Содержание к диссертации
Введение
1 Основы конструирования лекарственных субстанций 6
1.1 Стратегии и подходы к созданию лекарственных соединений на примере ингибиторов активации системы комплемента 6
1.1.1 Этапы создания лекарственных препаратов 6
1.1.2 Система комплемента 9
1.1.3 Ингибиторы комплемента, найденные скринингом 11
1.1.4 Молекулярная модификация соединений-лидеров 12
1.1.5 Метод QSAR. 13
1.1.6 Случайные открытия лекарственных соединений.. 14
1.1.7 ЗО-Структура белков как ключ к созданию ингибиторов комплемента. 14
1.1.8 Ингибиторы, найденные методом фагового дисплея 16
1.5.2 Белковые ингибиторы системы комплемента 17
1.1.10 Заключение IS
1.2 Методы установления количественной взаимосвязи «структура-активность» 19
1.2.1 Метод Ганча 19
1.2.2 Физико-химические свойства 22
1.2.3 Применение метода Ганча 26
1.2.4 Концепция лтлекулярной голограммы 32
1.2.5 3D-QSAR 35
1.2.6 3D-QSAR: за и против 44
2 Результаты и их оссуждение 45
2.1 Синтез новых ингибиторов активации комплемента 46
2.1.1 Синтез и комплемент-ингибирующая активность дисульфатов бисфенолов 46
2.1.2 Синтез сульфатов некоторых стероидов и тритерпеноидоа 52
2.1.3 Конструирование и синтез ингибиторов системы колнгг&мента на основе аминокислот 55
2.1.4 Получение ингибиторов комплемента на основеунитиола 59
2.2 Комплемент-модулиругощиеспойстванамодисперсии 60
2.3 Количественная взаимосвязь «структура- активность» в ряду дикарбоновых кислот (qsar) 61
2.4 Исследование влияния низкомолекулярных отрицательно заряженных веществ па функциональную активность белка с1q 64
2.5 Активность изученных соединений по отношению к альтернативному пути активации системы комплемента 70
3 Экспериментальная часть 72
3.1 Химическая часть 72
3.1.1 Реактивы растворители, приборы 72
3.1.2 Дисульфаты бисфенолов 73
3.1.3 Сульфаты стероидов и тритерпеноидов 78
3.1.4 Синтез ингибиторов на основе аминокислот 79
3.1.5 Конденсация унитиола с карбонильными соединениями 83
3.2 Биологическая часть 84
3.2.1 Реактивы, растворители, приборы 84
3.2.2 Гемолитические и гишуноферментные методы 86
3.2.3 Получение и изучение свойств нанодисперсий 90
3.3 Молекулярный докинг. 91
Выводы 92
- Методы установления количественной взаимосвязи «структура-активность»
- Концепция лтлекулярной голограммы
- Комплемент-модулиругощиеспойстванамодисперсии
- Биологическая часть
Введение к работе
Система комплемента является частью иммунной системы организма, которая активируется при попадании в организм чужеродных бактерий и других антигенов. Комплемент, получивший свое название благодаря тому, что он дополняет и усиливает действие антител, является главным механизмом, с помощью которого антитела защищают организм от большинства антигенов. Он представляет собой систему сывороточных белков, которые активируются комплексами антиген-антитело (классический путь) или микроорганизмами (альтернативный путь) и претерпевают каскад протеолитических реакций, конечный результат которого - сборка мембраноа-такующего комплекса, вызывающего лизис патогена, В то же время протеолитические фрагменты анафилатоксины, освобождаемые в процессе активации, усиливают защитную реакцию, путем расширения кровеносных сосудов и привлечения фагоцитирующих клеток к очагу воспаления. Таким образом, система комплемента обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливает гуморальный ответ, поддерживает внутренний воспалительный гомеостаз.
Несмотря на то, что активность комплемента регулируется системой белков-ингибиторов, атака комплемента против здоровых клеток возможна, и является причиной заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма: ишемические повреждения, сепсис, астма, аллергия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, миастения, рассеянный склероз и др. Часто нежелательная активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца. Активация комплемента - одна из причин отторжения ксено- и аллотрансплантатов.
