Содержание к диссертации
Введение
1. Циклоимиды хлорина р6. методы получения и химические модификации 5
1.1. Методы получения циклоимидов хлорина 5
1.2. Химические превращения функциональных групп в циклоимидах хлорина 17
1.2.1. Реакции по остатку пропионовой кислоты 17
1.2.2. Реакции с участием винильной группы 19
1.2.3. Модификация заместителей при атоме азота циклоимида 24
1.2.4. Реакции по 20-л<езо-положению и модификация пиррольного кольца А 28
1.2.5. Превращения в пиррольном кольце D 31
1.2.6. Модификация пиррольного кольца В 32
2. Обсуждение полученных результатов 38
2.1. Модификация ангидридного кольца пурпурина 18 39
2.2. Модификация Л^гидроксициклоимидов хлорина/ 43
2.3. Введение гидроксильной группы в пиррольное кольцо D 46
2.4. Химические превращения винильной группы пиррольного кольца А 52
2.5. Окисление двойной связи в пиррольном кольце В 58
2.6. Анализ данных по биологической активности Л^гидроксиалкил- и JV-гидроксициклоимидов хлорина pg и их производных 60
3. Экспериментальная часть 63
Выводы 86
- Химические превращения функциональных групп в циклоимидах хлорина
- Превращения в пиррольном кольце D
- Химические превращения винильной группы пиррольного кольца А
- Анализ данных по биологической активности Л^гидроксиалкил- и JV-гидроксициклоимидов хлорина pg и их производных
Введение к работе
Успешное применение фотодинамической терапии (ФДТ) в клинике при лечении онкологических заболеваний стимулировало поиск новых высокоэффективных сенсибилизаторов, фотофизические характеристики которых, тропность к злокачественным новообразованиям, низкая фототоксичность и хорошее выведение из организма превосходили бы известные препараты первого поколения.
Одним из перспективных направлений при разработке подобных фотосенсибилизаторов является химическая модификация природных: хлоринов, позволяющая оптимизировать гидрофильно-гидрофобный баланс заместителей в макроцикле, влияющий на накопление хлоринов в опухолевых клетках, а также улучшить их фотофизические свойства и растворимость в физиологических средах.
В ряду природных хлоринов особый интерес представляет пурпурин 18. Его отличительной чертой является наличие дополнительного ангидридного цикла и смещение основной полосы поглощения до 698 нм. Хорошие спектральные характеристики, доступность и высокая реакционная способность послужили основными критериями при выборе пурпурина 18 в качестве исходного соединения для разработки новых фотосенсибилизаторов второго поколения. Превращение ангидридного кольца пурпурина 18 в имидный цикл помимо смещения максимума поглощения в длинноволновую область, существенно повышает устойчивость данных соединений. Наиболее изученными представителями этого класса хлоринов являются гидрофобные ./V-алкилциклоимидные производные пурпурина 18, впервые полученные в группе К. Смита (США).
В связи с особым вниманием, проявляемым в последние годы к амфифильным сенсибилизаторам, представляло интерес расширить круг циклоимидов за счет гидроксилсодержащих производных и более глубоко изучить их химические и биологические свойства, включая накопление в раковых клетках и фотодинамическую активность in vitro и in vivo, К началу настоящей работы группа известных амфифильных циклоимидов был немногочисленна и их фотобиологические свойства мало изучены.
Целью настоящей работы явился синтез и изучение химических превращений Л^-гидрокси- и Л/-(ю-гидроксиалкил)циклоимидных производных хлорина р$. Основные направления исследования включали региоспецифическое введение гидроксильной группы в пиррольное кольцо D, модификацию винильной группы в пиррольном кольце А и окисление кольца В. В задачу исследования входило получение циклических имидов хлорина/^с интенсивным поглощением в красной области спектра, содержащих гидрофильные и гидрофобные группы в противоположных участках макроцикла, для выяснения влияния этих заместителей на накопление в раковых клетках и ФДТ активность.
Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС в рамках темы № 1Б-4-865 "Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины" и гранта Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ России НШ-2013.2003.3.
Экспериментальным исследованиям предшествует систематический анализ литературных данных по химии, спектроскопии и биологической активности циклоимидных производных хлорина^. На основе анализа определены целесообразные пути поиска и произведен выбор структур потенциальных фотосенсибилизаторов.
Химические превращения функциональных групп в циклоимидах хлорина
Наиболее интересные химические превращения остатка пропионовой кислоты при 17-С природных хлоринов связаны с его взаимодействием с диалкиламиноспиртами, полиаминами и аминокислотами с образованием эфиров и амидов. Показано, что такая модификация хлоринов не только улучшала их растворимость, но и в некоторых случаях приводила к увеличению их сенсибилизирующей активности [32-39]. Химические превращения остатка пропионовой кислоты в циклоимидах осуществлялись с целью получения 17 -Лґ-алкиламидов циклоимидов хлорина/. Ченг и Пандей [22], синтезируя циклоимиды из метилового эфира пурпурина 18 (16) и гексиламина в присутствии кислоты Льюиса и гексаметилдисилазана обнаружили, что в процессе реакции одновременно с образованием имидного цикла происходит замещение метоксигруппы в П-СНгСНгСОгМе на амидную. Основным продуктом в этих условиях является 174-А/ -гексиламид JV-гексилциклоимида (15) (схема 3). Наличие амидной группы в хлорине (15) было подтверждено данными Н ЯМР спектрометрии. В отличие от спектра Н ЯМР циклоимида (8д), в спектре соединения (15) отсутствовал син глет, соответствующий протонам метоксикарбонильной группы при 6 3.6 м.д. и наблюдался уширенный пик протона амидной группы при 6.9 м.д. Была проведена сравнительная оценка биологической активности циклоимидных производных хлоринарвсо свободным остатком пропионовой кислоты (34), их сложных Циклоимиды вводились мышам в дозе 1 мкмоль/кг и через 24 часа после инъекции проводилось облучение лазером (Хщах 705 нм). Все исследованные соединения показали хорошее накопление в опухолевых клетках (4.2-15.7 мкмоль/кг) и селективность (отношение опухоль/мышца 2.2-8.4). При этом оказалось, что накопление в опухоли и фотодинамическая активность циклоимидов (34) и (35) были практически одинаковыми. Это может являться косвенным подтверждением ранее высказанного предположения о том, что in vivo сложные эфиры могут гидролизоваться эстеразами до соответствующих карбоновых кислот [22]. В случае амида А/-алкилциклоимида (37) наблюдалось снижение фотодинамической активности и объяснения этому факту пока не найдено. Следует также отметить, что высокое накопление сенсибилизатора в опухоли не является определяющим фактором эффективной ФДТ. Так, амид JV-гексилциклоимида (37) способен накапливаться в опухоли в более высокой концентрации (6.4 мкмоль/кг) по сравнению со сложноэфирным аналогом (36) (4.2 мкмоль/кг), однако не проявляет фотодинамической активности, а циклоимид (36) в аналогичных условиях вызывает 100% торможение роста опухоли на 7 день.
