Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Поиск новых лекарственных препаратов на основе стероидных эстрогенов 7
1.1.1. Эстрогены как кардиопротекторы 7
1.1.1.1. Антиоксиданты на основе эстрогенов 8
1.1.1.2. Липопротеины высокой плотности. Антиатерогенные свойства и способы коррекции их уровня 15
1.1.1.3. Геномные пути кардиопротекторного действия эстрогенов. Участие эстрогенов в вазодилатации посредством путем NO 17
1.1.1.4. Влияние эстрогенов на белки теплового шока 18
1.2. Побочные эффекты действия эстрогенов и пути их устранения 20
1.2.1. Эстрогены и гормональный канцерогенез 20
1.2.2. Поиск противоопухолевых препаратов на основе модифицированных эстрогенов 28
1.2.3. Аналоги эстрогенов, не обладающие канцерогенными свойствами 34
1.3. Методы синтеза аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 40
Глава 2. Обсуждение результатов 44
2.1. Постановка задачи 44
2.2. Выбор пути синтеза целевых соединений. Синтез 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона 50
2.3. Синтез 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8-эстра-1,3,5(10)-триен 17а-она (8) 53
2.4. Синтез 17а-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-D-гомо-1,3,5(10)-эстра-триена (10) 56
2.5. Синтез 16-метил-2-фтор-13-эстра-1,3,5(10),8,15-пентаен-17-она (11) 58 2.6. Синтез 8-аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 и свободную гидроксильную группу в положении 3 62
2.7. Синтез 18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),6,8(9)-пентаен-17-она (18) 66
2.8. Синтез сульфаматов аналогов эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 67
2.9. Исследование возможности синтеза целевых соединений фторированием субстратов со сформированным стероидным скелетом 68
2.10. Исследование антиоксидантной активности модифицированных эстрогенов 70
Глава 3. Экспериментальная часть 75
3.1. Синтез целевых соединений 75
3.2. Исследование биологических свойств 101
Выводы 108
Список литературы
- Геномные пути кардиопротекторного действия эстрогенов. Участие эстрогенов в вазодилатации посредством путем NO
- Поиск противоопухолевых препаратов на основе модифицированных эстрогенов
- Синтез 17а-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-D-гомо-1,3,5(10)-эстра-триена (10)
- Исследование биологических свойств
Геномные пути кардиопротекторного действия эстрогенов. Участие эстрогенов в вазодилатации посредством путем NO
Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в развитых странах увеличилась с начала XX века в несколько раз и продолжает расти, составляя с 1980 года более 50% от всех случаев смерти [4]. Клинические и эпидемиологические исследования позволили установить отличия в уровнях смертности от ишемической болезни сердца (ИБС) и частоты перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) у мужчин и женщин, причем соотношение больных в зависимости от пола составляет от 2:1 до 4:1 соответственно [5]. Более низкий риск возникновения ССЗ у женщин сохраняется лишь до определенного возраста, по достижении которого это различие по половому признаку постепенно исчезает. Переломным моментом между периодами с относительно низкой и высокой вероятностью появления коронарных сердечных заболеваний в жизни женщины является наступление менопаузы - прекращение функции яичников [6].
Это позволило предположить, что эстрогены являются протекторами от сердечно-сосудистых болезней [7]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о более низкой частоте сердечно-сосудистых заболеваний у женщин в период пременопаузы по сравнению с мужчинами того же возраста [8], однако физиологическая основа защитного эффекта эстрогенов недостаточно изучена.
С наступлением менопаузы риск коронарного атеросклероза и ишемии можно свести к минимуму, поддерживая гормональный фон с помощью заместительной гормональной терапии [9]. Пути реализации этого влияния становятся понятными при объяснении механизмов защитного действия эстрогенов на ССС, которые могут быть разделены на группы: 1) влияние на метаболизм липидов и липопротеинов; 2) прямое действие на стенку сосудов по геномному механизму с выработкой оксида азота NO, вызывающего вазолидацию; 3) выработка белков теплового шока. Концепция кардиопротекторного влияния эстрогенных лекарственных препаратов основана, как уже отмечалось, на большом клиническом материале, свидетельствующем о способности эстрогенов предотвращать и задерживать развитие ИБС, артериальной гипертонии, пароксизмальных форм нарушения сердечного ритма (НРС), атеросклероза [7].
