Содержание к диссертации
Введение
1. Молекулярные аспекты взаимодействия белков семейства С5-цитознновых ДНК-мстилтрансфсраз и семейства Сго-белков и репрессоров с ДНК 11
1.1. Классификация ДНК-связывающих белков 11
1.2. Строение и свойства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 13
1.2.1. Функции ДНК-метилтрансфераз 14
1.2.1.1. Биологическое значение метилирования ДІЖ в прокариотах 14
1.2.1.2. Биологическое значение метилирования ДНК в эукариотах 15
1.2.2. Первичная структура С5-іштозшіовьк ДНК-мстилтрансфсраз 17
1.2.3. Пространственная структура С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 20
1.2.4. Механизм катализа переноса мстилыюй группы С5-цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами 24
1.2.5. Молекулярные механизмы взаимодействия С5-цитозиновых ДНК-метилтрапсфсраз с ДНК-субстратом и кофактором 28
1.2.5.1. Особенности связывания ДНК С5-цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами 28
1.2.5.2. Структурные аспекты ДНК-белкового узнавания в комплексах С5-ЦИТОЗИНОВЫХ ДНК-метилтрапсфсраз 30
1.3. Строение и свойства Сго-белков и репрессоров 34
1.3.1. Структурный мотив «спираль-иоворот-спираль» 35
1.3.2. Представители, входящие в семейство Сго-белков и репрессоров 38
1.3.3. Биологические функции фаговых репрсссоров и Сго-бслков. Регуляция генов в жизненном цикле бактериофага X 39
1.3.4. Структура Сго-бслков и репрсссоров 43
1.3.5. Механизм связывания Cro-белков и репрессоров с ДНК 45
1.3.6. Белок-белковые взаимодействия в структурах Cro-белков и репрсссоров 49
2. С5-цнтозшіопан ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с про.чоториой областью генов системы рестрикции-модификации SsoII 54
2.1. Разработка методики определения пеметилирусмого остатка 21-дезоксицитидипа в участке метилирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 55
2.1.1. Установление специфичности действия ДНК-мстилтрансфсразы NlaX 59
2.2. Фермент модификации SsoII как С5-цитозиновая ДНК-мстилтрансфсраза 64
2.2.1, Равновесное связывание мстилтрансферазы SsoII с участком метилирования 67
2.2.2, Идентификация групп атомов участка метилирования, взаимодействующих с мстшпрансферазой SsoII при формировании специфического комплекса 73
2.2.2.1, Взаимодействие мстилтрансферазы SsoII с ^модифицированными ДНК-субстратами 73
2.2.2.2. Взаимодействие метилтрансферазы SsoII с ДНК-субстратами, содержащими З-мстил-З'-дезоксицитидип водной из цепей участка метилирования 78
2.2.3, Роль Cysl42 каталитического центра мстилтрансферазы SsoII в связывании ДНК 84
2.3. Изучение роли метилтрансферазы SsoII в процессе дезаминирования метилируемого цитозииа 96
2.4. Регуляция в системе рестрикции-модификации SsoII. Фермент модификации SsoII как регуляторі или белок 100
2.4.1. Исследование равновесного связывания метилтрансферазы SsoII с «регуляториым» участком ДНК 102
2.4.2. Идентификация групп атомов «регуляторного» участка ДНК, взаимодействующих с метилтрансферазой SsoII при формировании специфического комплекса 103
2.4.3. Ковалсптпос присоединение метилтрансферазы SsoII к ДНК- лигаидам, содержащим 2*-альдегидпую группу 107
2.5. Анализ ДНК-белковых контактов в комплексах метилтрансферазы SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования 114
2.6. Моделирование ДНК-белковых взаимодействий в комплексах метилтрансферазы SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования 115
3. Экспериментальная часть 125
3.1. Реактивы и материалы 125
3.2. Приборы и методы 127
3.3. Общие методики 129
3.3.1. Введение згР-мстки в ДНК 129
3.3.2. Определение пуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК 129
3.3.3. Исследование равновесного связывания ДНК-метилтрансфсразы SsoII с ДНК-лигапдами 130
3.3.4. Метод «отпечатков» с использованием ІЧ-зтил-М-нитрозомочевиньї в качестве модифицирующего реагента 130
3.3.5. Метод «отпечатков» с использованием диметилсульфата в качестве модифицирующего реагента 131
3.3.6. Метод «отпечатков» с использованием муравьиной кислоты в качестве модифицирующего реагента 132
3.3.7. Метод «отпечатков» с использованием гидразина в качестве модифицирующего реагента 132
3.3.8. Ковалентное присоединение ДНК-метилтрансфераз NlaX и SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим 5-фтор-2*-дезоксицитидин 132
3.3.9. Ковалентное присоединение ферментов нуклеинового обмена к ДНК-дуплексам, содержащим фосфорилднсульфидную межііуклеотидиуга группу 133
3.3.10. Ковалентное присоединение ДНК-мстилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим 2'-альдегидную группу 133
3.3.11. Определение эффективности взаимодействия метилтрансфераз NlaX и SsoII с ДНК-субстратами 134
3.3.12. Определение нсметилируемого остатка 2'-дезоксицитидина в участке узнавания цитозиновыхДНК-метилтраисфераз 134
3.3.13. Молекулярное моделирование 135
Выводы 139
- Строение и свойства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
- Строение и свойства Сго-белков и репрессоров
- Фермент модификации SsoII как С5-цитозиновая ДНК-мстилтрансфсраза
- Изучение роли метилтрансферазы SsoII в процессе дезаминирования метилируемого цитозииа
Введение к работе
Метилирование ДНК ферментами модификации - мстилтрансферазами - является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. ДНК-мстилтрансферазы (МТазы) обнаружены в различных про- и эукариотических объектах [1]. У эукариот метилирование ДНК неотделимо от протекания таких биологических процессов, как генная экспрессия, эмбриональное развитие, геномный «импринтипг», инактивация Х-хромосомы, генетические болезни, генетические мутации и онкогеииые заболевания. В прокариотах МТазы в большинстве случаев являются компонентами систем рестрикции-модификации (Р-М). Системы Р-М являются защитным механизмом прокариотических организмов против проникновения в клетку чужеродной ДНК. Ключевыми процессами, сопровождающими функционирование систем Р-М, являются репликация и репарация ДНК.
