Введение к работе
Актуальность проблемы. Установление детального механизма иммунного ответа, направленного на белковую молекулу, требует знания о структурных особенностях антигенности на молекулярном уровне и может создать научную основу для целенаправленного регулирования иммунного ответа. Антигенность белка, наблюдающаяся при его специфическом взаимодействии с функциональными связывающими участками антител, определяется его детерминантными участками. Установление структуры антигенных участков приведет к глубокому пониманию молекулярных основ иммуногенности белковой молекулы, в частности нейро-токсинов белковой природы.
Известно, что действие нейротоксинов обусловлено их связыванием с элементами пресинаптической или постсинаптической мембраны нервных клеток. Токсины, связывающиеся с пресинаптической мембраной, подразделяются на три группы: направленные на каналы и нейромуску-лярные рецепторы; блокаторы процесса высвобождения нейромедиатора; и так называемые "чистые" пресинаптические токсины, которые воздействуют на плазматические мембраны нервных клеток. Постсинаптические нейротоксины связываются с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (АХР), который играет принципиально важную роль в нервно-мышечной передаче, связываясь с ацетилхолином и регулируя ионные потоки через мембрану. Молекула рецептора, являющаяся пентамером, состоит из четырех видов (а2/3у$) субъединиц, структура которых установлена. Основная часть функциональных исследований АХР посвящена его а-субъединице, ответственной за связывание ацетилхолина, антирецептор-ных антител и-нейротоксинов-. Так, известны молекулярные регионы молекул нейротоксинов и АХР, участвующие в непосредственном контактировании друг с другом. Известен также универсальный связывающий участок на АХР для коротких и длинных а-нейротоксинов. Очень интересным и принципиально важным является то, что этот универсальный регион (сегмент Ala122-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Gly-Glu-lle-Ile- Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp13s в человеческом АХР) содержит также ацетилхолин- и ан-титело-связывающую часть АХР. На основании этого, различие в аффинности нейротоксинов, антирецепторных антител и ацетилхолина по отношению к этому общему региону АХР определяется следующим рядом: нейротоксин » антитело » ацетилхолин, что позволяет объяснить высокоэффективное специфическое ингибирование связывания ацетилхолина или нейротоксина с АХР при помощи нейротоксинов и антирецепторных или антитоксических антител. Для детального выяснения молекулярного механизма конкурентного ингибировагом связывания нейротоксинов с АХР, выражающегося сильной нейротоксичностью, а также для объяснения механизма молекулярных процессов, происходящих вокруг этого, чрезвычайно важным и основополагающим является установление структуры антигенных детерминантных участков молекул нейротоксинов, определяющих их иммунохимические свойства.
В связи с этим изучение, иммунохимических свойств пресинаптиче-ских нейротоксинов - а-латротоксина (ос-ЛТ) яда паука Latrodectus mactans tredecimguttatus, ботулинового нейротоксина А (БНТ/А) из Clostridium botulinum и постсинаптических токсинов - нейротоксина II (НТ II) из яда кобры Naja naja oxiana, а-бунгаротоксина (а-БТ) из яда змеи Bungarus muldcinctus как взаимосвязанные и взаимодополняющие исследования имеют огромную теоретическую и практическую значимость. Установление структуры антигенных детерминантных участков этих нейротоксинов и сравнительный анализ с регионами, ответственными за их нейротоксичность, позволит объяснить структурно-функциональные основы антигенных и нейротоксических функций токсинов, что является одной из фундаментальных проблем биоорганической химии и физико-химической биологии.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических свойств основного токсического компонента яда паука Latrodectus tredecimguttatus - а-латротоксина, одного из основных токсинов яда Цектральноазиатской кобры Naja naja oxiana - нейротоксина II, определение, с помощью синтетических пептидов, структуры участков иммунного распознавания Я^-региона ботулинового нейротоксина А продуцируемого бактериями Clostridium botulinum и а-бунгаротоксина из яда змеи Bungarus muldcinctus.