Свободные радикалы в условиях человеческого организма могут проявлять достаточно большую реакционную способность и повреждать множество мишеней, включая липиды, нуклеиновые кислоты и белки, что объясняет их участие в ряде заболеваний, таких как атеросклероз [10–12], рак [13] и нейроде-генеративные заболевания (болезнь Альцгеймера) [14].
Атеросклероз является основной причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, его возникновение в основном обусловлено процессами свободно-радикального окисления липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в крови с их последующим отложением на стенках аорт (Рисунок 1.1) [15].
Эстрогены являются мощными антиоксидантами, которые могут действовать независимо от их связывания с рецепторами эстрогенов и гормональной функции [16–19]. 17-Эстрадиол (Е2) ингибирует активность микросомальной пероксидазы и тормозит процессы перекисного окисления мембранных липи-дов в концентрациях, близких к физиологическим. Рисунок 1.1. Окисление липопротеинов низкой плотности как основная причина развития атеросклероза. Макрофаги, подвергаясь воздействию модифицирован-ных ЛПНП, экспрессируют на своей поверхности специфические сквенжер-ре-цепторы, которые связывают частицы ЛПНП. Макрофаг, по мере переполнения его цитозоля холестерином, приобретает гистологические характеристики так называемой пенистой пленки. Пенистые клетки подвергаются апоптозу и нек-розу, в конечном счете, способствуя формированию и прогрессированию некротической сердцевины атеросклеротических бляшек [20]. Исследования, направленные на детальное изучение взаимодействия эст-рона и 17-бутилового эфира Е2 с гидроксильным радикалом, привели к открытию циклического механизма антиоксидантного действия эстрогенов (схема 1.1), который включает следующие стадии:
1) нейтрализацию гидроксильного или перекисных радикалов стероидами с ароматическим кольцом А, сопровождаемую образованием феноксильных радикалов и дальнейшим превращением последних в неароматические п-хиноны;
2) НАД(Ф)Н-зависимую восстановительную ароматизацию хинонов, фактически представляющую собой регенерацию фенольных соединений [21]. Липофильные стероиды, в отличие от многих низкомолекулярных антиок-сидантов, избирательно проникают в гидрофобные области клеточных мембран, где и проявляют защитный эффект, ингибируя процессы свободноради-кального окисления ферментов, ионных каналов, структурных белков и липи-дов. В связи с этим лекарственные средства на основе модифицированных эстрогенов могут найти применение для профилактики и лечения различных заболеваний, в том числе ишемических и реперфузионных повреждений органов, дегенеративных заболеваний ЦНС, атеросклероза, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, вирусного гепатита, аллергических реакций и др.
J. Perrella c коллегами проводили исследования антиоксидантной активности эстрогенов, сульфаты которых являются (за исключением эстра-1,3,5(10),8-тетраен-17-диола) компонентами эстроген-заместительного препарата СEE (conjugated equine estrogens; Premarin, Wyeth Pharmacuuticals, PA, USA) (Рисунок 1.2) [22]. Рисунок 1.2. Структуры соединений, исследованных в работе [22]. Было показано, что исследованные эстрогены защищают липопротеины высокой плотности (ЛПВП) от окисления, причем эквиленин, 17-дигидроэк-виленин, и 17-дигидроэквиленин оказались наиболее эффективными: при наличии ненасыщенного B-кольца в 2.54 раза увеличивается способность ингиби-ровать окисление ЛПВП по сравнению с 17-эстрадиолом (Рисунок 1.3).
Производные природных эстрогенов Е2 (I), Е1 (II) и Е3 (III), предлагаемые для профилактики и терапии свободнорадикальных патологий, включают большую группу соединений, содержащих различные заместители в кольцах A-D стероидного скелета и/или дополнительные двойные связи. Ниже показаны структуры некоторых модифицированных эстрогенов, а также приведены результаты опытов in vitro по определению их антиоксидантной активности и относительной конкурентной активности (ОКА) к рецепторам эстрогенов из матки кролика (табл. 1.1) [23].
Поиск противоопухолевых препаратов на основе модифицированных эстрогенов
220 мг (0.67 ммоль) секосоединения 46 растворяли в 20 мл толуола, добавляли 20 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Реакционную смесь кипятили с об-ратным холодильником 4 ч, оставляли на ночь при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ в системе гексан-этилацетат (2:1). Утром реакционную смесь промывали 5% раствором соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на ротационном испарителе. Получали 176 мг (85%) эстрапентаена 11, т. пл. 170-172С.