В настоящее время в мире не существует лекарственных препаратов комплемент-ингибирующего действия; ряд низкомолекулярных модуляторов, а также несколько терапевтических агентов на основе рекомбинантных форм белков-ингибиторов комплемента находятся на разных стадиях клинических испытаний. Однако, создание ингибиторов для селективного блокирования одного из путей активации комплемента, сохраняющее активность другого для иммунной защиты организма, а также ингибирования ранних стадий активации, предотвращающее развитие анафилактических реакций, остается актуальной задачей. Так, усилия нашей лаборатории сосредоточены на создании селективных ингибиторов классического пути комплемента, блокирующих первую стадию активации, а именно взаимодействие узнающего белка комплемента СIq с антителами.
Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ингибиру-ют это взаимодействие. Упрощающей модификацией были сконструированы низкомолекулярные отрицательно заряженные вещества с аналогичными свойствами, дисульфат бетулина и дисуль-фат бисфенола Л, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибиро-вания комплемента [1]. На примере производных бисфенола Л с различными анионными группами было показано, что среди отрицательно заряженных остатков две фосфатные или сульфатные группы обеспечивают наибольшую комплемент-ингибирующую активность [2]. Исследования ряда дисульфатов бисфенолов, а также алифатических и ароматических дикарбоновых кислот позволили установить структурные критерии, существенно увеличивающие биологическую активность. На основе этих критериев было выведено уравнение количественной взаимосвязи «структура-активность» (QSAR) для дисульфатов бисфенолов, позволяющее предсказывать активность новых соединений этого класса.
Данная работа является продолжением ранее проведенных исследований и посвящена как получению новых ингибиторов комплемента, так и изучению механизма действия наиболее активных из изученных соединений.
Методы установления количественной взаимосвязи «структура-активность»
Биологическую активность соединений можно рассматривать как функцию от их физико-химических и структурных свойств. Уже в конце 19 века Майер и Овертон наблюдали независимо друг от друга, что анестезирующее действие ряда соединений линейно возрастает с ростом их коэффициента распределения (Р) [92]. Четыре десятилетия спустя Фергюсон объяснил эту зависимость термодинамическими принципами, установив, что наркотические свойства соединений зависят от насыщения мембран клеток газообразным наркотическим веществом [92]. Позднее Ганч пред поло жил, что молекулы с очень высоким коэффициентом распределения проникают лишь во внешний липидный слой клеточных мембран и остаются там, не проникая вглубь клетки. Молекулы с очень низким коэффициентом распределения, напротив, не могут преодолеть мембрану клетки, оставаясь локализованными во внешней водной среде. Опираясь на это, в 1960-х годах Ганч установил, что биологическая активность ряда родственных соединений описывается параболической зависимостью от гидрофобностн (log Р) согласно уравнению 1.1 [93]. Таким образом, оптимальное значение log Р соответствует максимуму вероятности того, что молекула свяжется с биологической мишенью, которая расположена внутри клетки. Оптимальное значение гидрофобное \o%P0=a!2b получаем из соотношения (/(log MC)ld log Р, приравненного к нулю. Биологическая активность обычно выражается как логарифм обратной концентрации или дозы (log UC или рС), которая вызывает какой-то стандартный ответ, например log (ІЛС50) или log (1/ECso). Процессы, вовлеченные в транспорт лигандов к месту их действия, и гидрофобные взаимодействия с рецептором в целом определяются уравнением 1.1. Для некоторых классов соединений, проявляющих активность по отношению к центральной нервной системе, было установлено, что активность, которая определяется во многом способностью преодолевать гематоэнце-фалический барьер, наиболее высока для соединений, имеющих log Р0 1.5-2.7. Линейная зависимость активности от log Р может наблюдаться до тех пор, пока гидрофобный участок рецептора не заполнится, и активность уменьшится из-за стерических препятствий для взаимодействия ли-ганда с рецептором.