Так, при обработке JV-гексилциклоимида хлорина р$ (8д) 30% раствором бромистого водорода в уксусной кислоте и затем 1-гептанолом был получен 3-(1-гелтилокси)этил-#—гексилциклоимид хлорина/ (386) с выходом 60 % [41]. В качестве побочного продукта выделено также 3-(1-гептилокси-2-бром)этил производное (40). Образование последнего можно уменьшить при соблюдении безводных условий, использовании свежеприготовленного раствора HBr/АсОН (не содержащий брома) и добавлении безводного карбоната калия. Этим способом был синтезирован ряд 3-(1-0-алкокси)этилциклоимидов хлорина р6 (35), (386), (41)-(46) с различной длиной углеводородной цепи при 3-0 и 132-N атомах. Полученные алкоксипроизводные имеют интенсивное поглощение при 700 нм с 8=45000. Различия в липофильности синтезированных циклоимидов слабо сказываются на выходе синглетного кислорода, который составляет 57-60%. Изучение фотосенсибилизиругощей активности полученных алкоксизамещенных циклоимидов проводили на мышах СЗН с имплантированной опухолью RJF [21,42], Предварительные исследования, проведенные на этой серии ІУ-алкилциклоимидов, показали, что противоопухолевая активность повышается с увеличением липофильности и достигает максимума при ее среднем значении (log Р = 10.3 - 10.8). В ряду хлоринов с logP в интервале 10,7 - 10.9 (циклоимиды (35), ( 43 ), ( 44 ), ( 45 ) и ( 46 )) наибольшую фотодинамическую активность проявил циклоимид (44), обеспечивший 67% торможение роста опухоли на 30-й день. Синтезированные 3-(1-0-алкокси)этилциклоимиды хлорина / накапливаются в опухоли в концентрациях 4.8-11.5 мкмоль/кг. Интересно отметить, что для соединений с одинаковой липофильностью наличие и местоположение алкильных групп ( Э-алкил- или Л -алкил-) существенно влияет на селективность накопления и фотодинамическую активность in vivo. Так, хлорин (41) (К1=метил, Яг=додецил, log Р =10.9) накапливается в опухоли в концентрации 15.5 мкмоль/кг, что значительно выше, чем для соединения (45) (ІІі=додецил, К.2=метил, log =10.7, накопление 6.3 мкмоль/кг), однако последнее проявляет более высокую селективность (отношение опухоль-кожа 3.57). Аналогично хлорины (46) (log Р-7.7) и (35) (\ogP=7.S) накапливаются в концентрациях 6.4 и 10.1 мкмоль/кг, соответственно, В случае циклоимидов (47) и (48) с одинаковой липофильностью (log .Р=13.4) наблюдалось накопление в концентрациях 2.0 и 4.3 мкмоль/кг, соответственно. Среди 3-алкоксизамещенных Лг-алкилциклоимидов хлорина рб, изученных на сегодняшний день, по фотобиологическим свойствам лучшими кандидатами для ФДТ являются 3-(1-гептилокси)этил-Лг-гексилциклоимнд (386) и З-Ц-гексилоксиЭэтил-Л -гептилциклоимид (43) [17]. Одним из способов модификации винильной группы, позволяющим существенно сместить максимум поглощения циклонмидов в длинноволновую область, является окисление винильной группы до формильной.
Действием периодата натрия в присутствии каталитических количеств тетраоксида осмия циклоимид (8д) превращен в 3-формилхлорин (526) (схема 11) [23]. Аналогичным образом из соединений (49) - (51) были получены формилпроизводные (53а), (54а) и (556) [28,43,44]. Выход 3-формилхлоринов составил 60-65%, Наличие формильной группы в циклоимидах (526), (53а), (54а) и (556) подтверждено данными Н ЯМР, где имеются сигналы интенсивностью в один протон в области 5 11.34 - 11.36 м.д., которые отнесены к протону альдегидной группы. В электронных спектрах поглощения полученных соединений наблюдается смещение максимума основной полосы в длинноволновую область по сравнению с исходными циклоимидами на 35-37 нм. Дальнейшее смещение максимума в длинноволновую область наблюдалось при конденсации 3-формилциклоимида (53а) с малононитрилом (схема 11) [28,44]. Полученный хлорин (56) имел максимум поглощения при 754 нм. Восстановление формильной группы циклоимида (53а) боргидридом натрия в тетрагидрофуране приводит к 3-гидроксиметилзамещенному циклоимиду (57) и сопровождается существенным гипсохромным сдвигом максимума поглощения до 708 нм [28,44]. Химические превращения заместителей при атоме азота имидного кольца возможны при наличии реакционноспособных функциональных