Содержание к диссертации
Введение
1. Нуклеофильныи катализ пиридинами и азолами в реакциях сульюнилирования и фосфорипирования 9
1.1. Реакции арилсульфогалогенидов с нуклеофильными реагентами в присутствии пиридинов и азолов 9
1.1.1. Влияние растворителей 15
1.1.2. Влияние природы уходящей группы 18
1.1.3. Влияние заместителей в бензольном кольце арилсульфогалогенидов 19
1.1.4. Влияние природа катализатора 21
1.1.5. Влияние резонансной стабилизации промежуточного продукта 23
1.2. Реакции арилсулъфоазолидов с нуклеофильныш реагентами 27
1.3. Нуклеофильный катализ пиридинами и азолами в реакциях фосфорилирования, используемых в оли-гонуклеотидном синтезе 31
1.4. Механизм образования межнуклеотидной диэфирной связи 44
1.5. Механизм образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфотетразолидов 51
2. Результаты и обсуждение 60
2.1. Нуклеофильный катализ образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии 2.4.6-триизопропилбензолсульфохлорида 60
2.1.1. Влияние 4- N,N -диметиламинопиридина на образование фосфотриэфиров в присутствии арилсульфохлоридов в пиридине 60
2.1.2. Нуклеофильный катализ 4-N ,N -диметиламинопири-ном образования межнуклеотидной .связи в пиридине триэфирным методом 71
2.1.3. Влияние N -метилимидазола, З-нитро-1,2,4-три-азола и тетразола на образование межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфо-хлоридов в пиридине 76
2.1.4. Структура активных фосфорилирующих агентов 84
2.1.5. Влияние нуклеофильных катализаторов на взаимодействие Р-компонента и арилсульфохлорида 94
2.1.6. Схемы реакций, протекающих при образовании фосфотриэфиров 100
2.1.7. Образование межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфохлорида и Л/-метилимидазола или 4- /1/,И/-диметиламинопири.дина в различных растворителях 105
2.2. Синтез олигонуклеотидов 112
3. Экспериментальная часть 119
3.1. Исходные материалы 119
3.2. Основные методы работы 119
3.3. Методики эксперимента 122
3.4. Синтез олигонуклеотидов 126
3.4.1. Межнуклеотидные конденсации 126
3.4.2. Получение Р-компонента 127
3.4.3. Получение ОН-компонента 127
3.4.4. Деблокирование олигонуклеотидов 127
3.4.5. Выделение олигонуклеотидов после деблокирования 134
4. Приложение 138
Выводы 145
- Реакции арилсулъфоазолидов с нуклеофильныш реагентами
- Механизм образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфотетразолидов
- Синтез олигонуклеотидов
- Межнуклеотидные конденсации
Введение к работе
Химический синтез олигонуклеотидов относится к числу важнейших задач биоорганической химии. Широкое использование синтетических олигонуклеотидов в биохимии, генной инженерии, молекулярной биологии служит стимулом для постоянного поиска новых подходов к синтезу этих соединений и углубленного исследования протекающих при этом процессов.
В последние годы наибольшее применение в синтезе олигонуклеотидов нашел триэфирный метод, в котором образование меж-нуклеотидной связи происходит путем конденсации оксигруппы нуклеозидного компонента (ОН-компонент) с блокированной фосфатной группой фосфатного компонента (Р-компонент) в присутствии конденсирующих агентов. До начала выполнения настоящей работы лучшие результаты были получены при использовании в качестве конденсирующих агентов арилсульфотетразолидов, главным достоинством которых, по сравнению с используемыми ранее арил-сульфохлоридами, является существенное ускорение процесса конденсации. Если при синтезе олигонуклеотидов триэфирным методом в присутствии арилсульфохлорида /1,2/ образование межнук-леотидной связи протекает в течение 20-50 часов, то использование арилсульфотетразолидов /3,4/ позволяет сократить время проведения реакции до 1-2 часов. Однако арилсульфотетразоли-ды являются менее доступными, чем арилсульфохлориды, и малостабильными соединениями, хранить которые можно не более одного месяца при пониженной температуре. Введенные позже в практику олигонуклеотидного синтеза арилсульфо-3-нитро~1,2,4-три-азолиды /5/ лишены этого недостатка, но в их присутствии реакции протекают несколько медленнее, чем при использовании арилсульфотетраз олидов.
Таким образом, поиск конденсирующих агентов, позволяющих сократить время, необходимое для образования межнуклео-тидной связи, является актуальной задачей олигонуклеотидного синтеза.
Различие в скоростях образования межнуклеотидной связи в триэфирном методе синтеза при использовании арилсулъфохло-ридов и арилсульфотетразолидов позволило предположить, что причиной ускорения образования фосфотриэфиров в присутствии арилсульфотетразолидов является катализ протекающих при этом реакций выделяющимся при расходовании конденсирующего агента тетразолом по нуклеофильному механизму. Следовательно, реакции, протекающие при образовании межнуклеотидной триэфир-ной связи в присутствии арилсульфохлоридов, более доступных, чем арилсульфотетразолиды, могут быть значительно ускорены эффективными нуклеофильными катализаторами.