Однако, во многих случаях, весь диапазон значений гидрофобности не может быть исследован (например, из-за проблем с растворимостью), поэтому авторы выявляют лишь линейную зависимость активности от гидрофобности. 1.2.1.2 Многофакторный анализ Для того чтобы учесть другие типы взаимодействий лигандов с рецепторами, Ганч и Фуд- жита [94] включили в уравнение QSAR дескрипторы (в литературе можно встретить выражения; «факторы», «параметры») для описания стерических, электронных и гидрофобных свойств молекул (уравнение 1.2). log I = а х [параметргидрофобности) + 6 х [электронный параметр) (Уравнение 1.2), + с х {стерический параметр) + d х [Другие параметры) + е где а, Ь, с, d е - коэффициенты, определенные регрессионным анализом по методу наименьших квадратов. Для описания общих свойств молекулы или индивидуального вклада отдельных заместителей используются разнообразные физико-химические параметры (табл. 1.1). Эти независимые переменные в уравнении 1.2 не должны быть коллинеарпыми, так как одинаковая информация, привЕюсимая дескрипторами, будет приводить к ошибочной корреляции [95]. Для описания присутствия или отсутствия определенных заместителей или других структурных характеристик можно использовать индикатор вариабельности, переменную, которая, например, принимает значения 1 или 0, соответственно. В идеальном случае, биологические данные и физико-химические параметры должны быть соизмеримыми и охватывать наибольший диапазон значений. Чтобы избегать случайных (необоснованных) корреляций необходимо, чтобы количество соединений (/?), используемых для анализа, значительно превышало количество дескрипторов. Для средней no размеру выборки нужно использовать соотношение: I дескриптор на 4-6 соединений. Коэффициент корреляции ґ является относительным «показателем качества» найденной зависимости. Он должен быть около 0.9 для данных, полученных in vitro. Это будет свидетельствовать о том, что дисперсия предсказанных значений не превышает 80%. Стандартное отклонение s - абсолютный «показатель качества» полученной зависимости. Он не должен сильно превышать стандартное отклонение для набора использованных биологических данных. Значения коэффициентов регрессии (а, Ъ, с, dt е и т.д.) должны иметь смысл с физико-химической точки зрения и узкий доверительный интервал. Важным является то, что физико-химические дескрипторы содержат информацию, которая помогает найти свойства соединений, существенные для проявления активности. Таким образом, следует выбирать и статистически обосновывать независимые (малосвязанные между собой) дескрипторы, которые описывают разные структурные особенности. В поиске количественных зависимостей следует также придерживаться выбора наиболее простых математических моделей. Первый и до сих пор широко используемый дескриптор, называемый константой Гаммета (а), разработал Гаммет в 1935 году на основе констант ионизации производных бензойной кислоты [96]. Уравнение Гаммета имеет следующий вид: pa = log К% -log К (Уравнение 1.3), где Кн и Кх - константы ионизации для бензойной кислоты и ее пара- или .ш?та-замещенных производных соответственно, ар - 1 для измерений, проводимых в воде при 25С.
Положительные значения константы Гаммета свидетельствуют об электроноакцепторных свойствах заместителей (X = CN, NO2, CF3), а отрицательные - об электронодонорных свойствах (X Nib, СН3). Ряд специальных параметров Гаммета применяется для особых вычислений. Например, параметры о-" , ег , ут и ар помогут раскрыть природу взаимодействия лиганда с рецептором, если использование одной из констант приведет к значительно лучшей корреляции [96]. Свен и Луптон [92] выявили в электронных эффектах заместителей индуктивную и резонансную составляющую и выразили константу Гаммета как линейную комбинацию 1.4. (T f3+p\ (Уравнение 1.4), где/- весовые коэффициенты. Индуктивный (3) и резонансный (КЯ) эффекты - параметры, не изменяющие своего значения в зависимости от положения заместителя, что делает их удобными для использования при выводе QSAR. 1.2.2.2 Параметры гидрофобности Вклад гидрофобных свойств заместителей в активность лиганда можно рассчитать по аналогичному уравнению Гаммета выражению 1.5. Ж = log Рх log Ри (Уравнение 1.5), где Рх — коэффициент распределения замещенного производного и Гц - коэффициент распределения незамещенного соединения. Коэффициент Р - это отношение концентрации изучаемого вещества в двух несмешиваюшихся растворителях. За стандартную систему принята смесь окта-нол - вода. Октанол нашел применение благодаря амфифильной природе, позволяющей легко изучать растворимость липидов и их производных. Свойство быть донором или акцептором водородной связи облегчает взаимодействие между растворителем и растворяемым веществом, поэтому способность октанола содержать в равновесном состоянии небольшое количество воды также обусловливает его использование. Положительные значения л соответствуют гидрофобному характеру заместителя по сравнению с водородом, а отрицательные - гидрофильному. В случае ионизируемых соединений, log Р для неионизированной формы может быть определен через коэффициент распределения Д который зависит от рН, н константу ионизации (ураннения 1.6, 1.7). оёЯы =fogP -\0g[l + lGlpH-pf:a)] {Уравнение 1.6) logDw = log P-\0g[\ + 10 - »] (Уравнение 1.7) Однако, определение коэффициента распределения в делительной воронке сопряжено со значительными трудностями. Минорные примеси и ионные эффекты в. водных растворах, трудности при анализе веществ с экстремальными значениями log Р и необходимость работы с очень разбавленными растворами, сложности при разделении фаз могут исказить результаты. Все эти проблемы с успехом решаются при использовании ВЭЖХ. Этот метод адаптирован для работы с очень малыми количествами веществ и с загрязненными образцами и дает точные данные при частой калибровке.