Важным направлением современных исследований систем Р-М является изучение особенностей регуляции генной экспрессии образующих их ферментов - ДНК-мстилтрансфераз и эндонуклеаз рестрикции. ДНК клетки-«хозяина» защищена от гидролиза эндонуклеазой рестрикции посредством специфического метилирования. Очевидно, что нарушение механиз.ма метилирования «хозяйской» ДНК приведет к ее фрагментированию эндонуклеазой рестрикции и, как следствие, к гибели клетки. Однако, несмотря на то, что потенциальная важность регуляции генной экспрессии в системах Р-М очевидна, механизмы, объясняющие этот процесс, вес еще мало изучены. Для ряда систем рестрикции-модификации (PvuII, BamHI, Есо721) показано, что С-белок - продукт гена С, лежащего сонаправлено с геном эндонуклеазы рестрикции, стимулирует экспрессию последнего [2-4], В системах Р-М EcoRII, Mspl и SsoII метилтрапсферазы действуют не только как ферменты модификации, по и как транскрипционные рспрсссоры, которые способны связываться с
собственными промоторными областями и регулировать экспрессию собственных генов [5-8].
Объектом нашего исследования является метилтрансфераза SsoII (M.SsoII), входящая в систему рестрикции-модификации SsoII [9]. M.SsoII узнает з двутяжевой ДНК нуклеотиднуго последовательность 5'-CCNGG-3' (N = Л, Т, С, G) и в присутствии кофактора 5-аденозил-Ь-метионина метилирует внутренний остаток цитозииа с образованием 5-мстшшитозипа [10]. К началу выполнения настоящей работы была показана способность M.SsoII осуществлять регуляторную функцию, формируя специфический и стабильный комплексне промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII [7, 8]. Однако, в отличие от систем Р-М EcoRII и Mspl для системы SsoII характерна сопряженная регуляция экспрессии генов эндонуклеазы рестрикции и мстилтрансферазы. M.SsoII не только ннгибирует свой собственный синтез, но и активирует синтез эндонуклеазы рестрикции SsoII.
Целью настоящей работы являлось сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковых комплексов M.SsoII с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Для решения поставленной задачи использован комплексный подход, включающий идентификацию групп атомов ДНК (методом «отпечатков») и аминокислотных остатков фермента (методом региоселсктивного ковалентного присоединения нуклеиновой кислоты к белку), участвующих в формировании ДНК-белковых комплексов; определение констант диссоциации, характеризующих связывание M.SsoII с ДНК-лигандами; компьютерное моделирование белково-нуклсиповых взаимодействий в комплексах M.SsoII с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и с участком метилирования ДНК. Отдельной задачей в рамках настоящего исследования стало определение субъединичной структуры M.SsoII при связывании с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Для этого впервые использованы ДИК-дуплсксы, содержащие альдегидную группу в 2'-положеиии углеводного фрагмента.
Вопрос о том, каким образом С5-цитозиновые МТазы катализируют реакцию переноса метильной группы в С5-положение цитозина практически решен. В то же время механизмы узнавания МТазами определенной нуклеотидной последовательности в ДНК и местоположения метилируемого dC еще недостаточно изучены. Поэтому данная работа в значительной степени направлена на изучение связывания M.SsolI с участком метилирования ДИК. Особое внимание уделено исследованию роли Cysl42 каталитического центра M.SsolI во взаимодействии с углеводофосфатным остовом ДНК. Впервые для изучения МТаз были использованы ДНК-дуплексы, содержащие фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.
В ходе работы была предложена методика определения местоположения иеметилируемого dC в участке узнавания цнтозиновых ДНК-метилтрансфсраз, основанная па использовании бисульфптной реакции в сочетании с ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой.
Полученные в настоящей работе данные позволили охарактеризовать механизмы образования специфических ДНК-белковых комплексов M.SsolI с участком метилирования и промоторпой областью системы Р-М SsoII и предложить модель взаимодействия С5-цитозиновой ДНК-мстилтрапсферазы SsoII с ДНК как бифункционального белка.
Работа содержит литературный обзор, посвященный молекулярным аспектам взаимодействия семейства С5-цнтозиновых ДНК-метилтрансфсраз и семейства Cro-белков и репрессоров с ДНК.