групп. Циклоимиды, содержащие гидроксильную группу при атоме азота, метилируются диазометаном, превращаясь в JV-метоксициклоимид (58) с выходом 89% (схема 12) [28,44]. Алкилированием Л -гидроксициклоимида (316) йодистым метилом или 1-бром-З- хлорпропаном в присутствии гидрида натрия в диоксане синтезированы ТУ-метокси- и Я-(3-хлорпропилокси)циклоимиды (58) и (59). В электронных спектрах этих соединений максимум поглощения находится в области 711 нм. Л -Гидроксициклоимиды реагируют с ангидридами карбоновых кислот. Обработка соединений (31а) и (316) уксусным ангидридом в диоксане приводит к ЛГ-ацетоксициклоимидам (60а) и (606) с выходом 68.8 и 73.3% [28,44]. При взаимодействии JV-гидроксициклоимида (316) с янтарным ангидридом в пиридине и затем с диазометаном получен Л -метоксисукцинилоксициклоимид (61) с выходом 75%. Хлорангидриды карбоновых кислот, например пальмитоилхлорид, реагируют с JV-гидроксициклоимидом (316) в хлороформе в присутствии пиридина с образованием JV-пальмитоилоксициклоимида хлорина/ (62) с высоким выходом. Свободная аминогруппа при атоме азота имидного кольца легко вступает в реакции алкилирования, тозилирования и ацетилирования [30,45]. Так, при обработке циклоимида (33) метилиодидом получено ЛуУ-диметиламинопроизводное (63). Аналогично из Лг-аминоциклоимида (33) и тозилхлорида синтезировано ТУ-тозилзамещенное производное (64). Ацилированием циклоимида (33) хлорангидридом изоникотиновой кислоты получен хлорин (65), а кватернизация атома азота в пиридиновом кольце дает катионный циклоимид (66), проявивший высокую антимикробную, фунгицидную и фото динамическую активность [45,46].
Превращения в пиррольном кольце D
Аналогично природным хлоринам - феофорбиду, пирофеофорбиду [51], 13,15-диметиловому эфиру хлорина [52], пурпурину 18 [53], циклоимиды хлорина/ с остатком пропионовой кислоты под действием 2,3-дихлор-5,6-дицианбензохинона (ДДХ) подвергаются окислительной циклизации с образованием 8-лактонного кольца при пиррольном цикле D. Так, обработка циклоимидов (29а) и (60а) ДДХ в хлороформе приводит к 175,18-5-лактонам 13,15-N-(3-гидроксипропил)- (83) и JV-aueTOKCH-(84) циклоимидов с выходом 52-54% (схема 16) [28,29], В электронных спектрах соединений (83) и (84) интенсивный максимум основной полосы поглощения независимо от природы заместителя у атома азота имидного кольца находится в области 708 нм, полоса Соре - при 418 нм. Таким образом, соединеия (83) и (84) одновременно содержат имидное кольцо и шестичленний лактонный цикл, конденсированный с кольцом D, и, благодаря широкой возможности модификации обоих циклов и заместителей, могут являться перспективными соединениями для синтеза сенсибилизаторов для ФДТ, Однако химические свойства 5-лактонов циклоимидов еще мало изучены. Известно лишь, что обработка б-лактона (83) трифторуксуной кислотой в метаноле дает порфирин (85) [44]. Порфирины (85) и (86) были также получены дегидрированием метиловых эфиров циклоимидов (296) и (606). В спектрах Н ЯМР этих соединений отсутствуют сигналы двух протонов в положении 17 и 18. Группа протонов 175-СНз, П -СНг и 172-СНг проявляются в спектре соответственно в виде синглетов при 5 3.40 (85) и 3.39 м.д. (86) и триплетов при 8 4.13, 3.25 (85) и 3.83, 3.14 м.д. (86), В пользу порфириновой структуры более сильное поле (5 -1.89, -2.32 (85) и -2.06, -2,35 м.д. (86)). Электронные спектры этих соединений также свидетельствует смещение синглетов протонов двух NH-групп в поглощения соединений (85) и (86) имеют необычный порядок интенсивности полос I II II1 IV, причем наблюдается гипсохромный сдвиг полосы I на 42 нм и батохромный сдвиг полосы Соре на 16 нм по сравнению с исходными циклоимидами. 1.2.6. Модификация пирролышго кольца В Окисление 3-формилциклоимидов тетраоксидом осмия в присутствии пиридина приводит к 7,8-дигидроксибактериохлоринам. Гидроксилирование двойных углерод-углеродных связей под действием тетраоксида осмия известно уже многие годы, однако дебаты по поводу механизма этой реакции продолжаются до сих пор. Было предложено два альтернативных механизма образования стабильного осмиевого комплекса с двумя связями углерод - кислород.
Как показано на схеме 17, в результате циклоприсоедиыения две связи могут образовываться одновременно (а) или последовательно (б). По последним данным механизм [(3+2)циклоприсоединения] является предпочтительным, однако обсуждение этого вопроса продолжается [17]. Пандей и др. [54], изучая влияние электроноакцепторных групп на реакционную способность тетрапиррольных структур в реакциях с тетраоксидом осмия, обнаружили, что региоспецифичность окисления в значительной степени зависит от наличия электроноакцепторных групп в макроцикле. Преимущественному окислению обычно подвергается пиррольное кольцо, соседнее с электроотрицательной группой. При этом основным продуктом реакции является дигидроксибактериохлорин [55]. Так, окисление 3-формилциклоимидов (526) и (556) тетраоксидом осмия в присутствии пиридина приводит к 7,8-дигидроксибактериохлоринам (87), (88) (схема 18) [23]. В результате пинаколиновой перегруппировки в кислых условиях дигидроксипроизводные могут быть превращены в соответствующие кетохлорины. Способность заместителей к миграции при пинаколиновой перегруппировке также зависит от наличия электроноакцепторных групп. В случае хлориновых систем, когда в В отличие от пинаколиновой перегруппировки вицинальных дигидроксибактериохлоринов, приводящей к 7- и 8-кетоаналогам, при кипячении циклоимидов (89) и (92) в одихлорбензоле образуются только 8-кетобактериохлорины (91) и (95) (схема 20) [56]. После хроматографического разделения смеси продуктов 8-кетобактериоциклоимиды (91), (95) были получены с выходом 9-12%. Другими продуктами этой реакции явились 8-винилциклоимиды (93) и (94) (выход 50-55%). Это указывает на то, что гидроксильная группа в положении 7 отщепляется первой с образованием карбокатиона (98), который быстро перегруппировывается в 8-кето- производное (91) (схема 21). Особый интерес представляли продукты, полученные с выходом 25-30% и по данным масс-спектрометрии имевшие димерную структуру. Анализ данных спектров Н ЯМР/ROESY позволил приписать этим соединениям структуры (96) и (97).