Концепция лтлекулярной голограммы
Рассмотрим методы разработки моделей «структура-активность», при которых число структурных параметров (характеристик) превышает количество соединений. В этих случаях классические методы множественного линейного регрессионного анализа не могут быть приме- йены, так как при этом неизвестных параметров больше, чем доступных уравнений (одно уравнение на каждое соединение в тестовой выборке). Эта ситуация типична для моделей 3D-QSAR, где число параметров может превышать число уравнений в 100 раз. В этих случаях используется концепция молекулярной голограммы, по существу представляющая собой вектор, который описывает вхождение разнообразных фрагментов (задаваемых в явном виде при помощи линейной нотации) в структуру химического соединения [15]. Эта концепция объединяет в себе методы распознавания моделей, такие как метод частичных наименьших квадратов (PLS; Partial least squares projections to latent structures), регрессионного анализа главных компонентов (PCR; Principal component regression), анализ главных компонентов (РСА; Principal component analysis). Все три метода основаны на уменьшении исходного числа параметров каждой молекулы до нескольких скоррелированных дескрипторов, так называемых главных компонентов (PC). Во всех методах исходная матрица данных рассматриваемых соединений (X) преобразуется в основной вектор (Хт), матрицу значений Т и матрицу вкладов Р . Компоненты матрицы Т представляют собой лучшую комбинацию значений матрицы X и могут использоваться как основные факторы изучаемой системы. Компоненты матрицы Т во всех упомянутых методах представляют собой линейные комбинации исходных физико-химических свойств соединений (1.27). t{ =C,F, +C2V2 +Суу +... + C„Vn (Уравнение 1.27), где Сп - весовые коэффициенты, Vn - исходные физико-химических свойства соединений, t[ — первый компонент матрицы Т. Для вычисления главных компонентов на первом этапе из свойств исследованных соединений составляется исходная матрица X (рис. 1.9). Первый PC обобщает наибольшее количество информации, содержащейся в матрице X. Это приводит к получению первого вектора h и вектора /J. Информация, обобщенная первым PC, затем исключается из матрицы X, вычитанием матрицы i\ Ру из матрицы X. Второй PC вычисляется аналогично первому с целью обобщения как можно большего количества информации, содержащейся в обновленной матрице X и т.д.
Такой способ вычисления компонентов PC позволяет получать ортогональные (независимые друг от друга) компоненты. Необходимо отметить, что следует вычислять только обоснованное количество компонентов и остановиться, когда величина ошибки вычислений станет слишком большой. Чтобы определить этот момент используется перекрестная проверка Уорлда [110]. Согласно этому методу часть данных отбрасывается, вычисляется PC и создается модель на основе оставшихся данных. Отброшенные значения предсказываются с помощью созданной модели. До тех пор пока предсказание отброшенных данных становится точнее, вычисленный компонент считается Между методами частичных наименьших квадратов (PLS) и регресс ионного анализа главных компонентов (PCR) существует фундаментальное отличие в способе вычисления компонентов. Метод PCR состоит из двух шагов. На первом этапе проводится анализ главных компонентов (РСА), который заключается в описании структур (составлении матрицы X) и вычислении необходимого количества PC. На втором этапе устанавливается корреляция компонентов с данными о биологической активности с использованием множественного линейного регрессионного анализа. В методе PLS корреляция между дескрипторами и биологической активностью устанавливается уже при вычислении главных компонентов. Таким образом, PLS создает PC, которые обобщают как можно больше биологической информации. Метод PCR на первом этапе обобщает как можно больше структурных особенностей соединений и затем, на втором этапе, использует вычисленные PC для моделирования хорошей зависимости с биологической активностью. Как следствие, метод PLS позволяет получать более точные количественные зависимости. Преимущества методов PLS/PCR по сравнению с множественной линейной регрессией приведены ниже. 1, Количество анализируемых соединений может быть значительно меньше, чем количество дескрипторов, 1. Главные компоненты не зависят друг от друга, прибавление каждого из них (при извлечении обоснованного количества PC) улучшает взаимосвязь. 3. Исходный набор физико-химических данных может содержать пропуски, то есть дескрипторы могут быть пропущены, например, если они не могут быть рассчитаны.