Спектр ЯМР 1Я (CDC13, 5, м.д.): 1.20 с (ЗН, Н18), 1.18-1.32 м (Ш), 1.56-1.66 м (Ш), 1.80 с (ЗН), 1.88-1.97 м (Ш), 2.01-2.11 м (Ш), 2.18-2.31 м (Ш), 2.37-2.50 м (1 Н), 2.66-2.80 м (2Н), 3.04 с (Ш, Н14), 5.69 уш. с (Ш, ОН), 6.80 д (Ш, Н4, JHF=8.7 ГЦ), 6.87 д (Ш, Н1,1Ш=\23 Гц).
Спектр ЯМР 13С (CDC13, 5, м.д.): 10.8, 22.8 (СН2), 23.3, 27.91 (СН2), 28.1 (СН2), 30.1 (СН2), 32.0 (СН2), 47.5, 53.8, 110.3 д (С1, J=19.1 Гц), 116.6, 128.7, 129.3 д (С10, J=5.3 Гц), 131.0, 131.9, 138.76, 142.0 д (С3, J=13.7 Гц), 150.2 д (С2, J=234.1 Гц), 214.8 (С=0). HRMS (ESIOF), вычислено для Ci9H20FO2 (М+Н)+: 299.1442; найдено: 299.1456. 3-Гидрокси-18-метил-2-фтор-8,14-секо-эстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен-14,17-дион (48)
В трёхгорлую колбу объемом 250 мл, снабженную обратным холодильником, капельной воронкой и термометром, помещали 4.2 г Mg, 40 мл абс. ТГФ, 2 кап-ли 1,2-дибромэтана и медленно прикапывали раствор 18 мл винилбромида в 30 мл ТГФ так, чтобы температура не поднималась выше 38оС. Далее раствор пе-ремешивали 1 ч при 35-38оС. К полученному винилмагнийбромиду, охлажден-ному до -14 оС, медленно прикапывали раствор 4.0 г (0.022 моль) 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) в 30 мл ТГФ так, чтобы температура не поднималась вы-ше -10 оС. Затем перемешивали еще 2 ч при этой температуре и оставляли на ночь.
На следующий день перемешивали реакционную смесь 1 ч при 40 оС , выливали в смесь 0.5 кг льда, 10 г NH4CI, 100 мл Н2О, экстрагировали эфиром. Эфирную вытяжку промывали дважды водой, сушили Na2SC 4, растворитель отгоняли на ротационном испарителе при температуре бани не выше 25оС. К полученному винилкарбинолу 44 добавляли 4.15 г (0.033 моль) 2-этил-1,3-циклопентандиона, 530 мг КОН, 130 мл МеОН, кипятили с обратным холодильником 4 ч. Раство-ритель удаляли на ротационном испарителе, полученную смесь выливали в 100 мл дистиллированной воды, подкисляли 2% раствором Н2S04 до слабокислой сре-ды, экстрагировали эфиром (3х50 мл). Объединенные органические фазы промывали 2 раза водой, насыщенным раствором соды. Водные фракции объединяли, подкисляли до рН 0, экстрагировали диэтиловым эфиром, сушили над Na2S04, растворитель удаляли на ротационном испарителе, получали 530 мг исходного тетралона 36. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, растворитель отгоняли на ротационном испарителе, остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/петролейный эфир. Получали 3.98 г (62% в расчете на вступившее в реакцию исходное вещество) секосоединения 48, т. пл. 145-146 оС.
Найдено, %: С 72.18; Н 6.80. Ci9H21F03. Вычислено, %: С 72.13; Н 6.69. 3-Гидрокси-18-метил-2-фтор-эстра-1,3,5(10),8,14-пентаен-17-он (49) а) 800 мг (0.0025 моль) секосоединения 48 растворяли в 60 мл толуола, добавляли 65 мг моногидрата п-толуолсульфокислоты. Кипятили 20 мин, затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, промывали 5% рас твором соды, водой, насыщенным раствором NaCl. Толуол отгоняли на ротационном испарителе. Получали 700 мг (93%) эстрапентаена 49, т. пл. 125 126 С. Спектр ЯМР 1Я (CDC13, 5, м.д.): 0.86 т (ЗН, Н18а, J=7.3 Гц), 1.54-1.72 м (4Н, Н1218), 2.15-2.20 м (Ш), 2.31-2.37 м (Ш), 2.52-2.78 м (5Н), 2.96 д (Ш, Н16, J=23.0 Гц ), 3.18 д (Ш, Н16, J=23.0 Гц ), 5.63 уш. с (Ш, ОН), 5.98 с (Ш, Н15), 6.82 д (Ш, Н4, JHF=8.7 ГЦ), 7.02 д (Ш, Н1,1Ш=\2Л Гц).