В соответствии с предложенным авторами [56] механизмом образования димера (схема 21), гидроксильная группа в положении 7 отщепляется первой с образованием карбокатиона Таким образом, химические превращения циклоимидов хлорина рв открывают широкие возможности для синтеза разнообразных производных природных хлоринов. Эти соединения представляют также особый интерес, так как обладают хорошими спектральными характеристиками, способностью накапливаться в опухоли в высоких концентрациях и, в большинстве случаев, высокой фотодинамической активностью, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для биологии и медицины. Известно, что введение гидроксильных групп в гидрофобные производные природного хлорофилла а существенно изменяет амфифильность последних. При этом гидроксильные группы могут находиться как непосредственно в макроцикле, так и в составе боковых заместителей. Как правило, амфифильные вещества хорошо накапливаются в опухолях [57-68]. Особый интерес представляют соединения, в которых гидрофобные и гидрофильные заместители расположены в противоположных участках макроцикла. Они легче проникают в клетку и затем концентрируются в ее жизненно важных элементах. Создание новых сенсибилизаторов с различным расположением полярных (гидроксильных и карбоксильных) заместителей в хлориновом макроцикле представляет интерес для изучения механизмов накопления фотосенсибилизаторов в раковых опухолях. Большинство производных хлорофилла а поглощает при 665 нм. Наличие дополнительного сопряженного цикла в молекуле хлорина приводит к смещению основной полосы поглощения в длинноволновую область. Поэтому особое внимание заслуживают производные хлорина р$, содержащие дополнительный имидный экзоцикл. Эти соединения интенсивно поглощают в красной области спектра, причем по сравнению с пурпурином 18 они имеют батохромное смещение основной полосы поглощения на 10-18 нм, а также большую устойчивость в щелочных средах. В настоящей работе получение циклоимидов хлорина рв осуществлялось превращением ангидридного кольца природного пурпурина 18 в имидный цикл, содержащий при атоме азота гидрокси- и и-гидроксиалкильные группы. В целях улучшения спектральных характеристик и введения полярных групп в макроцикл проводилась дальнейшая модификация циклоимидов гидроксилированием пиррольного кольца D, окислением винильной группы в пиррольном кольце А и двойной связи кольца В, а также формилированием винильной группы комплексом Вильсмейера. Пурпурин 18 получали окислением хлорофилла а, предварительно экстрагированного из синезеленых водорослей Spirulina platensis, кислородом воздуха в щелочных условиях по технологии, отработанной на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М.В.Ломоносова [69]. Метиловый эфир пурпурина 18 синтезирован обработкой пурпурина 18 диазометаном [70а].
Химические превращения винильной группы пиррольного кольца А
Многочисленные модификации природных хлоринов связаны с возможностью различных превращений винильной группы в пиррольном кольце А. Известно введение гидрофобных заместителей обработкой хлоринов раствором бромистого водорода в уксусной кислоте с последующим взаимодействием со спиртами [33]. Показано влияние длины гидрофобной цепи на противоопухолевую активность хлоринов. Для З-алкоксштил-ІУ-алкилциклоимидов хлорина рб найдено, что по мере удлинения гидрофобной цепи активность фотосенсибилизаторов повышается [21]. Однако, подобная модификация винильной группы вызывает гипсохромный сдвиг полос поглощения вновь синтезированных циклоимидов. Иной путь модификации основан на селективном окислении винильной группы. В зависимости от окислителя могут быть получены соединения, содержащие гидроксильную или формильную группы. На примере пурпурина 18 показано, что окисление тетраоксидом осмия приводит к З ,3 -дитидроксизамещенному пурпурину 18 [75]. С более высоким выходом это соединение получается при окислении Диоксидом N- метилморфолина в присутствии тетраоксида осмия. Окисление образующегося дигидроксипроизводного периодной кислотой приводит к 3-формилпурпурину 18 [76]. З-Формилциклоимиды получаются окислением циклоимидов периодатом натрия в присутствии каталитических количеств тетраоксида осмия [23,25]. Таким образом, модификация природных хлоринов по пиррольному кольцу А может как увеличивать, так и понижать гидрофобность верхней части макроцикла. Кроме того, замена винильной группы на формильную группу значительно улучшает спектральные характеристики. С учетом этого, нами проведен ряд химических превращений винильной группы циклоимидов хлорина/. Циклоимиды (3), (9) и (10а) были окислены периодатом натрия в присутствии каталитических количеств тетраоксида осмия в диоксане в течение 20 часов (схема 4). В процессе работы удалось увеличить выход ранее описанных 3-формилциклоимидов (21а) и (22а) до 72-74%, а также получить новый 3-формил-Лг- метоксициклоимид (236) с выходом 80%. Масс-спектр последнего содержит интенсивный пик молекулярного иона с m/z 610.0. В электронных спектрах соединений (21а), (22а) и (236) наблюдается батохромний сдвиг длинноволнового максимума поглощения на 29- 35 нм по сравнению с исходными циклоимидами (3), (9) и (10а) (таблица 1). Существенное смещение максимума поглощения в длинноволновую область (на 20-30 нм) наблюдается также в случае замещения атома водорода винильной группы на формильную.