Количество пропущенных данных, которое могут допустить методы PLS/TCR, зависит от их распределения в матрице X. Метод частичных наименьших квадратов (PLS) использовал Нориндер [111] для установления количественной взаимосвязи между способностью моно- и дизамещенных бензамидов (24) взаимодействовать с [3Н]спиперон-связывающими сайтами in vitro и большим числом физико-химических дескрипторов, описывающих гидрофобные, электронные свойства и размер молекул. Каждое 3- и 5- замещенное производное было описано исходными физико-химическими параметрами (cfm, ар, З, 9Ї, л, MR, Lt B\ и В$ (табл. 1.2)) и соответствующими значениями в квадрате. Так как есть только два варианта заместителя во втором положении (R2 = Н, ОН), был введен так называемый индикатор вариабельности (/г). Он может принимать только два значения: h = 0 для R.2 = Н и /г =1 для Ri = ОН. Подобный индикатор вариабельности (/$) был использован и для того, чтобы описать стереохимию боковой цепи (й = -I, S = І). В целом, каждое соединение было описано 38 дескрипторами. PLS - анализ привел к получению 4 главных компонентов, которые обобщили 86% данных. Анализ указал на решающее значение размера, гидрофобности и электронных свойств заместителя в третьем положении, а также на S-конфигурацию боковой цепи. 1.2.5 3D-QSAR 1.2.5.1 Методы и стратегии Взаимосвязи «структура-активность» традиционного типа, например анализ Ганча или методы распознавания моделей, обычно не используют в явном виде ЗО-структуры исследованных соединений. Чтобы описать структурное многообразие молекул в этих методах используются параметры заместителей и индикаторы вариабельности. Известно, что связывание лигандов с рецепторами, как правило, не ковалентно, а в основе биологической активности соединений лежат гидрофобные, стерические и электростатические взаимодействия. Поэтому возможности традиционных методов QSAR были расширены за счет использования параметров ЗО-геометрии структур. На сегодняшний день существует несколько методов, объединенных под общим названием 3D-QSAR: методы HASL [112], REMOTEDISC [113], GRID/GOLPE [114]. На сегодняшний день наиболее часто используется метод сравнительного анализа молекулярных полей (CoMFA; Comparative molecular field analysis), который разработал Грамер в 1988 г. [115].
Комплемент-модулиругощиеспойстванамодисперсии
Как было показано выше, значительный вклад в комплемент-ингибирующую активность вносит способность веществ образовывать структуры нанодиапазона. В случае сульфатов урсо-ловой и бетулиновой кислот, а также пептида 3.11 способность к образованию наночастиц была обнаружена случайно, однако, в ходе данной работы были изучены нанодисперсии, специально полученные для ингибирования комплемента: линосомы на основе сульфата холестерина и ам-фнфильного дисульфата бисфенола (1.13), а также нанокристаллы бетулиновой кислоты, соединения, обладающего противоопухолевой активностью. Недавно в нашей лаборатории был разработан эффективный метод солюбилизации бетулиновой кислоты и ее производных, обладающих плохой растворимостью в воде [132]. Он заключается в прибавлении 25-кратпога объема воды к раствору солюбилизируемого соединения и яичного фосфатидилхолина (яФХ) в органическом растворителе. Последующее концентрирование на роторном испарителе с периодической обработкой на ультразвуковой бане позволило получать дисперсии нанокристаллов, подобно дисперсии, представленной на рис, 2.7 В. Мы использовали этот метод для получения дисперсий сульфата холестерина, определение комплемент- ингибирующей активности которого было затруднено ограниченной растворимостью в воде. Рис. 2.7 С показывает, что дисперсия, полученная при равном соотношении сульфат холестерина : яФХ, представляет собой дисперсию липосом, активность которой оказалась очень высокой (1С5о 6.3 мкМ). Для получения липосомных дисперсий на основе амфи-филыюго дисульфата бисфенола 1,13 использовали метод экструзии. Необходимо отметить, что сам эффектор 1.13 обладает высокой гемолитической активностью (ED50 2.3 мкМ), которая отсутствовала у исследованных липосомных дисперсий. Такое Рис. 2.7. Микрофотографии (негативное контрастирование) наноструктур в воде. A: D,L-jV-FmocTyi (OSO:,H)TrpOMe (500 мкМ); В: нанокристаллы бетулиновой кислоты, стабилизированные яФХ (1:1); С: липосомы из сульфата холестерина и яФХ (II). нивелирование литических свойств доказывает, что эффектор находится в составе надмолекулярных образований. Однако, какой-либо комплемент-ингибирующей активности при тестировании липосом на основе смеси эффектора 1.13 и яФХ, а также эффектора и димиристоилфосфати-дилхолина (DMPC), имеющего более короткие остатки жирных кислот и позволяющего увеличить экспонирование заряженных групп на поверхности липосом, обнаружено не было.