Целью настоящей работы явились проверка возможности ускорения образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфохлорида нуклеофильными катализаторами на примере использования 4-N,N -диметиламинопиридина, исследование закономерности образования фосфотриэфиров в присутствии 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида и 4-/V,/V-диметиламинопиридина, /V-метилимидазола, тетразола и 3-нитро-1,2,4-триазола, а также синтез олигонуклеотидов в выбранных в результате исследований условиях.
Большая часть представленных в работе данных получена с использованием импульсной ХР-ЯМР спектроскопии, поскольку этот метод дает возможность регистрировать не только исходные сое.динения и конечные про.дукты реакции, но и сле.дить за промежуточными превращениями Р-компонента.
В работе впервые продемонстрировано эффективное ускоре-
ние 4-А/ ,N -диметиламинопиридином образования фосфотриэфиров при использовании арилсульфохлоридов и показана возможность получения олигонуклеотидов в хлороформе в присутствии Д^-ме-тилимидазола и 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида на примере синтеза ряда олигонуклеотидов.
При исследовании механизма образования межнуклеотидной
триэфирнои связи в присутствии арилсульфохлорида и нуклео-
31 фильных катализаторов методом Р-ЯМР спектроскопии было установлено, что во всех исследованных случаях реакция протекает в две регистрируемые этим методом стадии. На первой стадии взаимодействие исходного Р-компонента с конденсирующим агентом приводит к накоплению тетразамещенного пирофосфата, который на второй стадии превращается в фосфотриэфир. При этом обнаружено, что 4-N,N-диметиламинопирицин и /V-метил-имидазол являются эффективными катализаторами как образования тетразамещенного пирофосфата, так и его взаимодействия с ОН-компонентом, вследствие чего синтез олигонуклеотидов в их присутствии можно проводить в различных растворителях. В то же время тетразол и 3-нитро-1,2,4-триазол не способствуют протеканию первой стадии процесса, что делает необходимым использование пиридина в качестве растворителя, который наряду с N -метилимидазолом и 4-A^/V-диметилшинопириданом катализирует взаимодействие Р-компонента и арилсульфохлорида. Ускорение реакции в присутствии азолов наблюдается только на стадии превращения тетразамещенного пирофосфата в фосфотриэфир. Предположение о нуклеофильном катализе 4-/V,/Y-диметиламинопиридином и N -метилимидазолом реакций, протекающих при образовании межнуклеотидной триэфирнои связи, подтверждается получением и установлением структуры модельных активных фосфорилирующих производных, образующихся в результате взаимодействия дифенилхлорфосфата и катализатора.
Реакции арилсулъфоазолидов с нуклеофильныш реагентами
При взаимодействии арилсульфогалогенидов с незамещенным имидазолом (ЗтН ) реакция протекает через образование промежуточного продукта 16, который может стабилизироваться в результате отщепления протона, превращаясь в арилсульфоимидазолид (JtSOzJm )/20/. Арилсульфоимидазолиды - достаточно стабильные соедине-ния /46/. Каталитическая активность имидазола в реакциях арилсульфогалогенидов значительно ниже активности N-метилимида-зола, близкого к нему по основности, и несколько меньше активности пиридина /20,30,47/. В случае гидролиза арилсульфохлори-да, например, каталитический эффект имидазола меньше эффектаЕсли имидазол по отношению к арилсульфогалогенидам достаточно активен, чтобы атаковать сульфонильный атом серы, то 1,2,4-триазол ( 7г/// ) и тетразол (ТеН ), обладающие более кислотными свойствами, уже не способны в отсутствие основных катализаторов вступать во взаимодействие с арилсульфогалогени-дами. Для получения арилсульфотриазолидов {ЛъОа 7 ti ) и арил-сульфотетразолидов ( dtSOgTe ) реакции обычно проводят в присутствии триэтиламина /3,48,49/. По-видимому, атакующим нуклеофилом в этих реакциях является анион азола Смешанный ангидрид УІ является сильным фосфорилирующим (но не сульфонилирующим) агентом и не регистрируется методом Р-ЯМР спектроскопии в реакционных смесях /50/. В системе происходит быстрое накопление продукта его взаимодействия с... фосфо.диэфиром ІУ - тетразамещенного пирофосфата У. Очевидно, лимитирующей стадией рассматриваемого процесса является образование смешанного ангидрида УІ, поэтому решить вопрос о том, идет ли реакция смешанного ангидрида УІ с фо.сфо.диэфиром ІУ при участии нуклеофильного катализатора.(пиридина или тетразола)кне представляется возможным /50/. Взаимодействие арилсульфотетразолида с фосфодиэфиром ІУ при проведении реакции в пиридине в значительной степени ускоряется кислотами, а присутствие сильного основания - триэтил-амина - резко тормозит этот процесс /51/. Предполагается, что ускорение реакции кислотой может быть вызвано двумя причинами.
