Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. С-реактивный белок (СРВ) - наиболее характерный представитель семейства оотрофазных протеинов человека. Впервые он был .обнаружен в сыворотке крови больных пневмококковой пневмонией благодаря своей способности связываться в присутствии ионов Са с соматическим С-полисахаридом клеточной стенки S.pneumoniae, чему он и обязан своим названием.
, В последние годы широко развернулись исследования по изучению иммунорегуляторных свойств 0-реактивного белка. Однако данные об его иммунобиологической активности нередко противоречивы, скорее всего, из-за различий в степени чистоты используемого белка. Присутствие даже незначительного количества примесей, например, липопротеинов, может существенно влиять на некоторые показатели иммунореактивности организма, в частности, на-щгалиферативнуш активность лимфоидных клеток.
Получение,С-реактивного белка высокой степени чистоты осложняется тем, что в исходной белковой смеси присутствуют соединения, с которыми возможно его специфическое взаимодействие.
наиболее успешно задача по выделению С-реактивного белка из различных биологических жидкостей решается с помощью аффинной хроматографии, использующей специфическую способность ОРЗ в присутствии ионов Са связываться с соединениями, содержащими фосф.холи-Еовые группировки.. Поскольку существующие способы получения С-реактивного белка на основе фосфохолиноодержащих биоспецифических сорбентов не удовлетворяют всем требованиям (простота лолучвния И стабильность биоспецифического сорбента, чистота получаемого СРВ), в настоящее время продолжаются исследования по разработке более эффективных способов получения С-реактивного белка.
. Работа выполнена в соответствии'с планом научно-исследовательских работ группы иммунофармакологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гвмалеи РАМН по теме N 100 В "Изучение роли острофазного ответа в поддержании иммунного гомеостаза организма путем изучения иммунорегуляторных свойств его основных сывороточных реактантов" (номер государственной регистрации 0.67.07.)j а также в соответствзш с планом научно-исследовательских работ кафедры ХТТОС ШТХТ им. М.В.Ломоносова по теме N 1Б-18-865 "Получение,липидов, биорегуляторов липид-ной природы и их конъюгатов, изучение поведения в биологических
- г -
системах, использование для создания физиологически активных ли-пидных препаратов и липосомальных форм" (номер государственной регистрации 01920018492). Данное исследование дополнительно финансируется Министерством Обороны РФ по теме "Получение высокоэффективных препаратов на основе эндогенных иммунорегуляторных факторов для иеспецифической профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний".
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. 1).Получение биоспецифичэских сорбентов для выделения ОРБ путем ковалентного присоединения производных 8П-ГЛИ-церо-З-фосфохолина к аминозамещенным агарозным матрицам; выявление факторов, влияющих на эффективность полученных сорбентов; 2). Разработка схемы получения С-реактивного белка высокой степени чистоты;
3). Изучение влияния С-реактивного белка на формирование первичного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа; исследование митогенного и комитогенного действия С-реактивного белка In vivo и In vitro.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Предложены новые способы получения фосфо-холинсодержащих вффиншх сорбентов на основе доступных производных зп-глицеро-3-фосфохолина, получаемых при его взаимодействии о NalO^ или BrCN, и далее ковалентно присоединяемых к аминозамещенным агарозным матрицам. Показана высокая стабильность биоспецифических сорбентов, содержащих двойные связи по типу Шиффовых оснований. Получены биоспецкфическив сорбенты с различным содержанием фосфохолиновых группировок, определена оптимальная концентрация иммобилизованного лиганда, охарактеризовано влияние катионных группировок в составе спейсера на степень чиототы выделяемого О-реактивного балка. Отработана схема получения ОРБ высокой степени чистоты. Показана способность О-реактивного белка модулировать, формирование первичного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа у мышей в зависимости от его дозы и сроков введения животным. Впервые обнаружено свойство СРВ In vivo подавлять пролиферативную активность лимфоцитов в ответ на фитогемагг-лютшшн (ФГА). Установлено, что О-ревктивный белок усиливает спонтанную пролиферацию лимфондных клеток In vivo и обладает выраженным митогенным эффектом in vitro. Впервые показано, что макрофаги способны угнетать пролиферацию ФГА-стимулированных лимфоцитов в
присутствии СРВ и подавлять митогенное действие С-реактивного белка in vitro.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Предложен новый удобный ста-ооб получения биоспецифических сорбентов для выделения С-реактивного белка на основе гликольфосфохолина, ковалентно присоединяемого к аминозамещенным агарознкм матрицам. Данный метод может быть использован для выделения С-реактивного белка в промышленных условиях. Полученные биоопецифические сорбенты также могут быть применены для очистки других белков, имеющих сродство к фосфохолиновым группировкам, например, фосфолипазы 0 или миеломных IgA. С-реак-тивный белок, выделенный посредством аффинной хроматографии на синтезированных биоспецифических сорбентах, может использоваться для иммунизации животных о целью получения специфических антисывороток, в также в качестве стандарта при определении концентрации С-реактивного белка различными методами. Результата, полученные при изучении митогенной и комитогенной активности СРВ, могут позволить прогнозировать нарушения иммуногенеза и развитие патологических состояний на фоне гиперпродукции оотрофазных белков при инфекционных заболеваниях или онкопатологии. Данные об иммунорегу-ляторной активности СРВ in vivo открывают дальнейшие перспективы его использования в качестве эндогенного иммуномодулятора.
І^_ЗШйї_Ш55ТСЯ следующие основные положения:
ноше способы получения биоспецифических сорбентов для выделения С-реактивного белка на основе доступных производных sn-глицеро-З-фосфохолина, ковалентно иммобилизуемых на аминозаме-щенных агарозных матрицах;
получение С-реактивного белка высокой степени чистоты (более 99 %) путем сочетания методов аффинной и ионообменной хроматографии;
,;. иммуномодалирущеэ действие С-рввктивного белка на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа;
, способность С-реактивного белка усиливать пролиферацию 4!ймфоидных клеток in vivo и in vitro;
способность С-реактивного белка модифицировать пролифе-ративнув активность лимфоцитов в ответ на Т- и В-мйтогены;
оупреооивноэ влияние макрофагов на пролиферацию лимфоидных клеток, стимулированную СРВ и его сочетанием с фитогемагглютинином.
АПРОБАЦИЯ. Результаты, изложенные в диссертации, докладывались на IV Международной конференции по воспалению (Швейцария, 1991), на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата. 1992), на I Международной конференции по иммуномодуляторам бактериального происхождения и синтетическим вдъювантам (Румыния, сентябрь, 1993). Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 26'октября 1995 г.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов. Получено решение о выдаче патента на изобретение.
0ВШ1 И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на стр. машинописного текота, содержит 11 таблиц, 12 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, експериментальная часть, выводы, список литературы, включающий ссылок. ,