Нанокристаллы бетулиновой кислоты (рис. 2.7 В) также были исследованы с целью определения возможной комплемент-ингибирующей активности, однако, эта дисперсия проявила противоположный эффект. Так, при концентрациях бетулиновой кислоты выше 150 мкМ наблюдалась активация системы комплемента по классическому пути. Эффект установлен при инкубировании несенсибилизированных бараньих эритроцитов с сывороткой морской свинки. Так как развитие альтернативного пути комплемента в этих условиях невозможно, можно сделать вывод о антитело-независимой активации классического пути комплемента нанокристаллами бетулиновой кислоты. Эффект многоточечного связывания белка Clq, приводящего к его активации и последующему развитию классического пути, был описан ранее для ряда полимеров с анионными группами [138]. По-видимому, полизаряженная поверхность нанокристаллов бетулиновой кислоты также способна активировать Clq, и этот эффект может накладывать ограничения на использование подобных дисперсий в терапевтических целях из-за возможности нежелательной активации системы комплемента. 2.3 Количественная взаимосвязь «структура - активность» в ряду дикарбоновых кислот (QSAR) В последние десятилетия лекарственная химия широко использует методы математического моделирования, которые позволяют изучать лиганд-рецепторные взаимодействия, предсказывать активность соединений, объединенных в электронные банки данных, оптимизировать 3 Фотографии получены в.н.с, д.б.н. Попенко В.А. в лаборатории электронной микроскопии ИМБ им. В.А. Энгель-гардта РАН. уже известные структуры, направлено синтезировать активные соединения. В случае, когда 3D-структура биологической мишени недоступна или сайт связывания лигапда неизвестен, широко применяется метод количественной взаимосвязи «структура - активность» (QSAR), математический подход, позволяющий проводить корреляции между структурой соединений и их биологической активностью. При этом структурные свойства молекул и физико-химические свойства веществ выражаются количественно в виде дескрипторов.
Получаемое в итоге уравнение взаимо- связи «структура-активность» дает возможность предсказывать активность новых аналогов того же класса, хотя и не позволяет судить о механизме действия веществ. Ранее в нашей лаборатории были изучены комплемент-ингибируюпше свойства алифатических и ароматических дикарбоновых кислот [1, 2], ряд которых в рамках данной работы был дополнен шестью новыми соединениями (табл. 2,5) [139]. Изученная палитра эффекторов позволяет вывести уравнение QSAR, которое может быть использовано для получения более активных аналогов в будущем. В качестве возможных дескрипторов, которые могут быть ключевыми для расчета комплемент-ингибирующей активности данного ряда структур, мы рассматривали гид-рофобность (cLogP), расстояние между зарядами, объем и площадь молекулы, молярную рефракцию (MR), поляризуемость, энергию гидратации молекулы, энергии высшей заселенной и низшей незанятой молекулярных орбиталей (Еномо, ELUMO). частичные заряды на различных атомах молекулы. В результате построения ряда моделей и оценки их адекватности наилучшую корреляцию показали гидрофобность (cLogP) и значение частичного положительного заряда на карбонильных атомах углерода ( /). Полученное регрессионное уравнение имеет вид: Установленная положительная корреляция активности с гидрофобностыо является подтверждением закономерности, показанной для других изученных классов соединений: с ростом липофильности структуры активность возрастает. Так, в целом более гидрофобные ароматические дикарбоновые кислоты проявляют более высокую активность (рис. 2.8 А). Значения q также выше для ароматических кислот из-за делокализации электронной плотности в ароматической системе. Делокализация заряда приводит к уменьшению сольватных оболочек вокруг заряженных групп, вызывая увеличение силы электростатических взаимодействий лигандов с рецептором, и, как следствие, рост активности. Использование дескриптора q в уравнении 2.2 позволило объединить в одну математическую модель разные классы кислот, что является несомненным преимуществом, увеличивающим предсказательную ценность уравнения.