Строение и свойства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
ДНК-метилтрансферазы (МТазы) - это ферменты, узнающие в двутяжевой ДНК короткие нуклеотидные последовательности (2-8 н.п.) и катализирующие перенос мстилыюй группы с кофактора З-аденозил-Ь-метионина (AdoMet) на остатки цитозина или адснина [1] (рис. 1). В зависимости от места модификации субстрата ДНК-метилтрансферазы могут быть подразделены на МТазы, метилирующие экзоиикличсский атом азота цитозина (т4С-МТазы) или адснина (т6А-МТазы) и МТазы, метилирующие цитозин по С5-атому (т5С-МТазы). Последние были обнаружены как в прокариотах, так и в эукариотах. При рассмотрении семейства ДНК-метилтраисфсраз основное внимание будет уделено т5С-МТазам, поскольку они являются наиболее охарактеризованным подсемейством. ДМК-метилтрансфераза SsoII — объект нашего исследования также является т5С-МТазой. У прокариот МТазы, как правило, являются компонентами систем рестрикции-модификации (Р-М), призванных предупредить репликацию чужеродной ДИК, проникшей в клетку-«хозяина», и обеспечить генетическую изоляцию определенного вида бактерий [18]. Системы Р-М состоят из МТазы и эндонуклеазы рестрикции. Чужеродная ДНК подвергается сайт-специфическому растеплению эндонуклеазой рестрикции, в то время как «хозяйская» ДНК защищена от гидролиза метилированием соответствующей МТазой [18, 19]. На сегодняшний день известно около 2000 различных систем рестрикции-модификации [20]. Около 50% штаммов различных бактерий, протестированных на наличие систем Р-М, содержат как минимум одну систему [21]. Вместе с тем некоторые бактериофаги содержат в своих геномах гены ДНК-мстилтрансфераз. Эти МТазы, метилируя фаговую ДНК, повышают ее устойчивость к эндонуклеазам рестрикции при проникновении в штаммы бактерий [18]. Более того, МТаза Dam фага Р1 необходима для правильной упаковки ДНК в фаговые головки [22]. Таким образом, можно выделить некую подгруппу МТаз, не содержащих сопутствующих эпдонуклеаз рестрикции и обеспечивающих трансфекцию и транедукцию бактериофагов.
В прокариотах обнаружены МТазы, вовлеченные в регуляцию генной экспрессии, в процессы репликации и репарации ДНК [1, 18]. Эти ферменты не являются частью систем Р-М. Наиболее охарактеризовать в данной группе - т6Л-МТаза Dam из E.coli. Dam метилирует экзоциклический атом азота аденина пуклеотидной последовательности 5 -GATC-3 [23]. Метилирование ДНК, осуществляемое Dam, играет роль индикатора для системы репарации Mut (белки MutSL и Mutll), указывая на то, какая цепь ДНК является «родительской» [24]. Белок MutSL узнает неправильно спаренное основание на «дочерней» цепи, после чего активирует фермент MutH, который вносит одиночный разрыв в неметнлированную цепь в ближайшей 5 -GATC-3 луклеотидпой последовательности. Затем происходит удаление участка цепи, содержащей неправильно спаренное основание, и повторный синтез этой последовательности. Другой функцией Dam является регуляция генной экспрссии. Показано, что промоторные области некоторых генов содержат участки узнавания Dam. Эффективная экспрессия этих гспов возможна лишь при наличии m6dA в одной из цепей промотора [25]. Кроме того, Dam инициирует процесс репликации хромосомы E.coli, точка начала репликации, которой содержит 11 участков узнавания этой МТазы. Наличие mdA в одной из цепей точки начала репликации ингибируст экспрессию ДНК [26]. 1.2.1.2. Биологическое значение метилирования ДНК в эукариотах В клетках млекопитающих обнаружены только С5-цитозиповыс ДНК метилтрапсферазы. Это три различных семейства активных ферментов - Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b, метилирующих остатки цитозипа в 5 -CG-3 или 5 -CNG-3 двутяжевых последовательностях ДНК, и одно семейство предполагаемых МТаз - Dnmt2 [1, 27]. Эукариотичсскис МТазы, как и некоторые прокариотическис МТазы, вовлечены и регуляцию экспрессии генов [28, 29]. Метилирование CG-последователіїііостей промоторных областей ряда гспов в эукариотах обычно приводит к снижению их экспрессии. Некоторые транскрипционные факторы, например, NF-кВ, не способны связываться с участком узнавания, если он содержит метилированные основания. Кроме того, в ряде случаев метилирование ДНК инициирует дсацитилировапис гистонов. Как следствие, происходит уплотнение хроматина, что приводит к полному «выключению» гсна(ов). Геномный «импринтинг» и инактивация Х-хромосомы у млекопитающих опосредованы метилированием ДНК. Некоторые гены содержат так называемую маркировку (imprint), позволяющую различить «отцовскую» и «материнскую» копии этих генов. Маркированные гены будут экспрсссироваться только с одной хромосомы, то есть только «материнская» или только «отцовская» копия будут активны [30, 31]. Исследования показали, что как растения, так и млекопитающие используют для геномного «импринтинга» метилирование ДНК [32]. Наиболее ярким примером геномного «импринтинга» является инактивация Х-хромосомы. Общеизвестно, что женские особи у млекопитающих содержат две Х-хромосомы, в то время как мужские - только одну. Встает вопрос о необходимости регулирования экспрессии генов, кодируемых в Х-хромосоме. Для инактивации одной из X-хромосом используется комплекс биологических сигналов, и, в частности, тотальное метилирование ДНК [33, 34]. У эмбриона мыши с «выключенным» геном Dnmtl было зарегистрировано нестабильное ипактивированное состояние Х-хромосомы [35].