Спектр ЯМР 13С (CDC13, 5, м.д.): 8.7, 23.3 (СН2), 23.4 (СН2), 26.1 (СН2), 26.9 (СН2), 27.9 (СН2), 44.1 (СН2), 53.4, 110.8 д (С1, J=20.0 Гц), 116.7, 116.9, 126.9, 129.2 д (С10, J=5.9 Гц), 129.4, 133.4, 142.4 д (С3, J=13.9 Гц), 146.1, 150.1 д (С2, J=233.4 Гц), 216.3 (С=0). HRMS (ESIOF), вычислено для Ci9H20FO2 (М+Н)+: 299.1442; найдено: 299.1439. Найдено, %: С 76.01; Н 6.64. Ci9H19F02. Вычислено, %: С 76.49; Н 6.42. б) 200 мг (0.63 ммоль) секосоединения 48 растворяли в 4 мл метанола, до бавляли 1 мл НС1, смесь кипятили 1 ч на водяной бане. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду и экстрагировали СИСЬ (3х30 мл). Органические слои промывали водой, сушили над Na2S04. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Получили 160 мг (85%) эстрапентаена 49, т. пл. 123-125оС. в) 200 мг (0.63 ммоль) секосоединения 48 растворяли в 4 мл метанола, добав-ляли 1 мл соляной кислоты и перемешивали при комнатной температуре трое суток. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выли-вали в воду и экстрагировали СНС13 (3х30 мл). Органические слои промывали водой, сушили над Na2S04. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе. Получали 105 мг (57%) эстрапентаена 49. Т. пл. 121-123оС.
340 мг (1.14 ммоль) эстрапентаена 49 растворяли в 20 мл абсолютного метано-ла, добавляли 120 мг 10% Pd/C. Через раствор пропускали водород в течение двух часов. Контроль за протеканием реакции проводили методом ТСХ в сис-теме гексан-этилацетат (2:1) с последующим проявлением в растворе H2SO4 в МеОН при нагревании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали, промывали СНС13. Растворители отгоняли на ротационном испарителе, полученный твердый остаток кристаллизовали из метанола.
Синтез 17а-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-D-гомо-1,3,5(10)-эстра-триена (10)
Исследование биологических свойств в опытах на крысах показало, что под действием стероида 10 снижается уровень холестерина в сыворотке крови, но вместе с этим повышается содержание тригли церидов в крови, что является фактором риска воз никновения сердечно-сосудистых заболеваний. . . н і СОон Однако при комбинированном действии стероида 10 и урсоловой кислоты (43) нежелательного повы шения уровня триглицеридов не происходит, тогда как гипохолестеринемичес кое действие соединения 10 сохраняется (таб. 2.2). Целесообразность комбини рованного использования стероида 10 и урсоловой кислоты (43) обусловлена также тем, что последняя обладает рядом полезных биологических свойств. Из вестны её антимикробные, гепатопротекторные, противовоспалительные, анти аллергические, противовирусные, цитотоксические, противоопухолевые свой ства [114-117]. Следует также отметить доступность урсоловой кислоты: она обнаружена более, чем в сотне растений [118-120]. Таблица 2.2 Биологические свойства стероида Группа животных Утеротропная активность Содержание липидов в сыворотке крови Вес матки(мг)/100 г весатела Содержаниерецепторовпрогестерона,фмоль/100 мгбелка Холестерин , мг/дл Триглицерид ы,мг/дл
6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) с винилмагнийбромидом в обычных условиях привела к получению винилкарбинола 44, который без дальнейшей очистки использовали для получения секосоединения 46 конденсацией с 2,4-диметил-1,3-циклопентандионом (45) (дикетон 45 получен конденсацией 2-метилянтарной кислоты с пропионилхлоридом в присутствии безводного АІСІз [121]). Выход на 2 стадии составил 50%. Ключевая стадия - циклодегидратация секосоединения 46 с образованием соединения 11. Такое направление реакции, а именно образование не «торговского» эстрапентаена, а его изомера, обусловлено дополнительной стабилизацией двойной связи 15(16) метальной группой при С-16.