Во-первых, кислота может приводить к протонированию арилсуль-фотетразолида и, тем самым, повышать его реакционную способность, облегчая нуклеофильную атаку пири.цином на более электрофильннй атом серы в протонированном арилсульфотетразолиде /51/: Во-вторых, катализ кислотой может быть осуществлен за счет протонирования выделяющегося аниона тетразола, что должно приводить к смещению равновесия в сторону образования смешанного ангидрида УІ /51/: Взаимодействие арилсульфотриазолида с фосфодиэфиром ІУ, так же как и реакция арилсульфотетразолида, протекает лишь в присутствии пиридина и приводит, хотя и с меньшей скоростью, к образованию тетразамещенного пирофосфата У /52-54/. Меньшую реакционную способность арилсульфотриазолидов , по сравнению с арилсульфотетразолидами,можно, по-видимому, объяснить тем, что остаток триазола является более плохой уходящей группой, чем остаток тетразола, из-за более основных свойств триазола. До выполнения настоящей работы в литературе отсутствовали данные о влиянии нуклеофильных катализаторов - пиридинов и N -замещенных имидазолов-на взаимодействие арилсульфохлоридов с фосфодиэфирами. Как показано в гл.2.1,пиридин, 4-;У,Л/-ди-метиламинопиридин и /V-метилимидазол являются нуклеофильными катализаторами реакций арилсульфохлоридов и с этими нуклеофильными реагентами. При этом взаимодействие JnSOgCI с фосфодиэфирами в присутствии катализаторов протекает через промежуточное образование активных сульфонилирующих производных типа I (а, г, д): Пиридины и азолы, катализирующие реакции арилсульфогало-генидов, являются также катализаторами реакций переноса фос-форильных групп, которые часто используются в олигонуклеотид-ном синтезе. При синтезе олигонуклеотидов триэфирным методом в качестве исхо.дных мономеров используют эфиры соответствующе защищенных мононуклеотидов: диэфиры нуклеотидов со свобо.дной оксигруп-пой (ОН-компоненты) и эфиры нуклеотидов, имеющих одну свободную функцию фосфатной группы (Р-компоненты). При использовании в олигонуклеотидном синтезе эфиров 57- нуклеотидов стадия фосфорилирования нуклеозида отсутствует. Если же в качестве исходных мономеров применяют эфиры нукле-озид-3 -фосфатов, необхо.димо провести сначала фосфорилирование з -ОН-группы нуклеозида. ( с целью их получения ).
Б качестве фосфорилирующих агентов чаще всего используют хлорфосфаты или фосфоазолиды в присутствии нуклеофильных катализаторов - пиридинов или N -замещенных имидазолов. Исследование влияния пиридинов на реакции хлорфосфатов было проведено на примере гидролиза хлорангидридов диамидофос-форной кислоты /55/. Установлено, что каталитическая активность пиридинов увеличивается с возрастанием их основности: в присутствии 4-метилпиридина реакция протекает быстрее, чем в присутствии пири.дина. О.днако,поскольку более основный 2,6-диметил-пири.дин оказывает значительно меньшее влияние на скорость гидролиза, чем остальные исследованные пиридины, предполагается, что катализ незатрудненными пиридинами протекает по нуклеофильному механизму/55/. Аналогично происходит ускорение пиридином взаимодействия ди (2-хлорэтил)-фосфохлорида с этанолом /56/. Ускоряются третичными аминами и реакции диалкилфторфосфа-тов. Например, гидролиз фторида диизопропилфосфорной кислоты ускоряется имидазолом, /V-метилимидазолом, несколько хуже пиридином и значительно хуже тетразолом /57/. Поскольку гидролиз диизопропилфторфосфата не ускоряется стерически затрудненными аминами ( триэтиламином, 2-метилимидазолом, 2-меркапто-имидазолом ) предполагается катализ реакции по нуклеофильному механизму. В пользу этого может свидетельствовать высокая реакционная способность диизопропилфосфоимидазолида, полученного при взаимодействии .циизопропилхлорфосфата с имидазолом /57/. При проведении реакции в пиридине, который скорее всего выполняет в данном случае также роль нуклеофильного катализатора, образование фосфотриэфиров УІІІ протекает за 16-20 часов /58-60/. Чаще реакции с хлорфосфатами УІІ проводят в присутствии /V-метилимидазола или N -этил-5-хлор-2-метилимидазо-ла в ацетонитриле или тетрагидрофуране в течение 16 часов /60-64/. Однако, как было показано в работах /65-67/, фосфорилиро-вание нуклеозидов в присутствии Ж-замещенных имидазолов заканчивается уже через 5 минут после начала реакции. Имеются данные по использованию в качестве фосфорилирукь щих агентов хлорангидридов эфиров амидофосфорной кислоты, реакции которых также проводят либо в пиридине /68/, либо в присутствии N -замещенных имидазолов /69/: Это обусловлено большей электрофильностью атома фосфора в дихлоридах IX по сравнению с монохлоридами УІІ за счет замены эфирного остатка на атом хлора - заместитель с большими электроноакцепторными свойствами. Часто дихлорфосфаты IX используют для последовательного фосфорилирования двух нуклеозидов:
Механизм образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арилсульфотетразолидов
Первоначально для синтеза олигонуклеотидов триэфирным методом в качестве конденсирующих агентов использовали арилсу-льфохлориды. Образование межнуклеотиднои триэфирнои связи в этом случае происходит за 16-50 часов /1,2,128-131/. В присутствии арилсульфотриазолидов /48,53,76,77,132/ образование межнуклеотиднои триэфирнои связи протекает несколько медленнее (1-2 дня), чем при использовании арилсульфохлоридов. Практически такая же скорость реакции наблюдается в присутствии арилсульфо-4-нитроимидазолидов/133-135/. Применение в качестве конденсирующих агентов арилсульфотетразолидов /4,85,136-144/ или арилсульфо-З-нитро-1,2,4- три-азолидов /5,81,135,145-149/ позволяет сократить время реакции до 1-2 часов. Механизм образования межнуклеотиднои связи в триэфирном методе синтеза олигонуклеотидов до начала выполнения настоящей работы был мало исследован. Однако в последнее время появились работы по исследованию механизма реакций, протекающих при образовании фосфотриэфиров в присутствии арилсульфотетразолидов в качестве конденсирующих агентов. В литературе представлено несколько гипотез, объясняющих различие в скоростях образования фосфотриэфиров в присутствии арилсульфохлоридов и арилсульфотетразолидов. В работе /150/ на основании факта ускорения реакции в присутствии JxSO Tet по сравнению с JrSOaCL предполагается, что различие в механизме этих реакций заключается в образовании разных по активности фосфорилирующих производных при взаимодействии Р-компонента с конденсирующими, агентами. Предполагается, что в присутствии арилсульфохлорида основным фосфорилирующим агентом является смешанный ангидрид фосфоди-эфира и арилсульфокислоты УІ, который получается в результате прямого взаимодействия арилсульфохлорида с фосфодиэфиром ІУ (схема 10). Смешанный ангидрид УІ, обладающий фосфорилирующими свойствами, по мнению авторов /150/, вступая во взаимодействие с ОН-компонентом приводит к образованию межнуклеотидной триэфир-ной овязи (путь I).