В ходе исследования решались следующие задачи:
получение высокоспецифических антитоксических антител к а-ЛТ и НТ II;
разработка условий одностадийного выделения а-ЛТ и НТ II из ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana, соответственно.
исследование антителосвязывающих участков а-ЛТ;
выделение триптических пептидов карбоксиметшшрованного НТ II и идентификация регионов нейротоксина, содержащих антигенные детерминанты НТ II;
полный химический синтез панели из 31 пептида, отождествляющих весь Яс-регион (т.е., аминокислотные остатки 855-1296) БНТ/А из Clostridium botulinum;
получение разновидовых антитоксических антител к БНТ/А и определение участков антительного иммунного распознавания Яс-региона БНТ/А;
- химический синтез восьми пептидов а-БТ, отображающих все
кольцевые структуры и поверхностные участки молекулы нейротоксина;
синтез трех контрольных пептидных аналогов а-БТ;
получение разновидовых моноспецифических антител к а-БТ и его синтетическим пептидам;
Актуальность проблемы. Установление детального механизма иммунного ответа, направленного на белковую молекулу, требует знания о структурных особенностях антигенности на молекулярном уровне и может создать научную основу для целенаправленного регулирования иммунного ответа. Антигенность белка, наблюдающаяся при его специфическом взаимодействии с функциональными связывающими участками антител, определяется его детерминантными участками. Установление структуры антигенных участков приведет к глубокому пониманию молекулярных основ иммуногенности белковой молекулы, в частности нейро-токсинов белковой природы.
Известно, что действие нейротоксинов обусловлено их связыванием с элементами пресинаптической или постсинаптической мембраны нервных клеток. Токсины, связывающиеся с пресинаптической мембраной, подразделяются на три группы: направленные на каналы и нейромуску-лярные рецепторы; блокаторы процесса высвобождения нейромедиатора; и так называемые "чистые" пресинаптические токсины, которые воздействуют на плазматические мембраны нервных клеток. Постсинаптические нейротоксины связываются с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (АХР), который играет принципиально важную роль в нервно-мышечной передаче, связываясь с ацетилхолином и регулируя ионные потоки через мембрану. Молекула рецептора, являющаяся яевтамером, состоит из четырех видов (a2/?y<5) субъединиц, структура которых установлена. Основная часть функциональных исследований АХР посвящена его а-субъединице, ответственной за связывание ацетилхолина, антирецептор-ных антител и-нейротоксинов; Так, известны молекулярные регионы молекул нейротоксинов и АХР, участвующие в непосредственном контактировании друг с другом. Известен также универсальный связывающий участок на АХР для коротких и длинных а-нейротоксинов. Очень интересным и принципиально важным является то, что этот универсальный регион (сегмент Ala,22-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Gly-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp'3a в человеческом АХР) содержит также ацетилхолин- и ан-титело-связывающую часть АХР. На основании этого, различие в аффинности нейротоксинов, антирецепторных антител и ацетилхолина по отношению к этому общему региону АХР определяется следующим рядом: нейротоксин » антитело » ацетилхолин, что позволяет объяснить высокоэффективное специфическое ингабирование связывания ацетилхолина или нейротоксина с АХР при помощи нейротоксинов и антирецепторных или антитоксических антител. Для детального выяснения молекулярного механизма конкурентного ингибирования связывания нейротоксинов с АХР, выражающегося сильной нейротоксичностью, а также для объяснения механизма молекулярных процессов, происходящих вокруг этого, чрезвычайно важным иг основополагающим является установление структуры антигенных детерминантных участков молекул нейротоксинов, определяющих их иммунохимические свойства.