Наличие соответствующего кросс-пика на спектре NOESY соединения 11 (Рисунок 2.3) свидетельствует о пространственной близости протона при С-14 и протонами метильной группы в положении 13 и подтверждает цис-сочленение колец С и D.
Рисунок 2.3. Спектр NOESY аналога 11 Исследование биологических свойств в опытах на крысах показало, что под действием соединения 11 повышается содержание липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в крови. Поскольку под влиянием ЛПВП активируется «обратный транспорт» холестерина из пораженных сосудов, что предотвращает развитие атеросклероза, этот результат представляет особый интерес.
Мы уже указывали, что под действием типичных эстрогенов повышается содержание триглицеридов в крови, и это рассматривается как независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. У 3-гидрокси-16-метил-2-фтор-13а-эстра-1,3,5(10),8(9),15-пентаен-17-она (11) этого негативного эффекта нет (таб. 2.3).
Методом определения активности люциферазы в тестах на клеточной линии «MELN» было показано, что соединение 11 не проявляет гормональную активность при концентрации стероида 1-10 nM (Рисунок 2.4.), а при концентрации 100 nM его гормональная активность сравнима с активностью 17-эстрадиола в концентрации 1 pM. Важно, что в диапазоне концентраций 1-100 nM стероид 11 не влияет на процесс пролиферации клеток MCF-7 (Рисунок 2.5).
Докинг в лиганд-связывающий карман ER аналога 11 (рис 2.7) указывал на возможность связывания с рецептором. Методом вестерн-блоттинга мы подтвердили это предположение (Рисунок 2.6). Рисунок 2.4. Определение гормональной активности стероида 11 в тестах на клетках MELN Рисунок 2.5. Определение пролиферативной активности стероида 11 в тестах на клетках MCF-7 Рисунок 2.6. Определение сродства соединения 11 (обозначено как S5) к рецептору эстрогенов методом вестерн-блоттинга Рисунок 2.7. Результат докинга стероида 11 в лиганд-связывающий карман ER (AutoDock) Таким образом, можно предположить, соединение 11, является частичным агонистом рецепторов эстрогенов, что проявляется в пониженной гормональной активности. 2.6. Синтез 8-аналогов стероидных эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 и свободную гидроксильную группу в положении 3 Реакция 6-гидрокси-7-фтор-1-тетралона (36) с винилмагнийбромидом в обычных условиях привела к получению винилкарбинола 44, который без дальнейшей очистки использовали для получения секосоединения 48 путем конденсации с 2-этилциклопентан-1,3-дионом в щелочной среде. Выход на 2 стадии составил 62% (схема 2.7).
Таким образом, лучшими условиями циклодегидратации секосоединения 48 является использование п-толуолсульфокислоты в толуоле, в данных условиях время реакции составляет 20 мин, за это время не происходит осмоления реакционной смеси, что мы наблюдали при проведении реакции в других приведенных условиях.
Принципиальной задачей являлся подбор условий каталитического гидрирования. Традиционно в химии стероидов для увеличения селективности каталитического гидрирования системы сопряжённых связей предварительно восстанавливают кетогруппу в положении 17 с последующим ацетилированием уксусным ангидридом в пиридине (схема 2.9):
С целью сокращения числа стадий синтеза мы исследовали возможность каталитического гидрирования непосредственно эстрапентаена 49. Основным продуктом гидрирования эстрапентаена 49 в тетрагидрофуране оказалось производное эквиленина 53. Об ароматизации кольца B свидетельствует наличие сигналов двух ароматических протонов на спектре ЯМР 1H (схема 2.10).
Применение в качестве растворителя бензола также не привело к получению целевого продукта: из реакционной смеси было выделено только исходное соединение 49.
Положительного результата удалось достичь при гидрировании в метаноле (схема 2.10). Целевой 18-метил-2-фтор-8-эстрон (14) был выделен из реакционной смеси кристаллизацией из метанола. Небольшой выход продукта (30%) несколько компенсируется тем, что применявшуюся ранее схему удалось сократить на 4 стадии.