Кроме того, он может реагировать с оставшимся в реакционной смеси фосфодиэфиром ІУ (сильным нуклеофи-лом), что приводит к образованию тетразамещенного пирофосфата У (путь 2). Пирофосфат У , по мнению авторов, не обладает фос-форилирующей активностью из-за стерической затрудненности и является побочным продуктом реакции, образование которого понижает выход целевого продукта реакции /150/. В присутствии арилсульфотетразолида, как считают авторы той же работы /150/, основным фосфорилирующим агентом является фосфотетразолид ХУ (схема II), который вступает во взаимодействие с ОН-компонентом значительно быстрее, чем смешанный ангидрид УІ, что и приводит к быстрому завершению образования триэфирной межнуклеотидной связи. Образование фосфотетразолида ХУ происхо.дит в результате атаки смешанного ангидрида УІ тетразолом, выделяющимся по. мере расходования конденсирующего агента (путь I, схема II). Образование тетразамещенного пирофосфата У по реакции смешанного ангидрида УІ с фосфодиэфиром ІУ может протекать и при использовании этого конденсирующего агента (путь 2). Однако пи-рофосфат У также будет подвергаться нуклеофильной атаке тетразолом ( объем которого много меньше, чем объем СН-компонен-та), что должно приводить к образованию активного фосфотетразолида ХУ. В работе /ИЗ/ авторами предложена схема образования меж-нуклеотидной триэфирной связи, которая может объяснить протекание реакций как в присутствии арилсульфохлоридов, так и других конденсирующих агентов -. арилсульфотетразолидов и арил- сульфотриазолидов ( схема 12). Основанием для выбора этой схемы,наряду с ускорением реакций в присутствии J SO Te является предложенный в работе /107/ механизм нуклеофильного катализа реакций переноса фосфорильных групп имидазолом (см. схему 6, стр.39). Как считают авторы работы /ИЗ/, взаимодействие конденсирующего агента с Р-компонентом (ІУ) приводит к образованию смешанного ангидрида УІ, который в результате нуклеофильной атаки тетразолом,выделяющимся при расходовании J SQ let , превращается в фосфотетразолид в протонированной форме ХУа. Это соединение (ХУа) может стабилизироваться, отщепляя протон и превращаясь в нейтральное, по мнению авторов,устойчивое соединение ХУ со слабыми фосфорилирующими свойствами. Второй и основной путь превращения фосфотетразолида ХУа - это взаимодействие его с ОН-компонентом, которое приводит к образованию фосфотриэфира УIII. Образование тетразамещенного пирофосфата У при взаимодействии протонированного фосфотетразолида ХУа с мононуклеотидом ІУ авторами работы /ИЗ/ не отвергается, но считается малосущественным событием. Основным отличием схемы 12, предложенной для случая образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии арил-сульфотетразолида,от схемы II является то, что активным фос-форилирующим агентом авторы работы /ИЗ/ считают протонирован-ный фосфотетразолид ХУа. Исследование механизма образования межнуклеотидной триэфирной связи в присутствии JiSOzTet методом Р-ЯМР спектроскопии позволило авторам работ /50,51/ предложить схему протекающих при этом реакций, основанную,в отличие от представленных выше, на экспериментальных данных (схема 13).