Предполагается, что метилирование ДНК у растений и млекопитающих способствует защите генома от внедрения мобильных элементов, таких как трансиозоны, ретротраиспозоны и вирусы. Неупорядоченная интеграция мобильных элементов в геном является основным источником мутаций, и защита от подобной интеграции играет решающую роль для поддержания жизнедеятельности организма. Трапспозоны, как правило, содержат большое число CG-последователыюстсй, которые полностью метилированы [36]. На клеточных линиях было показано, что «выключение» гена Dnmtl приводит к повышению уровня транскрипции транспозопов [37]. Тем не менее, прямых доказательств того, что метилирование ДНК у эукариот способствует защите генома от внедрения мобильных элементов нет. олее четверти века назад было высказано предположение, что метилирование ДНК, как центральный механизм передачи наследственной информации, не закодированной в нуклсотидной последовательности ДНК, вовлечено в процессы развития организма, На сегодняшний день получены твердые доказательства этой гипотезы. Мыши, у которых были «выключены» гены Dnmtl и Dnmt3b, умерли на стадии раннего эмбриогенеза [38,39]. Мыши с «выключенным» геном Dnmt3a умерли вскоре после рождения. Показано, что метилирование ДНК вовлечено также в ткапеспецифичную экспрессию генов [1]. Метилирование ДНК влияет на возникновение и развитие некоторых заболеваний человека. Изменения «карты» метилирования ДНК часто наблюдается в раковых клетках. Пониженный уровень метилирования ДНК в целом приводит к нестабильности геномной экспрессии и активации рстротранспозонов. С другой стороны, гиперметилирование промоторных областей генов-супрессоров опкогенных заболеваний активирует экспрессию онкогенов [40-42]. В сумме эти два процесса способствуют усилению онкологического заболевания. Пониженный уровень метилирования ДНК также наблюдается в стареющих клетках [43]. 1.2.2. Первичная структура С5-цитозииопых ДНК-.метилтрансфераз Прокариотическис т5С-МТазы- мономерные белки с молекулярной массой от 30 до 50 кДа, имеющие сходную первичную структуру. Выделяют 10 консервативных мотивов (I-X), расположенных в строго определенной последовательности по длине аминокислотной цепи [1, 44-46] (рис. 2). Наиболее консервативными для т5С-МТаз являются мотивы I, IV и VI. Многочисленные кристаллографические и биохимические исследования позволили установить функциональную значимость этих мотивов. Мотив I (или FxGxG мотив) вовлечен в связывание кофактора реакции метилирования AdoMet. Консервативный Phe из мотива I взаимодействует с гетероциклическим основанием AdoMet, при этом ароматическое кольцо Phe располагается перпендикулярно плоскости пурина [47]. Мотив I - единственный мотив, который консервативен не только для МТаз, но и для всех AdoMet-зависящих ферментов [48].
Строение и свойства Сго-белков и репрессоров
Строение и свойства С го-белков и рспрессоров Многие регуляторные белки, взаимодействуя с ДІІК, используют для узнавания пуклеотидной последовательности а-спирали [12, 15, 89-95]. Самую большую группу формируют те белки, в которых ДНК-узпающая а-спираль является частью структурного мотива «спираль-поворот-сиираль» (СПС). Впервые СПС-мотив был идентифицирован в структурах Сго-белка бактериофага X и белка-активатора катаболитиых генов п начале 80-х годов [96-98]. С тех пор количество расшифрованных структур ДНК-узпающих белков и их комплексов с ДНК значительно увеличилось. Согласно классификации Лускомба и соавт. [15] в группе белков, использующих для узнавания СПС-мотив, насчитывается 60 представителей. Это вторая по численности группа белков. В нее входят не только транскрипционные факторы из про- и эукариотичсских объектов, но и эндопуклсаза рестрикции Fokl, рскомбиназа Піп, транспозаза ТСЗ, уЗ-рсзолваза. В 1990 году был разработан алгоритм Додда - Эгана [99], позволяющий предсказывать наличие СПС-мотива в заданной аминокислотной последовательности. 1.3.1. Структурный мотив «спираль-исшорот-спираль» Классический СПС-мотив состоит из 20 а.о., образующих две а-спирали длиной в 7 — 9 а.о. (рис. 8 Л, Б) [15,92,100,101]. а-Спирали расположены под углом примерно в 120 друг относительно друга и соединены коротким поворотом из 3-х - 4-х а.о. Вторая (С-концсвая) спираль СПС-мотива, как правило, называется «узнающей», так как она ответственна за узнавание специфической нуклеотидной последовательности в ДИК. При связывании с ДНК «узнающая» а-спираль располагается в большой бороздке и образует контакты с гетероциклическими основаниями [93-95, 102]. Первая (N-комцевая) спираль СПС-мотива размещается над С-концевой спиралью поперек большой бороздки и отвечает за правильное размещение «узнающей» спирали относительно специфической нуклеотидной последовательности в ДНК. Как правило, N-копцевая спираль формирует контакты с углеводофосфатным остовом [93-95, 102]. Большинство СПС-мотивов представляют собой различные варианты классического [15, 89, 100, 101]. а-Спирали могут быть длиннее с N- и (или) С-конца, поворот может заменяется гибкими петлями в 5-21 а.о. Иногда в петлях наблюдаются вставки коротких а-спиральиых сегментов, которые разделяют первичную структуру СПС-мотива, но взаимное пространственное расположение двух а-спиралей при этом не меняется, угол между ними остается близким к !20. СПС-мотив имеет достаточно жесткую пространственную структуру, стабилизированную в первую очередь за счет гидрофобных межсииралыгых взаимодействий [92, 100]. Гидрофобные аминокислотные остатки занимают строго определенные позиции в N- и С-концевой спиралях. В разных семействах СПС-содсржащих белков эти позиции могут отличаться.