Биологическая часть
В работе применялись следующие приборы: спектрофотометр LKB BIOCHROM Ultrospec 4050 (США), многолучевой спектрофотометометр MuUiscan EX (ThemioLabsystems), термостат UTU-2/77 (Польша), термостат ТЭК-50/60 (Россия), центрифуга ОП-8УХЛ 4.2 (СССР), рП-метр Piccolo АТС (Hanna Instruments, Германия). Для получения липосом использовали ультразвуковую баню Branson 22Ю (Branson, США) и экстругатор LiposoFast Basic (Avestin Inc., Канада). Для выделения белка использовали диализные мешки "Visking" (Serva, Германия). Биохимические эксперименты проводили в стеклянных и пластиковых пробирках емкостью 10 мл, полистироловых плоскодонных 96-луночньгх планшетах с обычной сорбционной емкостью (ГосНИИ «Мед-полимер», Москва; Costar). Электронные микрофотографии получачи негативным контрастированием с 1% водным раствором уранилацетата с помощью электронного микроскопа Joel ЮОСХ (Япония). Для определения биологической активности в гемолитических системах использовали эритроциты барана, эритроциты кролика, кроличью сыворотку с титром 1:1200, сухой комплемент морской свинки, нормальную сыворотку человека, любезно предоставленные фирмой «Биолек» (Харьков, Украина) и МНИИЭиМ им. Г.Н.Габричевского (Москва). Реагент Rlq, дефицитную но Clq сыворотку человека, получали как описано ранее [154]. Для определения активности веществ по отношению к классическому пути использовали изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы магния и кальция (VBS2f) (5 мМ веронала, 145 мМ NaCl, 0.5 мМ MgCb и 0.15 мМ СаСЬ, рН 7.4).
Дпя определения активности веществ по отношению к альтернативному пути использовали изотонический вероналовый буфер, содержащий желатин (GVB) (5 мМ веронала, 145 мМ NaCl, 0.1% желатин, 0.02% NaN3, рН 7.4), изотонический вероналовый буфер, содержащий желатин и EDTA (GVBE) (5 мМ веронала, 145 мМ NaCl, 0.1% желатин, 0.02% NaNj, 10 мМ EDTA, рН 7.4), раствор 50 мМ MgEGTA. Для иммуноферментного анализа использовали следующие реактивы: С-реактивный белок человека (Sigma), LPS из E.coll (Sigma), мышиные антитела против мальтоза-связывающего белка (анти-МВР) (Sigma), антитела кролика против мышиных анти-МВР, конъюгированные с перо ксидазой хрена (HRP) (DakoCytomation, Дания), антитела IgG кролика против человеческого Clq (DakoCytomation, Дания), антитела козы против антител IgG кролика, конъюгированные с щелочной фосфатазой, бычий сывороточный альбумин (Sigma), о-фенилендиамин (OPD, Sigma), rt-питрофенилфосфат (pNPP, Sigma). Как источник IgGl использовали препарат Rjtuximab (Mabhera, F.Hoffmann La-Roche, Швейцария) на основе гуманизированных мышиных анти-СО-20 моноклоналышх антител. Белок Clq выделяли осаждением из сыворотки человека [154]. Человеческий рекомбинаитный пентраксин РТХЗ был любезно предоставлен Drs. B.Bottazzi и D.A.Mantovani (Милан, Италия). Глобулярные фрагменты молекулы Clq были любезно предоставлены L.Roumenma и M.S.Kojoutiarova (Софийский университет, Болгария), M.Gadjeva и U.Kishore (Оксфордский университет, Великобритания). Предоставленные белки (цепь A (ghA), остатки 88-223; цепь В (ghB), остатки 90-226; цепь С (ghC), остатки 87-217) были экспрессированы в Е. coli НВ101 как фью-жен-белки с мальтоза-связывающим белком (МВР). Очистка экспрессировапных белков была произведена аффинной хроматографией на сорбенте с амилозой [155]. Дополнительная очистка была проведена ионообменной хроматографией на Q-сефарозе с использованием градиентного элюирования растворами 0.1-1.0 М NaCl. Для иммуноферментного анализа использовали следующие буферы: карбонатный буфер (15 мМ Na2COj, 35 мМ NaHC03, рН 9.6), изотонический фосфатный буфер (PBS) (10 мМ Na2HP04, 10 мМ NaHjPO 145 мМ NaCl, рН 7.4), изотонический фосфатный буфер, содержащий 0.05% Tween 20 (PBST) (10 мМ Na2HP04, 10 мМ NaH:P04, 145 мМ NaCl, 0.05% Tween 20, рН 7.4). Для работы с конъюгатом пероксидазы хрена использовали OPD - систему (на 1 плашку: 2,5 мл 0.1 М лимонной кислоты, 0.5 мл 1М Na2rIP04, 7 мл воды, 50 мкл 30% Н2О2, 5 мг OPD). Для работы с конъюгатом щелочной фосфатазы использовали pNPP - систему (на I плашку: 10 мл Трис-буфера (100 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, рН 9.5, 5 мг pNPP). 3.2.2 Гемолитические и иммуноферментньїе методы Определение активности ингибиторов но отношению к классическому пути комплемента.
Для получения сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) к 10 мл суспензии бараньих эритроцитов в VBS2+ (1 хIО9 клеток/мл) приливали 10 мл кроличьей гемолитической сыворотки в VBS2+ (1:400), инкубировали в течение 25 мин при 37С. Эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 2000g и разбавляли VBS + до концентрации 1,1x10 клеток/мл. Двести микролитров ЕА смешивали с 200 мкл раствора сыворотки морской свинки в VBS как источника комплемента в концентрации, обеспечивающей 70-80% гемолиза ( 1:120), и 600 мкл раствора ингибитора в VBS2+ в разных концентрациях. Для стандартизации опыта определяли активность эталонного соединения сульфетрона. Для этого в систему вместо раствора ингибитора прибавляли по 600 мкл раствора сульфетрона в VBS2+ с концентрациями 1.67, 0.83, 0.42, 0.21, 0.10 мг/мл. В контрольной системе исследуемое вещество заменяли буфером. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов смешивали 200 мкл ЕА с 800 мкл буфера. Все образцы инкубировали 25 мин при 37С, разбавляли в 4 раза холодным буфером для остановки реакции и нелизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 2000g. Оптическую плотность суцерна-танта измеряли при 414 нм, активность ингибиторов и сульфетрона при каждой концентрации вычисляли по формуле (3.1). Определение активности ингибиторов по отношению к альтернативному пути комплемента. Семьдесят восемь микролитров растворов ингибитора различных концентраций, приготовленных в GVB, смешивали с 5 мкл 50 мМ MgEGTA, 7 мкл неразбавленной человеческой сыворотки и 10 мкл суспензии эритроцитов кролика (1x10 клеток/мл). В контрольной системе исследуемое вещество заменяли буфером. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов смешивали 10 мкл эритроцитов с 90 мкл GVB. Все образцы инкубировали 25 мин при 37С, разбавляли в 4 раза холодным GVBE для остановки реакции и нелизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 2000g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при 414 нм, активность ингибиторов при каждой концентрации вычисляли по формуле 3.1. Значения ICJO определяли но графику зависимости активности ингибитора от концентрации. Определение гемолитической активности. Двести микролитров суспензии эритроцитов барана в VBS2+ (1.1х10к клеток/мл) смешивали с 800 мкл растворов ингибитора разных концентраций, приготовленных в VBS +. В контрольном образце на полный лизис раствор ингибитора заменяли водой. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов смешивали 200 мкл эритроцитов с 800 мкл VBS2+. Все образцы инкубировали 25 мин при 37С, разбавляли в 4 раза холодным VBS2" для остановки реакции и нелизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 2000g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при 414 нм, процент гемолиза эритроцитов при каждой концентрации вычисляли по формуле (3.3).