Было установлено, что в присутствии арилсульфотетразолида образование межнуклеотидной триэфирной связи протекает в две регистрируемые методом Р-ЯМР стадии через промежуточное образование тетразамещенного пирофосфата У /51/. Таким образом, направление реакции через промежуточное накопление тетразамещенного пирофосфата У является основным, а не малосущественным событием, как это предполагается в работе /ИЗ/. При этом первая стадия - взаимодействие арилсульфотетразолида с фосфодиэфиром, - как уже говорилось выше (см.гл.1.2), ускоряется пиридином по механизму нуклеофильного катализа посредством образования сульфонилирующего пиридиниевого производного 1г и далее смешанного ангидрида УІ. Ускорение образования фосфотриэфира при использовании арилсульфотетразолида по сравнению с реакцией, протекающей в присутствии арилсульфохлорида, наблюдается на второй стадии реакции - превращении пирофосфата У в фосфотриэфир УІІІ-по механизму нуклеофильного катализа тетразолом через промежуточное образование фосфотетразолида ХУ /51/. Кроме того, на второй стадии фосфотетразолид может образовываться также в результате атаки тетразолом смешанного ангидрида УІ и далее, в отсутствие высоких концентраций Р-компонента, превращаться в фосфотриэфир УШ при взаимодействии с ОН-компонен-том. Этот путь реакции предполагается основным путем образования фосфотриэфиров в схемах II и 12. Выше уже были подробно представлены данные по фосфорилирующим свойствам пирофос-фатов У в присутствии тетразола и пиридина и фосфотетразоли-дов ХУ (см.гл.1.3). Нуклеофильным катализатором в реакциях образования межнуклеотиднои триэфирной связи в присутствии арилсульфотетразолида является, таким образом, на первой стадии - пиридин, катализирующий реакциии арилсульфотетразолида, а на второй стадии - анион тетразола, образующийся в присутствии какого-либо основания, втом числе пиридина, использующегося в качестве растворителя. Основным фосфорилирующим агентом в реакциях образования межнуклеотиднои триэфирной связи является нейтральный фосфотетразолид ХУ. В присутствии арилсульфотриазолида образование межнуклеотиднои триэфирной связи протекает даже медленнее, чем в присутствии арилсульфохлорида /48/. При использовании JiSO& Tw , так же как и в случае использования AtSOzTet t вначале происходит взаимодействие Р-компонента с конденсирующим агентом с образованием тетразамещенного пирофосфата У. Однако это превращение идет несколько медленнее, чем в присутствии арилсульфотетразолида /52-54/ (см.гл.1.2). Замедление образования фосфотриэфира в случае использования Аь0&Тхі обусловлено образованием и накоплением в реакционной смеси триазолида фосфодиэфира XI, который, как уже говорилось выше (см.гл.1.3), является менее реакционно-способным соединением по сравнению с фосфотетразолидом ХУ. На основании литературных данных можно представить следующую схему реакций, протекающих при образовании межнуклео-тидной связи в присутствии арилсульфотриазолида (схема 14):
Синтез олигонуклеотидов
В настоящее время смесь арилсульфохлорида и /У-метилими-дазола, предложенная для получения олигонуклеотидов триэфирным методом при использовании п -хлорфениловых эфиров з -нуклео-тидов /113,154/, находит все большее применение /60,158-164/. В предыдущем разделе было показано, что /У-метилимидазол является наиболее эффективным катализатором образования меж-нуклеотидной триэфирной связи при использовании TPS ,так как реакции, протекающие в его присутствии, имеют наибольшую скорость и использование пиридина как растворителя не является обязательным. Кроме того, в отличие от реакций, катализируемых 4-Л/,Л/-даметиламинопиридином, образование межнук-леотидной триэфирной связи в присутствии TPS и MeJm не сопровождается протеканием побочных процессов, которые приводят к понижению выхода целевого продукта. На основании полученных в настоящей работе данных, синтез олигонуклеотидов осуществляли в присутствии M&Jm. в качестве нуклеофильного катализатора и TPS - конденсирующего агента ( 2 экв. MeJm по отношению к TPS ). Известно, что синтез олигонуклеотидов можно проводить, используя в качестве исходных мономеров п -хлорфениловые эфи-ры как з -нуклеотидов /4,136/, так и 5 -нуклеотидов /139,142/. Мы сравнили скорость образования межнуклеотидной триэфир ной связи в этих двух случаях на примере синтеза динуклеотидов (T i)T Т(Лс) и (CNEt)pT 7 Г (Lev) в хлороформе в присутствии 0.3 М TPS и 0.9 М MeJm . Сравнение проводили по данным спектров ХР-ЯМР реакционных смесей, полученных при вз аим о действии (ft) Тр(С/Рк)( 0.1 М) с Т(Ас) (0.1 М) VL(CNEt)zpT (0.1 М) с (C/Ph)pT(Lev) (0.1 М). За образованием динуклеотидов следали по увеличению интенсивности сигналов межнуклеотидного триэфирного фосфата с хим-сдвигом -7.2 и -7.6 м.д..в случае получения (Тъ)Т Т(Ас) и химсдвигом -7.0 и -7.7 м.д. в случае - (CAZEi) pT T(lev). Из кинетических кривых накопления динуклеотидов, представленных на рис.19, видно, что скорости образования межнуклеотидной связи различаются примерно в .два раза ( г у л обра-. зования (Т%)Т +Т(Ас) - 2.5 жъ,(СМЕ1)грТ Т(1еу) - 5мин), примерно так же,как при использовании в качестве конденсирую- щего агента арилсульфотетразолида /52/. Небольшое различие в скоростях реакций позволяет использовать эфиры б -нуклеотидов для синтеза олигонуклеотидов в присутствии TPS и MeJm . В качестве исходных мономеров были выбраны N -ацил-нуклеозид-5 -( п -хлорфенил, -цианэтил)-фосфаты (ОН-компо-нент и /У-ацил-з -0-левулинил-нуклеозид-5, (/2-хлорфенил)-фосфаты (Р-компонент). Аминогруппы гетероциклических оснований блокировали обычным способом: 4-НИг цитидина - анизоиль-ной, 2 Шг гуанина - изобутирильной, 6-/1/// аденина - бензоиль-ной защитными группами. Для блокировки 5 -концевого фосфата олигонуклеотида использовали бис-цианэтильную группу /139/.