Тем не менее, в пределах одного семейства они настолько консервативны, что их местоположение лежит в основе методов идентификации СПС-мотива в последовательностях белков. Дополнительная стабилизация СПС-мотива происходит за счет гидрофобных взаимодействий с аминокислотными остатками ДНК-связывающего домена, частью которого мотив является [100,103]. СПС-мотив не является самостоятельной структурной единицей: сам по себе он пс может ни правильно укладываться, пи функционировать [100, 103]. Он всегда является частью другого более крупного ДНК-связывающего домена (СПС-домена) (рис. 8 А-Е) [12, 15, 89-95, 100, 103], Структурное окружение СПС-мотива в домене могут составлять либо только а-спирали (рис. 8 А-Г) либо а-спирали и р-тяжи ((а+р)-домены) (рис. 8 Д, Е). Ядром каждого СПС-домена является трсхспиральпый узел [100, 103], образованный двумя а-спиралями СПС-мотива и третьей а-спиралыо, которая либо следует за СПС-мотивом, либо, чаще всего, предшествует ему. Трехспиральный узел, является минимальной структурной единицей, способной дать стабильную третичную структуру (рис. 8 Б, Г). В четырехспиральных доменах (рис. 8 А) 4-ая спираль, следующая за СПС-мотивом, располагается над гидрофобным ядром трех спираль ного узла и стабилизирует его структуру. Пятая ct-спираль, идентифицированная в первичной структуре фаговых репрессоров и Сго-белков (рис. 8 В), обеспечивает димеризацию молекул белка иа ДНК и не участвует в структурной организации СПС-мотива. В (а+Р)-доменах трехспиральный узел дополняет короткая Р-шпилька, следующая сразу за СПС-мотивом (рис. 8 Д). В большинстве (а+р)-доменов р-шпилька достраивается до 3-х - 4-х тяжевой антипараллелыюи р-структуры за счет присоединения одного или двух р-тяжей перед СПС-мотивом (рис. 8 Е). Гидрофобные остатки р-структуры стабилизируют трехспиральный узел. Многие СПС-домены содержат гибкие неупорядоченные N- или С-концевые аминокислотные последовательности, взаимодействующие с малой бороздкой ДНК (рис. 8 А-В). Существует несколько способов классифицировать белки, использующие для узнавания СПС-мотив. В 1995 году Судзуки и соавт. [104] разделили СПС-содержащие белки на 7 семейств в соответствии с расположением элементов вторичной структуры в их последовательностях.
Однако белки, попавшие в одну группу на основании гомологии вторичной структуры, зачастую не показывали никакого сходства ни на уровне третичной структуры, ни на уровне выполняемых ими биологических функций. В классификации [101], предложенной годом позже, Винтенс и Руман ужесточили требования к структурным параметрам. Сходство расположения трех и более спиралей па уровне вторичной структуры было дополнено оценкой величины среднеквадратичного отклонения для Са-атомов трехспиралышх узлов. Если эта величина не превышала 1,5 А при попарном сравнении СПС-доменов, последние относили к одному семейству. Идентичность биологических свойств СПС-содержащнх белков не учитывалась. Подобный способ классификации позволил выделить 11 семейств белков. Классификация, предложенная Лускомбом и соавт. [15], принимает во внимание не только пространственную гомологию, но и функции, выполняемые белками, а также особенности связывания последних с ДНК. Различные классификации предполагают выделение СПС-содержащих белков в различные семейства. Тем пс менее, некоторые белки попадают в одно семейство вне зависимости от способа классификации. Одним из таких семейств является семейство Cro-белков и репрессоров. Согласно классификации Лускомба и соавт, [15] в семейство Cro-белков и репрессоров входят четыре представителя: Cro-белок и репрессор бактериофага 434 и Сго-белок и репрессор бактериофага X. Учитывая структурную классификацию 1996 года [101] можно дополнить рассматриваемое семейство рспрсссором бактериофага Р22. Перечисленные выше белки регулируют инициацию транскрипции с определенных промоторов фаговой ДНК, активируя и ингибируя процессы лизиса и лизогепии. 1.3.3. Биологические функции фаговых репрессоров и Cro-белков. Регуляция генов в жизненном цикле бактериофага X Фаги 434 и X входят в группу бактериофагов, которые инфицируют клетки Escherichia coli, фаг Р22 инфицирует клетки Salmonella typhimurium [105]. После проникновения о клетку-«хозяина» эти бактериофаги могут развиваться двумя путями [105-109]. Литический путь развития (лизис) означает интенсивную репликацию определенных фаговых генов, приводящую к образованию новых бактериофагов, которые впоследствии высвобождаются в результате лкзиса бактериальной клетки-«хозяина». Лизогения предполагает интеграцию фаговой ДИК в «хозяйскую» хромосому и последующую многократную пассивную репликацию но мере роста и деления бактериальной клетки. В отсутстіши внешних воздействий лизогениые бактерии очень редко продуцируют фаг. Выбор («переключение») между лизисом и лизогенией определяется функционированием нескольких регуляторных белков бактериофага. Центральными компонентами в механизме переключения генов являются фаговые репрессор и Cro-бслок. Наиболее изучена регуляция генов в жизненном цикле бактериофага X [105-109].
В бактериофаге X выбор между лизисом и лизогенией определяют шесть регуляторных генов: с/, сії, сШ, его, N и Q. Кодируемые этими генами белки называются репрессор фага X, СП, СШ, Сго, N и Q соответственно.
Фермент модификации SsoII как С5-цитозиновая ДНК-мстилтрансфсраза
Объект нашего исследования - прокариотическая ДНК-метилтрансфсраза SsoII -является типичным представителем класса С5-цитозиновых мстилтрансфераз. Вопрос о том, каким образом m С-МТазы катализируют реакцию переноса метальной группы в С5-иоложение цитозина, практически решен. В то же время механизмы узнавания определенной нуклеотидпой последовательности в ДНК и местоположения метилируемого dC еще недостаточно изучены. Поэтому основное внимание в данной работе было направлено на изучение связывания M.SsoII с участком метилирования ДНК. Для идентификации групп атомов участка метилирования, вовлеченных во взаимодействие с M.SsoII на стадии специфического узнавания, был применен метод «отпечатков». Из двух существующих вариантов данного метода был использован метод «отпечатков», основанный на обработке ДНК модифицирующим агентом и последующем связывании модифицированного субстрата с исследуемым белком (от англ. interference footprinting). Для идентификации гетероциклических оснований участка метилирования, вовлеченных во взаимодействие с M.SsoII, были использованы методы «отпечатков» с муравьиной кислотой, обработка которой приводит к апурипизации ДНК, и гидразином. Присоединение последнего по двойной связи С5-С6 в пиримидинах приводит к расщеплению гетсроцикла и апиримидинизации ДНК. Для того чтобы локализовать фосфатные группы, взаимодействующие с M.SsoII, был применен метод «отпечатков» с N-этил-Л нитрозомочевиной. Этот химический реагент при определенных условиях этилирует межпуклеозидные фосфаты ДНК. Остатки гуанина, Ы7-атомы которых участвуют в узнавании участка метилирования M.SsoII, были идентифицированы методом «отпечатков» с ди мстил сульфатом. Дим етил сульфат метилирует остатки гуанина по N7-aTOMy, экспонированному в большую бороздку ДНК. Все модифицирующие реагенты, использованные в данной работе, суммированы в табл. 3. Согласно литературным данным место посадки ирокариотических т5С-МТаз на ДНК не превышает 16 п.н. (см. раздел 1.2.5.1.)- Поэтому, для анализа контактов M.SsoII с ДНК методом «отпечатков» были сконструированы ЗО-з венные ДНК-дуплексы VI-IX, содержащие участок метилирования M.SsoII (табл. 4). Дуплекс VII является аналогом дуплекса VI за исключением центральной (вырожденной) нуклеотидной пары участка метилирования: остатки dT/dA заменены на остатки dC/dG соответственно. ДНК-дуплекс VII был использован нами как «внутренний» контроль для подтверждения результатов, полученных при анализе взаимодействия M.SsoII с ДНК-дуплексом VI.
В дальнейшем цепь ДНК-дуплекса, содержащая в участке метилирования остаток dT, будет называться Т-цепыо, остаток dC-С-цепью, остаток dA - Л-цспыо, остаток dG - G-цепыо. Процесс метилирования двутяжевой ДНК МТазой предусматривает образование двух различных фермент-субстратных комплексов: модификации подвергается остаток dC каждой из цепей ДНК. Таким образом, идентифицированные методом «отпечатков» группы атомов неметилированных ДНК-дуплексов VI и VII будут представлять собой сумму контактов в двух возможных комплексах. Для того чтобы дискриминировать эти контакты были сконструированы мопомстилированные ДНК-субстраты V3II и IX (табл. 4). ДНК-дуплексы VIII и IX являются аналогами ДНК-дуплекса VI. В них внутренний остаток dC участка метилирования заменен на остаток 5-метил-2 -дсзоксицитидина (m!dC, М) в Т- или А-цспи дуплекса соответственно. С монометилировапньш ДНК-субстратом M.SsoII может образовать единственный комплекс: модификации будет подвергаться лишь немстилированный остаток dC. ДНК-дупл сксы VI-IX содержали 32Р-метку на 5 -конце Т(С)- или A(G)-neim. В условиях статистической модификации дуплексы обрабатывали соответствующим химическим реагентом и затем инкубировали с M.SsoII в присутствии AdoHcy в подобранных условиях специфического связывания (см. раздел 2,2.1.), Методом «торможения» в геле связавшийся с ферментом субстрат отделяли от ДНК-дуплекса, несвязавшегося с M.SsoII. Данный метод основан па том, что ДНК-белковый комплекс обладает меньшей подвижностью в псдепатурируюіцем ПААГ по сравнению с ДНК, не связанной с белком. Олигопуклсотиды выделяли из геля, гилролизовали по месту модификации и анализировали методом гель-электрофореза в ПААГ, содержащем 7М мочевину. Определяли радиоактивность зон из дорожек, соответствующих разделению продуктов гидролиза ДНК, не связавшейся (R) и связавшейся (R ) с M.SsoII. Мы полагали, что фрагмент ДНК важен для формирования специфического комплекса с M.SsoII на стадии узнавания участка метилирования при R/RcB 1,9. 2.2.1. Равновесное связывание мстилтрансферазы SsoII с участком метилировании Так как задача работы предполагала выявление групп атомов участка метилирования в ДНК, взаимодействующих с M.SsoII при формировании специфического фермент-субстратного комплекса, были подобраны условия специфического связывания МТазы с ДНК-лигандами. Для изучения особенностей комплсксообразования M.SsoII с ДНК, был использован метод «торможения» в геле. Исследования показали, что M.SsoII формирует с ДНК-дуплексом VI, содержащим участок метилирования, два комплекса, характеризующиеся различной подвижностью в неденатурирующем ПААГ (рис. 22; А1 и А2).
Комплекс А1 наблюдается только при добавлении аналога кофактора реакции метилирования - AdoIIcy. В то же время псспсцифический ДПК-дуплскс X, не содержащий участка узнавания M.SsoII, формирует только комплекс А2 как в присутствии, так и в отсутствие AdoIIcy. 5 -GATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATC-3 3 -CTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAG-5 (X) Были проведены эксперименты по вытеснению Р-мсчсных дуплексов VI и X из ДНК-белковых комплексов А1 и А2. В качестве лиганда-конкурента использовали poly(dl dC), Нуклеотидная последовательность poly(dl-dC) не содержит участка метилирования M.SsoII и не обладает гомологией с нуклеотидпой последовательностью ДНК-дуплекса VI. Создание в реакционной смеси концентрации poly(dl-dC), равной 50 нг/мкл, приводит к вытеснению меченой ДНК из комплекса А2 и в то же время не влияет на формирование комплекса А1. Это позволяет нам считать комплекс А1 (эквивалентный тройному комплексу M.SsoII - ДНК-субстрат - AdoHcy) специфическим. Дополнительный анализ характера белково-нуклеинового взаимодействия в комплексах А1 и А2 был сделан с использованием метода «отпечатков» с муравьиной кислотой. Исследовали ДНК-белковые контакты в комплексах, полученных при взаимодействии M.SsoII с ДНК-дуплексом VI в присутствии AdoHcy, но в отсутствие poly(dldC). Из рис. 23 видно, что для образования комплекса А1 фатально удаление каждого из пуринов участка метилирования и двух пуринов, непосредственно примыкающих к нему с 5 -конца. Формирование комплекса А2 практически не зависит от модификации ДНК, лишь В дальнейшем специфическое комплексообразование M.SsoII с ДНК-субстратами проводили присутствии 500 мкМ AdoIIcy и 50 нг/мкл poIy(dldC). В этих условиях наблюдалось образование только специфического комплекса А1. Для комплексов M.SsoII с дуплексами VI-IX, а так же дуплексом XI, содержащем вместо внутреннего dC участка метилирования - m5dC в обеих цепях, были рассчитаны равновесные константы диссоциации по методу Скэтчарда [150]. В этом методе одинаковые количества белка титруются возрастающим количеством ДНК-дуплекса. Константы диссоциации комплексов M.SsolI с монометилированными субстратами VIII и IX в пределах ошибки совпадают между собой и примерно в 2 раза меньше, чем константы диссоциации комплексов с неметшшропанньгми субстратами VI и VII, которые так же в пределах ошибки совпадают (табл, 5). Замена центральной пуклсотидпой пары участка метилирования не влияет на степень сродства M.SsolI к субстратам. К сожалению, отсутствие стандартизации при определении констант диссоциации различными методами не позволяет сравнивать абсолютные величины Kj комплексов различных мстилтрансфераз с ДНК. Величины константы диссоциации комплексов МТаз с ДНК, содержащими участки метилирования, изменяются от 10" до 10" М [18, 46], Тем не менее, существует общая закономерность.
Изучение роли метилтрансферазы SsoII в процессе дезаминирования метилируемого цитозииа
Известно, что остатки цитозина ДНК могут претерпевать гидролитическое дезаминирование, переходя, таким образом, в остатки урацила [1]. Этот процесс, инициирующийся протопиропанием N3 атома цитозина, протекает спонтанно и с очень низкой скоростью. Показано, что m С-МТазы в отсутствии AdoMct ускоряют реакцию дезамииирования (схема 5) [1, 165-168]. Возможно, это связано с тем, что механизм реакции метилирования предполагает выведение метилируемого dC из двойной спирали ДНК и протонированис N3 атома цитозина остатком GIu (ENV, мотив VI) (см. раздел 1.2.4.). К настоящему моменту способность катализировать реакцию дсзамипировапия показана для т5С-МТаз Hpall, Mhal, M.SssI, EcoRII, [153,168-170]. Для тестирования способности M.SsoII катализировать реакцию дсзамипировапия метилируемого цитозина в ДНК был предложен следующий подход (рис. 37). В качестве исходной ДНК использовали моиомстилированный дуплекс VIII, так как его сродство к M.SsoII выше, чем нсметнлированпого субстрата (табл. 5). ДНК-дуплекс VIII, меченный Р по 5 -концу А-цепи, инкубировали с M.SsoII в присутствии AdoIIcy и с УДГ. Дезамиипровалис dC должно приводить к появлению остатков dU, наличие которых может быть легко протестировано с помощью УДГ. УДГ «выщепляет» урацил из ДНК, гндролизуя модифицированный нуклеозид но N-гликозидной связи [146]. В результате в ДНК появляется апиримидиновый участок, который в щелочных условиях является местом гидролиза олигонуклеотида на соответствующие фрагменты. Процесс дезаминирования протекает с низкой вероятностью {1, 170]. Вместе с тем, сродство МТазы Hhal к субстрату, содержащему восстановленный аналог дезоксирибозы - (2R,3S)-2- підроксиметилтстрагидрофуранол-3 вместо метилируемого dC, в десять раз выше, чем к канонической немодифицированной ДНК [153]. Таким образом, модифицированные в процессе дезаминирования и аниримидинизации ДНК-дуплексы должны находиться в комплексе с M.SsoII. Исходя из этого, в ходе эксперимента мы отделяли дуплексы, связавшиеся с M.SsoII от исспязавшпхся с МТазой, методом «торможения» в геле, что позволило добиться более четких результатов. Фракцию ДИК, связавшуюся с M.SsoII, выделяли из геля и обрабатывали 10%-ным водным раствором пиперидина. Затем реакционную смесь анализировали методом гель-электрофореза в денатурирующем ПААГ.