Аналогично осуществлен полный синтез соединений 15 и 16 (схема 6). Схема 2.11 Интересно отметить, что гидрирование «торговских» эстрапентаенов 49, 55 и 57 в метаноле проходило аномально быстро, время реакции не превышало 2 ч (мониторинг реакции гидрирования проводился методом ТСХ каждые 10-15 мин). Строение полученных соединений 14-16 доказывали методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С. Сигнал 9- протона находится в области 2.59-2.64 м.д., в случае его -ориентации он находился бы в районе 3.0-3.2 м.д.. Полученные стероиды 14-16 не относятся к природному ряду (8, 9, 14), так как в случае природного сочленения колец величина ХС протона при С-1 выше на 0.2 м.д.
Исследование биологических свойств
Удаляли культуральную среду из чашки Петри, клетки промывали 2 мл р-ра EDTA 3-4 мин. После этого клетки инкубировали с 3-4 мл р-ра трипсин/ EDTA в течение 5 мин. Процесс останавливали добавлением равного объема среды M3. Далее переносили клетки в 15мл/50мл пробирку Фалькона (Falcon tubes) и центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, после чего среду удаляли, клетки ресуспензировали в культуральной среде. Число клеток в клеточной суспензии определяли подсчетом с помощью гемацитометра Нойбауэра. Далее помещали необходимое число клеток в лунки необходимого для эксперимента планшета.
Оценка гормональной активности соединений методом определения активности люциферазы (luciferase assay)
Помещали MELN-клетки в 6-луночный планшет в количестве 3 x 105 клеток на лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3, 2 мл на лунку). Через 24 ч клетки помещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 2% DCC-FBS. Далее клетки стимулировали исследуемым соединением. По истечению инкубационного периода (16 ч.) отмывали клетки от культуральной среды 100 мкл PBS, лизировали в течение 30 мин при 0C инкубированием со 150 мкл лизи-рующего буфера. Затем собрали клетки скребком, ресуспендировали лизаты и переносили их в промаркированные микропробирки Эппендорфа. Далее центрифугировали лизаты в течение 10 мин при 4C. Для избавления от осадка ли-заты переносили в новые микропробирки Эппендорфа. Смешивали в кювете 100 мкл реагента «luciferase assay reagent» (Promega, Mannheim, Germany) с 20 мкл полученного лизата клеток и измеряли люминесценцию в течение 1 минуты на люминометре Luminometer Biolumat LB9505, Berthold, Bad Wildbad, Germany. Люциферазную активность (cpm/mg белка) расчитывали нормированием люминесценции (выраженную в количестве в минуту) к концентрации белка в лизате.
Определение пролиферативной активности соединений (Proliferation assay)
Помещали MCF-7 клетки в 96-луночный планшет в количестве 104 клеток на лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3). Через 24 ч клетки помещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 1% DCC-FBS. Далее клетки стимулировали исследуемым соединением. По истечению инкубационного периода (72 ч) клетки промывали 100 мкл PBS, фиксировали в течение 5 мин 100 мкл 3% р-ра параформальдегида в PBS и окрашивали в течение 10 мин 100 мкл 1%-ного р-ра красителя crystal violet, растворенного в 10%-ном этаноле. Избыток красителя crystal violet удаляли из лунок, после чего планшет тщательно промывали водой для удаления остатков красителя. После сушки на воздухе осевший на поверхности краситель растворяли в 100 мкл 10%-ной уксусной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 595 нм с помощью прибора Multiscan MX, Thermo, Dreieich, Germany.
Вестерн Блоттинг Концентрацию белка в лизате клеток определяли с помощью набора «Bio-Rad DC Protein Assay». Градировочный график строили по данным измерения значений абсорбции (750 нм) образцов с известными концентрациями белков (от 0,25 до 2 мг/мл)
Помещали MCF-7 клетки в 6-луночные планшеты в количестве 3 x 105 клеток на лунку в среде M3. Через 30 ч. стимулировали клетки исследуемым соединением. По истечению инкубационного периода (16 ч.) клетки дважды промывали PBS и лизировали 100 мкл буфера для лизиса содержащего ингибиторы протеазы. Далее проводили количественный анализ содержания белка в исследуемых растворах и подготавливали пробы для электрофореза на полиакриламидном геле SDS. Через 24 ч. наносили по 5 мкг каждого образца на два 10% геля полиакриламида и разделяли смесь белков электрофорезом при напряжении 100 вольт. После сепарации осуществляли блоттинг гелей на мембраны PVDF (Immobilon-P, Millipore, Eschwege, Germany) в течение 3 ч.