Из исследованных нами растворителей ( пиридина, ацетонит-рила и хлороформа) наиболее целесообразно, по нашему мнению, использовать хлороформ. Применение его в качестве растворителя позволяет исключить ряд стадий при выделении олигонуклео-тидного блока, обеспечивает низкую вязкость растворов реакционных смесей. Кроме того, хлороформ легко подвергается очистке и негигроскопичен. Синтез олигонуклеотидов осуществляли блочным методом по схемам, представленным на рис.20. Условия синтеза динуклеотидов и олигонуклеотидов на отдельных стадиях конденсации и выходы продуктов реакций приведены в табл.5-11 (гл.3.4). Для наращивания олигонуклеотидной цепи блочным методом Р-компонент получали удалением б -Р-защитной В -цианэтиль-ной группы обработкой полностью защищенного олигонуклеотидно-го блока смесью абсолютных ацетонитрила и триэтиламина в соотношении 1:1 ( v/v )/165/. ОН-компонент получали удалением с олигонуклеотидного блока 3 -О-левулинильной группы обработ- кой гидразин-гидратом /133/. Р- и (И- компоненты использовали в реакциях в соотношениях, близких к эквимольным. Хорошая растворимость компонентов реакции в хлороформе и низкая вязкость растворов реакционных смесей дают возможность проводить конденсацию олигонуклеотидных блоков при высокой концентрации (0.2. М растворы Р-компонентов). Конденсирующий агент - TPS - использовали в трехкратном избытке по отношению к Р-компоненту. Время конденсации составляло 10-20 минут. Полностью защищенные олигонуклеотидные блоки после конденсации выделяли хроматографией на силикагеле. Использование хлороформа в качестве растворителя позволяет хроматографировать реакционную смесь сразу же после проведения конденсации без предварительных обработок ( упаривание растворителя, экстракция), и, таким образом, сокращает время проведения . одного цикла наращивания олигонуклеотидной цепи на одно звено до 1.5 часов. Выхода олигонуклеотидов на стадии конденсации составляют в среднем 75-85$ (см. табл. 5-П).
Отсутствие водных обработок на протяжении всего цикла позволяет исключить предварительное высушивание компонентов реакции упариванием с пиридином. Осажденные гексаном Р- и ОН-компоненты выдерживали перед конденсацией в вакууме над Рг О? . Неосажденные олигонуклеотидные блоки предварительно упаривали с абсолютным хлороформом для удаления следовых количеств спирта, остающихся после их хроматографического выделения. Полностью деблокированные олигонуклеотиды выделяли ионообменной хроматографией. Результаты анализа методом обращенно-фазовой хроматогра- фии (см.гл.3.4), а также выходы олигонуклеотидов на стадии конденсации и после деблокирования позволяют заключить, что арилсульфохлорид в смеси с N -метилимидазолом в качестве конденсирующего агента в хлороформе не только не уступает арил-сульфотетразолиду, обычно используемому в олигонуклеотидном синтезе в пиридине, но и позволяет сократить время межнуклео-тидной конденсации, упростить процедуры выделения олигонукле-отидного блока. В работе использовали 4-/\/,/У диметиламинопиридин (фирма "Вегкатеп "t Западный Берлин), /V-метилимидазол ( фирма "босс", ФРГ), тетразол (производство Сибирского НИИ земледелия и химизации сельского хозяйства), 3-нитро-1,2,4-три-аз ол, 2,4,6-трииз опропилб енз олсульфохлорид,5-0-тритилтимидин, N -ацил-з -О-левулинил-нуклеозид-б -С п -хлорфенил)-фосфаты, А/ -ацилнуклеозид-5 -(я -хлорфенил,-цианэтил)-фосфаты, N -ацилнуклеозид-5 -бис-цианэтилфосфаты ( производство ОХП НИОХ СО АН СССР),j& -цианэтанол (х.ч.). Другие соединения были синтезированы по методикам, предложенным в работах: з -О-ацетилтимидин - /166/, дифенилхлор-фосфат - /167/, N -бензилимидазол - /168/. Триэтиламин и трибутиламин (марки х.ч.) перед использованием перегоняли над КОН и Р2Оу . В качестве растворителей использовали: хлористый метилен и хлороформ перегнанные над Рг 0$ хранили над А12 Оъ ди океан, перегнанный над КОН и натрием; бензол и серный эфир, перегнанные над натрием; пиридин, перегнанный над /г-толуол-сульфохлоридом и Р205 , ацетонитрил, перегнанный над Рг05 хранили над молекулярными ситами типа 4А. 3.2. Основные методы работы. Хроматография на бумаге (БХ). В работе применяли нисходящую хроматографию на бумаге FN-1 (ГДР) в следующих системах растворителей: система А: этанол - IM ацетат аммония (рН 7.5), 5:2 система Б: изопропанол - аммиак - вода , 7:1:2 Вещества на хроматограммах, поглощающие в УФ-области, обнаруживали с помощью ультрахемископа Брумберга. Оптическую плотность растворов , измеряли на спектрофотометре СФ-І6. Упаривание растворов проводили на роторном испарителе "Such/ "(Швейцария) при 10-15 мм.рт.ст. и 30С. Тонкослойная хроматография(ТСХ). ТСХ проводили на пластинках KieselqeL 60 фирмы "AlezcA "(ФРГ) в системах растворителей:
Межнуклеотидные конденсации
Навески Р- и ОН- компонентов сушили в вакууме над РоОс, растворяли в хлороформе (0.2 М раствор Р-компонента) и добавляли навеску TPS ( 3 экв. по отношению к Р-компоненту) и MaJm (2 экв. по отношению к TPS ). За ходом реакции следили по данным ТСХ в системе 4 по исчезновению в реакционной смеси ОН-компонента. Через 10-20 мин реакционную смесь наносили на колонку с силикагелем ( 70 мл). Целевой продукт элюи-ровали градиентом концентрации этанола ( до 10-15$) в хлороформе ( 700 мл ). Фракций, содержащие продукт конденсации,объединяли, упаривали, растворяли в хлороформе и осаждали гексаном. Условия синтеза динуклеотидов приведены в табл.5. Условия синтеза олигонуклеотидов приведены в табл.6-11. 3.4.2. Получение Р-компонента. Для удаления -цианэтильной фосфатной защитной группы олигонуклеотидный блок, полученный в результате межнукле-отидной конденсации, обрабатывали 50-кратным избытком абсолютного триэтиламина в ацетонитриле ( 1:1, v/v ) /165/ в течение 1-І.5 ч. После завершения реакции реакционную смесь упаривали досуха, растворяли в хлороформе и осаждали гексаном. 3.4.3. Получение СН-компонента. Для удаления з -О-левулинильной группы /133/ олигонуклеотидный блок, полученный в результате межнуклеотидной конденсации, растворяли в смеси пиридин-уксусная кислота (4:1, v/v ). К 0.1 М раствору олигонуклеотида добавляли при перемешивании гидразин-гидрат ( 10-кратный избыток по отношению к олигонук-леотиду) и выдерживали 3-4 мин, после чего оставшийся гидразин-гидрат разлагали ацетилацетоном ( 2 экв. по отношению к гидразин-гидрату) и выдерживали еще 5 мин /133/. Полученный раствор упаривали досуха, упаривали с толуолом для удаления пири-диний ацетата и хроматографировали на колонке с силикагелем ( 70 мл) в градиенте концентрации этанола ( до 10-20$) в хлороформе (700 мл). Фракции, содержащие продукт, объединяли, упаривали, растворяли в хлороформе и осаждали гексаном. Выход СН-компонента составляет 80-100$. олигонуклеотид водно-пиридиновым раствором п -нитробензаль-доксимата тетраметилгуанидина в течение 18-20 ч при 20С/83/.
Раствор упаривали досуха и обрабатывали конц. аммиаком в течение двух суток при комнатной температуре. 3.4.5. Выделение олигонуклеотидов после деблокирования. а). Гексануклеотид pGTGTGTвыделили ионообменной хроматографией на колонке (1.5x30 см) с аминохромом АСо-300 (Н?Р0/") в градиенте концентрации KHgPO.-KgHPO. в 30$ ацетонитриле, рН 7.5 (0-0.05 М, 1000 мл, 500 мл/ч). Из 4500 0Е260 полностью блокированного олигонуклеотида было выделено 1250 0Е260 целевого продукта. б). Гексануклеотид рАСАСАС выделили на колонке (1.5x30 см) с аминохромом АСо-300 (Нг Р0/ ) в градиенте концентрации KHgPO KgHPC в 30$ ацетонитриле, рН 7.4 (0-0.05 М, 1000 мл, 500 мл/ч). Из 5400 OE gQ полностью блокированного гексанук- . леотида было выделено 2230 0Е26п целевого продукта (рис.21а). в). Октануклеотид pCGAATTCG выделили хроматографией на колонке (1.5x30 см) с аминохромом АСд-300 (Н РОд") в градиенте концентрации КН РО К НРО в 30$ ацетонитриле, рН 7.1 (0-0.25 М, 1000 мл, 500 мл/ч). Из 1000 0Е260 полностью блокированного октануклеотида было выделено 375 0Е260 целевого продукта (рис.21в). г). Ундекануклеотид р TGCTCT6G ТТТ выделили хроматографией на колонке (1.5x15 см) с ПЕЛЕ -целлюлозой JJE -32 (СГ) в градиенте концентрации NaCL в 7 М мочевине, рН 7.5 (0-0.35 М, 600 мл, 30.5 мл/ч). После рехроматографии при тех же условиях, но при рН 3.7 получено 420 0E2gg ундекануклеотида (из 1340 OEggQ полностью блокированного олигонуклеотида). д). Додекануклеотид р GAA СТ6СТССТС выделили хроматографией на колонке (1.5x30 см) с аминохромом АСо-300 (Н2Р0, ) в градиенте концентрации KELgPO -KgHPO в 20$ ацетонитриле, рН 7.3 (0-0.12 М, 1000 мл, 500 мл/ч). Из 2400 0E26Q полностью блокированного олигонуклеотида было выделено 600 ОЕ целевого продукта (рис.216). є). Гекоадекануклеотид pCATGCAAAACCTTCCC выделили хроматографией на колонке (1.5x30 см) с аминохромом АСо-300 (Н2Р04 ) в градиенте концентрации KHgPO.-KgHPO. в 30$ ацетонитриле, рН 7.1 (0-0.25 М, 1000 мл, 500 мл/ч). Из 1500 0Е260 полностью блокированного олигонуклеотида было выделено 150 ОЕ260 целевого продукта (рис.21г). Гомогенность полученных олигонуклеотидов проверяли микроколоночной хроматографией на обращенной фазе ( рис.22). При синтезе олигонуклеотидов диэфирным методом в присутствии арилсульфохлорида в работе /172/ рекомендовано проводить предактивацию Р-компонента перед проведением межнуклео-тидной конденсации, суть которой сводится к взаимодействию Р-компонента с арилсульфохлоридом в отсутствие ОН-компонента. При этом происходит,как уже говорилось в гл.1.3, образование активного фосфорилирующего пиридиниевого производного ХУІа. Поскольку, как было показано выше (гл.2.1.4), при взаимодействии дифенилфосфорной кислоты с арилсульфохлоридом в присутствии 4-/У,/У-диметиламинопиридина происходит накопление в реакционной смеси наряду с тетрафенилпирофосфатом ZPMAP-производного .дифенилфосфорной кислоты ХІУв (R=R =Ph. ), можно было бы ожидать и в случае взаимодействия п -хлорфенило-вого эфира нуклеотида 1Ув с TPS в присутствии И MAP ре-гистрации в спектрах ХР-ЯМР реакционной смеси сигналов соответствующего JJMAP -производного нуклеотида типа ХІУв: ЯТ Однако в спектрах Р-ЯМР реакционной смеси, полученной при взаимодействии (CIPh)pT(Lev) (0.1 М) с TPS (0.3 М) и DM АР (0.6 М) в хлороформе через 5 минут после начала реакции, наряду с сигналом тетразамещенного пирофосфата Ув с центром при -19.2 м.д., регистрируется сигнал с химс.двигом в области -ІЗ м.д., который по положению в спектре не может быть отнесен к сигналу DMAP -производного эфира нуклеотида типа ХІУв (рис.23а).
Наличие фрагмента 4-yV, Л/-диметиламино-пиридина в соединении ХІУв должно сдвигать положение сигнала этого производного в спектре ХР-ЯМР на 2-3 м.д. в область сильного поля относительно сигнала исходного фосфодиэфира, как это наблюдается в случае DMAP -производного дифенилфос-форной кислоты ХІУв {R=R=Ph). С течением времени интенсивность сигнала в области -13 м.д. уменьшается, одновременно происходит усложнение структуры сигналов в области -19 м.д. и появляются сигналы с 8 -8.3 м.д. и -12.2 м.д. Интенсивность последнего сигнала с течением времени растет (рис.236) и через 24 часа соединение с химс.двигом -12.2 м.д. становится единственным продуктом реакции, регистрируемым в спектре Р-ЯМР реакционной смеси (рис.23в). Аналогичные превращения п. -хлорфенилового эфира нуклеотида 1Ув в присутствии TPS и DMAP происходят и в пиридине - конечный продукт реакции имеет в спектрах реакционной смеси сигнал с химсдвигом -12.0 м.д. Мы предположили, что соединение с 8 -12.2 м.д. (в хлороформе) имеет структуру DMAP -производного п -хлорфенилового эфира фосфорной кислоты ХУІ6 ( Р=С/РА): При действии на фениловый эфир мононуклеотида (РА)рТ(Ас) (0.1 М) смеси TPS (0.3 М) и DM АР (0.6 М) в пиридине че-рез 24 часа в спектре 0±Р-ЯМР реакционной смеси регистрируется сигнал с о -II.9 м.д., который полностью совпадает с сигналом 2)MAP -производного фенилфосфорной кислоты ХУІб (R-Ph. ), полученного при обработке фенилфосфорной кислоты в пиридине смесью TPS и DMAP. Таким образом, при взаимодействии Р-компонента со смесью TPS и Л МАР не происходит накопление активного фосфорили-рующего агента типа ХІУб, а наблюдается деструкция /z-хлор-фенилового эфира нуклеотида. Можно предположить, что этот процесс происходит в результате нуклеофильной атаки $-A/,/V диметиламинопиридином 5 -CHg-rpynnbi нуклеотида в тетразамещен-ном пирофосфате типа У: Таким образом, причина низкого выхода динуклеотидов при проведении реакции в присутствии TPS и DtAAP ,очевидно, объясняется деструкцией Р-компонента, протекающей параллельно с образованием межнуклеоти.дной триэфирной.связи. В присутствии А/-метилимидазола (0.6 М) в спектрах реакционной смеси, полученной при взаимодействии (ClPh)pT(Le.v) (0.1 М) и TPS (0.3 М) в хлороформе при 30С в течение первых 15 минут реакции регистрируется только сигнал тетразаме-щенного пирофосфата Ув с химсдвигом в области-19 м.д.( в присутствии ОН-компонента за это время происходит почти полное образование межнуклеоти.дной триэфирной связи).