В связи с этим изучение иммунохимических свойств пресинаптиче-ских нейротоксинов - а-латротоксина (а-ЛТ) яда паука Latrodectus mactans tredecimguttatus, ботулинового нейротоксина А (БНТ/А) из Clostridium botulinum и постсинаптических токсинов - нейротоксина II (НТ II) из яда кобры Naja naja oxiana, а-бунгаротоксина (а-БТ) из яда змеи Bungarus multicinctus как взаимосвязанные и- взаимодополняющие исследования имеют огромную теоретическую и практическую значимость. Установление структуры антигенных детерминантных участков этих нейротоксинов и сравнительный анализ с регионами, ответственными за их нейротоксичность, позволит объяснить структурно-функциональные основы антигенных и нейротоксических функций токсинов, что является одной из фундаментальных проблем биоорганической химии и физико-химической биологии.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических свойств основного токсического компонента яда паука Latrodectus tredecimguttatus - а-латротоксина, одного из основных токсинов яда Центральноазиатской кобры Naja naja oxiana - нейротоксина II, определение, с помощью синтетических пептидов, структуры участков иммунного распознавания Hf-региона ботулинового нейротоксина А продуцируемого бактериями Clostridium botulinum и а-бунгаротоксина из яда змеи Bungarus multicinctus.
В ходе исследования решались следующие задачи:
получение высокоспецифкческих антитоксических антител к а-ЛТ и НТ II;
разработка условий одностадийного выделения а-ЛТ и НТ II из ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana, соответственно.
исследование антителосвязывающих участков а-ЛТ;
выделение триптических пептидов карбоксиметилированного НТ II и идентификация регионов нейротоксина, содержащих антигенные детерминанты НТ II;
полный химический синтез панели из 31 пептида, отождествляющих весь Яр-регион (т.е., аминокислотные "остатки 855-1296) БНТ/А из Clostridium botulinum;
получение разновидовых антитоксических антител к БНТ/А и определение участков антительного иммунного распознавания Я^региона БНТ/А;
- химический синтез восьми пептидов а-БТ, отображающих все
кольцевые структуры и поверхностные участки молекулы нейротоксина;
синтез трех контрольных пептидных аналогов а-БТ;
получение разновидовых моноспецифических антител к а-БТ и его синтетическим пептидам;
определение регионов антительного и Г-клеточного иммунного распознавания а-БТ с помощью антител и Г-клеток против а-БТ и, наоборот, с помощью антител и Т-клеток к каждому синтезированному пептиду токсина;
определение роли отдельных аминокислотных остатков непосредственно участвующих в нейротоксической активности а-БТ в антигенные свойства нейротоксина;
определение регионов а-БТ, обладающих высокими защитными свойствами от сильного нейротоксического воздействия а-БТ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны условия одностадийного выделения а-ЛТ и НТ II из ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana соответственно, не требующий дорогостоящего оборудования, необходимого при использовании традиционных методов выделения белков и значительна сократившие время их выделения. Иммуносорбентным методом исследовано взаимодействие а-ЛТ с антитоксическими антителами и показана способность нейротоксина одновременно связываться с девятью молекулами антител.
Проведен триптический гидролиз восстановленного и карбоксиме-тилированного производного НТ II, получены триптические пептиды и исследованием их связывания с антитоксическЕпаи антителами определены регионы молекулы НТ II, содержащие антигенные детерминантные участки. Установлено, что антигенные детерминантные участки НТ II ответственные за связывание с активными центрами антитоксических антител, расположены в трех кольцевых структурных доменах и в глобулярной части молекулы токсина.
Всесторонней синтетической стратегией сконструированы набор из 31 пептида, охватывающий полную аминокислотную последовательность Яс-цепи (М.М. 50 kDa) БНТ/А. Эти девятнадцатичленные пептиды (С-концевой пептид является 22-х членным) синтезированы методом 9-флуоренилметоксикарбонильного (ФМОК) твердофазного пептидного синтеза. Все 31 пептиды отделены от твердой фазы и очищены до гомогенности методами гель-проникающей хроматографии и обращеннофазо-вой ВЭЖХ. Получены разновидовые антитела к БНТ/А, и проведен скрининг на распознавание антитоксическими антителами всех синтезированных пептидов БНТ/А. Впервые установлено, что Нс-репюн БНТ/А содержит шесть основных ішмунодоминантньгх антигенных участков.