После блоттинга мембраны промывали в Western-промывочном буфере (TBS, с содержанием 0,1% Tween-20), блокировали в течение 1 ч в 5% BSA (бычий сывороточный альбумин), растворенном в TBS. Мембраны обрезали на уровне, соответствующем 55 кДа. Верхние половинки инкубировали в течение ночи при 4С с ER- антителами, растворенными в TBS, содержащем 5% BSA. Нижние половинки инкубировали с бета-актин-антителами в качестве контроля (уровень экспрессии бета-актина не меняется в течение инкубации с E2 и исследуемым соединением). Через 24 ч мембраны промывали 3 раза в течение 15 мин раствором TBS, а затем инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами, коньюгированными с HRP (horse radish peroxidase-пероксидаза хрена).
После этого мембраны снова промывали и детектировали методом ECL (усиление хемилюминесценции), используя рентгеновскую пленку на системе «ECL-plus» (GE Healthcare Biotech, Freiburg, Germany).
Пробы крови брали у здоровых мужчин (N = 5) с помощью ЭДТА-содержащих вакуумных пробирок. Плазму отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 4оС при 2500g. Липопротеины плазмы крови выделяли путем последовательного ультрацентрифугирования [123] с помощью ультрацентрифуги Beckman Optima LE-80K в «Ti 50,4» роторе. Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) выделяли при плотности d = 1.006 г/мл (270000g, 3.5 ч, +10С), после чего выделяли липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в диапазоне плотностей 1.019-1.063 г/мл (160000g, 17 ч, +10С). Фракции ЛПНП хранили в защищенном от света месте при -70С. Исследование было одобрено этическим комитетом Центральной больницы Хельсинкского университета, и согласие субъектов было также получено.
Эксклюзионная хроматография. Выделенные ЛПНП очищали гель-хроматографией на колонке Sephadex G25 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). 2 мл образца наносили на колонку (размер колонки 1 см 20 см, BioRad). ЛПНП 1 элюировали фосфатным буфером (PBS, рН 7.4), определяли концентрацию белков [124]. Фракции, содержащие липопротеины, объединяли и использовали в экспериментах.
Окисление ЛПНП. Антиоксидантная активность аналогов эстрогенов определялась путем непрерывного мониторинга кинетики формирования диеновых коньюгатов методом Эстербауера [125]. Исследуемый стероид растворяли в этаноле и добавили к ЛПНП (концентрация белка 0,10 мг/мл в PBS). Контрольные эксперименты без добавления эстрогенов были сделаны с добавлением того же количества этанола. Каждый эксперимент включал две серии с 17-эс-традиолом, концентрации 17-E2, добавленного к ЛПНП, составляли 0,1 мкмоль/л и 1 мкмоль/л. Далее липопротеиды подвергались окислению ионами Cu2+ путем добавления 1,66 мкМ раствора сульфата меди (II). Оптическую плотность измеряли на УФ-спектрофотометре (Safire, TECAN, Австрия Ges.m.b.H) при длине волны 234 нм каждые 3 мин в течение 10 ч при постоянной температуре 28С. Управление прибором осуществлялось с помощью программного обеспечения «Magellan» (TECAN, Австрия Ges.m.b.H).
Анализ кинетики окисления. Время, в течение которого антиоксиданты предотвращают окисление ЛПНП и образование диеновых коньюгатов называ ется лаг-фазой (lag time). Лаг-фаза была рассчитана по методу, описанному в [25]. Для каждой концентрации исследуемого стероида рассчитывали прираще ние значение лаг-фазы по формуле: (лаг-фаза ЛПНП с добавлением стерои да/лаг-фаза ЛПНП с растворителем) х 100%. Результаты выражали в виде «среднее ± стандартное отклонение в параллельных экспериментах». Статисти ческие сравнения были сделаны с помощью программного обеспечения «SPSS Statistics 19.0». Предел достоверности:
