого футпринтинга могут быть использованы и металлокомплексы [19,20].
В настоящей работе исследовали возможность создания на основе галоген-замещенных производных бензойной кислоты реакционноспособных производных олигонуклеотидов как для направленного расщепления ДНК так и для изучения структуры ДНК-белковых комплексов. В отличие от органических растворителей, в водных растворах медные комплексы бензойных кислот обладают пониженной стабильностью, что позволит добиться снижения степени неселективной деградации ДНК [21,22].
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось создание новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследование закономерностей их действия в присутствии ионов меди (II).
В ходе исследования решались следующие задачи:
Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов Cu(II) и установление закономерностей этой реакции.
Исследование свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе о-бромбензойной кислоты как реагента для сайт-направленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. Сравнительное исследование расщепления ДНК под действием этого производного олигонуклеотида и производных олигонуклеотидов, несущих в качестве реакционноспособных групп фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5.
3. Возможность применения системы Си(П)/о-бромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов.
Взаимодействие ионов меди с нуклеиновыми и кислотами
Медь является одним из микроэлементов, определенная концентрация которого важна для функционирования живой клетки, а его избыток или недостаток приводит к развитию патологических состояний организма [23]. С одной стороны, ионы меди в организме являются кофакторами для множества ферментов, таких как цитохром с оксидаза, Cu/Zn супероксиддисмутаза, церулоплазмин, тирозиназа, лизил оксидаза, дофамин монооксигеназа [24], большинство из которых катализируют окислительно-восстановительные реакции, где ко-субстратом является молекулярный кислород. С другой стороны, медь - сильнейший яд, её избыток в организме ведет к повреждению клеток.
Ионы меди и их комплексы in vivo индуцируют образование реакционно-способных кислородных частиц, вызывающих окислительное повреждение важнейших биомолекул, главным образом ДНК и липидов клеточных мембран. Расщепление цепи ДНК и модификация азотистых оснований в клетке может приводить к мутагенезу и карценогенезу. В настоящее время известно множество как природных, так и синтетических комплексов меди, вызывающих повреждение нуклеиновых кислот; имеются также соединения, не образующие комплексов с ионами Cu(II), однако способные расщеплять ДНК в их присутствии, так называемые медь-зависимые системы. Некоторые из металлокомплексов, например фенантролины, блеомицины, комплексы І меди с аминогликозидами, трипиридины представляют интерес для конструирования реагентов, направленно повреждающих нуклеиновые кислоты; другие соединения, такие как тиолы, NADH, витамин Е исследуются для моделирования медь-зависимых окислительных процессов, протекающих внутри клетки [8,25-28].
Задачей обзора является рассмотрение данных по повреждению нуклеиновых кислот свободными комплексами меди и их конъюгатами с олигонуклеотидами.
Введение [ Р]-метки по концу олигонуклеотида
Введение [ Р]-метки по 5 -концу олигонуклеотидов проводили с помощью [у- Р]-АТР и полинуклеотид киназы фага Т4. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0.02 ОЕ2бо олигонуклеотида в буфере ПК, 100 мкКи [у-32Р]-АТР, 10 е.а. Т4-полинуклеоти киназы. Реакционную смесь инкубировали 1 ч при 37 С, по окончании инкубации к реакционной смеси добавляли 15 мкл БДН 2 и наносили на 20%-ный ПААГ, содержащий 8 М мочевину. Электрофорез проводили при 900 В в течение 2-2.5 ч в буфере ТВЕ. По окончании электрофореза гель экспонировали на рентгеновскую пленку "Ренекс" в течение 1 мин и вырезали полосу, соответствующую олигонуклеотиду. Из геля олигонуклеотид электроэлюировали на DEAE - бумагу в буфере ТБЕх0,1 в течение 30 мин при напряжении 120 В. Меченый олигонуклеотид элюировали с бумаги раствором горячего 2 М ІЛСІО4 последовательно порциями по 20 мкл. Олигонуклеотидный материал осаждали из раствора добавлением 10 объемов 2%-ного раствора перхлората лития в ацетоне. Осадок олигонуклеотида отделяли центрифугированием (12 000 об/мин, 10 мин), промывали ацетоном, высушивали и растворяли в 50 мкл раствора 10 мМ трис-HCl, рН 8.0.
class3 РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК АРЕНАМИ И ИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ КОНЪЮГАТАМИ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Си(Н) (Результаты и
обсуждение) class3
Мы предложили использовать для повреждения ДНК систему Си /арен, где арены представлены одно ИЛИ три-замещенными бензойными кислотами. Из литературных данных известно, что бензойные кислоты, несущие атом галогена в орто положении являются хорошими лигандами ионов Cu(II) только в органических средах
[21, 22], а в водных растворах они не способны образовывать достаточно прочные комплексы. Замещенные бензойные кислоты являются несложными с точки зрения синтеза, кроме того, ионы меди способны одновременно координировать две молекулы галоген-замещенной бензойной кислоты, что позволяет рассматривать такие комплексы в качестве возможных катализаторов расщепления ДНК в бинарных системах на основе олигонуклеотидных производных [21, 22]. Вышеперечисленные основания обусловили выбор замещенных бензойных кислот в качестве реагентов для металл-зависимого расщепления нуклеиновых кислот.
Для исследования ДНК-расщепляющей активности были выбраны орто- и пара-изомеры арилгалогенидов, несущие атом брома или хлора (табл. 1). Известно, что в реакциях нуклеофильного замещения, протекающих в условиях катализа ионом металла в органических растворителях, варьирсзание атомов галогенов и положения заместителей в бензольном кольце, может изменять скорости реакции с нуклеофильными центрами биополимеров на несколько порядков [21]. В качестве модельной ДНК, была использована ДНК плазмиды pMDRCAT5, содержащая фрагмент промотора гена mdrl [215]. Ген mdrl представляет большой интерес для исследований, поскольку кодирует белок Р-гликопротеин, являющийся трансмембранным насосом с широкой субстратной специфичностью. Гиперэкспрессия этого гена приводит к выработке у клетки устойчивости к широкому кругу лекарственных препаратов, применяемых в лечении онкологических заболеваний [231].