Наблюдаемое повышение интенсивности полосы, соответствующей по подвижности метилируемому dC, на наш взгляд, связано с тем, что метилируемый остаток (1С после инкубации с M.SsoII был замещен на остаток dU, а после инкубации с УДГ - на остаток дезоксирибозы. В свою очередь для ДНК, содержащей остаток дезоксирибозы, характерно эффективное расщепление по апуриновому участку под действием пиперидина. Таким образом, данные результаты, хотя и косвенно, свидетельствуют об участии M.SsoII в процессе дезамипирования метилируемого цитозина. 2.4. Регуляция в системе рестрикции-модификации SsoII. Фермент модификации Ssoll как регуляториый белок Отличительной особенностью системы рестрикции-модификации SsoII является дивергентное расположение генов эндоиуклеазы рестрикции (ssoIIR) и мстнлтрансферазы (ssolllif), которые разделены межгенным участком длиной 109 и.п. [134]. К началу выполнения настоящей работы было показано, что M.SsoII формирует специфический и стабильный комплекс с промоторпой областью генов системы Р-М SsoII, При этом происходит снижение экспрессии гена, кодирующего M.SsoII, и повышение экспрессии гена, кодирующего R.SsoII [7, 8]. Регуляторная функция M.SsoII определяется се N-копцсвой частью (1-71 а.о), в которой методом компьютерного моделирования показано наличие структурного мотива «спираль-поворот-снираль», представляющего собой вероятный участок связывания промоторпой области. В промоторпой области генов системы Р-М SsoII идентифицирован 15-звенный инвертированный повтор (далее по тексту - «регуляторный» участок ДНК). Предполагаюсь, что он представляет собой фрагмент ДНК, обеспечивающий максимальное число специфических контактов при взаимодействии с N-концсвой частью M.SsoII [8]. Следует отметить, что регуляция генной экспрессии чрезвычайно важна для функционирования систем рестрикции-модификации в клетке бактерий. Уровень синтеза метилтрансферазы всегда должен коррелировать с уровнем синтеза эндонуклеазы рестрикции. Необходимо, чтобы эндонуклеаза рестрикции могла гилролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет модифицирована сопутствующей МТазой. В то же время, если уровень метилирования будет недостаточно высоким, эндонуклеаза рестрикции разрушит ДНК клетки-«хозяипа», что приведет к гибели последней. Среди т5С-МТаз авторегуляторная функция обнаружена также у EcoRII и Mspl [5, 6]. Эти МТазы узнают в ДНК сходные последовательности (M.EcoRII: 5 -CCA/TGG-3 ; M.MspI: 5 -CCGG-3 ) и метилируют в них внутренний остаток цитозина. Аминокислотные последовательности этих МТаз высокогомологичны. На основании этих данных можно предположить существование общего механизма регуляции экспрессии генов для родственных систем рестрикции-модификации.
В настоящей работе продолжены исследования ДНК-белковых взаимодействий в комплексе M.SsoII с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Используя метод «отпечатков», нами получена информация о группах атомов «регуляторного» участка ДНК, вовлеченных в специфическое взаимодействие с M.SsoII. Методом ковалентного присоединения белка к ДНК определена субъединичиая структура M.SsoII при связывании с промоторной областью. Изучение взаимодействия M.SsoII с промоторной областью генов системы-рестрикции модификации SsoII проводилось с использованием синтетических ДНК-дуплексов. В качестве исходного был выбран 31-звепный ДНК-дуплекс XX, представляющий собой центральный фрагмент промоторной области и включающий в себя 15-звенный инвертированный повтор: 5 -ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3 А-цепь 3 AGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5 (XX) Т-цепь Константа диссоциации комплекса M.SsoII с ДНК-дуплсксом XX в пределах ошибки эксперимента совпадает с величиной копстантаны диссоциации комплекса M.SsoII со 140-звепиым фрагментом ДНК, соответствующем нромоторной области генов системы Р-М Ssoll [8], что свидетельствует об адекватности выбора дуплекса XX для исследования ДНК-белковых взаимодействий M.SsoII с промотори ой областью. 2.4.1. Исследование равновесного связывания мстнлтрансферазы Ssoll с «регуляторним» участком ДНК Предварительно были подобраны условия формирования специфического комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом XX. Показано, что формирование такого комплекса наблюдается только в присутствии poly(dl dC). По методу Скэтчарда (см. раздел 2.2.1.) рассчитаны равновесные константы диссоциации комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом XX в указанных условиях (рис. 39, табл. 8). Константа диссоциации комплекса мономера M.SsoII с «регуляторним» участком ДИК составляет 49,9±3,б иМ. Добавление аналога кофактора реакции метилирования AdoIIcy приводит к увеличению сродства ДНК-лигапда XX к M.SsoII в 1,4 раза (Ка = 36,4Ы,9 пМ). Наличие AdoIIcy вызывает копформациоппыс перестройки в структуре МТазы, приводящие к компактизации молекулы фермента [45], что, возможно, облегчает взаимодействие M.SsoII с «регуляториым» участком ДНК. Для идентификации групп атомов «регуляторного» участка ДНК, вовлеченных во взаимодействие с M.SsoII, использовали метод «отпечатков» с муравьиной кислотой, гидразином, димстилсульфатом и Ы-этил-М-питрозомочевиной в качестве модифицирующих реагентов (табл. 3). Схема эксперимента аналогична описанной в разделе 2.2. Специфическое комплсксообразование M.SsoII с ДНК-дуплексом XX проводили в присутствии 50 нг/мкл poly(dldC) и в отсутствии AdoHcy. На рис. 40 в виде гистограмм представлены результаты метода «отпечатков» для ДНК-субстрата XX, они же суммированы на рис 41.
Похожие диссертации на С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Ssoll