Осуществлен химический, синтез,. с использованием ФМОК-защищенных производных L-аминокислот, восьма пептидов, отображающих все кольцевые и высокоэкспонированные регионы молекулы а-БТ. Синтезированы также три контрольных пептидных аналогов а-БТ. Впервые определены, с помощью антител и Т-лимфопитов к нативной молекуле а-БТ и всем его синтетическим пептидам, нммунодоминантные антигенные участки молекулы а-БТ. Эти участки расположены в первой
(аминокислотные остатки 3-16), второй (остатки 26-41) кольцевых структурах и в С-концевой части (остатки 66-74) молекулы а-БТ. Впервые, на примере а-БТ, определена влияние высокой сегментной мобильности концевых участков полипептидных цепей белков на Г-клеточный иммунный ответ. В работе также определено непосредственное участие аминокислотных остатков, ответственных за нейротоксическую активность молекулы а-БТ, в связывании с активными центрами антитоксических антител. Установлена высокая защитная способность иммунодоми-нантных антигенных регионов LI, L2 и C-tail, от нейротоксического воздействия а-БТ, что выражалось увеличением защиты в три раза (протекционный индекс, Р/ = 2,5 - 3,2) по сравнении с контролем. Эти три синтезированные антигенные регионы вместе, проявили еще более высокую защитную активность (Р/ = 4,6). Впервые для а-нейротоксинов, применение химического конъюгата всех трех синтезированных иммуно-доминантных регионов с белковым носителем, позволило получить исключительно высокий защитный эффект от сильного нейротоксического действия а-БТ (Р/ = 18,1), что почти в два раза превышало, защитный эффект, полученный с помощью нативного а-БТ (Р1 = 9,7).
Полученные высокоспецифичные антитела, нейтрализующие токсические действия исследованных нейротоксинов и ядов, а также их применение для стимулирования активного и пассивного иммунитета для защиты от укусов соответствующими ядовитыми животными и против ботулизма, представляют значительную практическую значимость.
Настоящая работа выполнена в рамках дополнительных заданий Государственного комитета по науке и технике " Иммунохимически изучить рецепторы лимфоидных клеток, специфически реагирующих с токсинами ядов членистоногих Средней Азии" (номер Гос. регистрации 295) и "Разработать новые эффективные методы получения антисывороток к токсинам и ядам членистоногих Средней Азии и выдать ТашНИИВС рекомендации по практическому применению этих методов" (номер Гос. регистрации 01840007500); а также научных контрактов DAMD 17-89-С-9061 и DAMD 17-93-C-31S9 с Командованием медицинских исследований и развития Армии США (USAMRDC), Министерства обороны США и научного гранта NS-26280 из Национального института здоровья США.
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 3-м Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраныг структура и функции"-, Ташкент, 1983; 1-ой конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент, 1986; Международном симпозиуме "Структура, биосинтез и функция молекулярных элементов иммунной системы", Пущино, 1987; 7-Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллин,-1987; 14-Международном конгрессе по биохимии, Прага, 1988; 14-Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Ташкент, 1989; 10-Международном конгрессе по животным, рас-
тителъным и микробным токсинам, Сингапур, 1991; Ежегодной научной конференции Департамента биохимии Медицинского колледжа Бэйлор, Huntsville, Texas, USA, 1993 - 1996; 10-Международном научном симпозиуме "Methods in Protein Structure Analysis", Snowbird, Utah, USA, 1994; 11-Международном научном симпозиуме "Methods in Protein Structure Analysis", Аннеси, Франция, 1996; 2-Республиканском научном коллоквиуме "Независимость Узбекистана - гарантия развития его науки и технологии", Ташкент, 1997.
Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 26 работ в научных журналах и сборниках, в том числе четыре- статьи и одна обзорная статья в зарубежных периодических журналах и книге.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения собственных результатов, заключения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего в себя 307 наименований. Работа изложена на 218 страницах компьютерного текста и содержит 25 рисунков и 15 таблиц.