Для получения циклоимидов с 2-формилвинильной группой нами была использована реакция Вильсмейера. В химии хлоринов эта реакция обычно применяется для синтеза 20-формилхлоринов [77-80]. Имеются, однако, данные, что при наличии в хл ори новом макроцикле винильнои группы, она первой взаимодействует с комплексом Вильсмейера [81]. Деметаллирование соединения (27) смесью серной и трифторуксусноЙ кислот (15:85) дает 3-(2-формилвинил)пурпурин 18 (30) с выходом 53%, а обработка серной кислотой непосредственно иминиевой соли, образующейся при взаимодействии соединения (24) с комплексом Вильсмейера - 58%. Масс-спектр хлорина (30) содержит пик молекулярного иона с m/z 606.2. В электронном спектре наблюдается батохромныЙ сдвиг максимума поглощения до 728 нм. Соединение (25) реагирует с ДМФА-РОСЬ в течение 48 часов при комнатной температуре с образованием 3-(2-формилвинил)циклоимида (28) с выходом 78%. Использование в этой реакции в качестве растворителя хлороформа уменьшало время реакции до 18 часов, а выход соединения (28) повышался до 90%. Масс-спектр медного і комплекса циклоимида (28) содержит пики молекулярных ионов с m/z 724.1 и 726.0. В обоих случая высокие выходы Си (ІІ)-комплексов 3-(2-формилвинил)пурпурина 18 (27) и іУ-ацетоксициклоимида (28) свидетельствуют о том, что реакция формилирования протекает по винильной группе и не затрагивает ЛІЄЗО-ПОЛОЖЄНИЙ в макроцикле. При кипячении (ПукомплексаЛ -ацетоксициклоимида хлоринар6 (26) с комплексом ДМФА- РОСЬ в ДМФА в течение 1 часа также не наблюдалось образования л езо-замещенных продуктов. В результате был выделен только ЩП)-комплекс 3-(2-формилвинил)циклоимида (29) с выходом 74%. Одновременно с удалением металла из соединения (28) смесью серной и трифторуксусной кислот (15:85) происходит гидролиз ацетоксигруппы при атоме азота имидного кольца. В результате ранее неописанный 3-(2-формилвинил)-Лг-гидроксициклоимид (31) был получен с выходом 55%. В масс-спектре этого соединения имеется пик молекулярного иона с m/z 622 А. JV-Гидроксициклоимид (31), содержащий 2-формилвинильную группу в положении 3 пиррольного кольца А, поглощает при 744 нм. Таким образом, формилирование металлокомплексов пурпурина 18 (24) и циклоимидов (25) и (26) приводит к соединениям (30) и (31) с батохромным сдвигом полосы поглощения по сравнению с исходными пурпурином 18 (16) на 26-28 нм (таблица 1). При обработке 3-(2-формилвинил)-Л/-гидроксициклоимида (31) уксусным ангидридом получен 3-(2ч]юрмилвинил)-7У-ацетоксициклоимид (32) с выходом 88%. Этот хлорин поглощает при 739 нм. Его масс-спектр содержит пик молекулярного иона с m/z 663.3. В спектре ]Н ЯМР хлорина наряду с сигналами трех ліезо-протонов при 9.57, 9.37 и 8.67 м.д. имеются дублеты интенсивностью в один протон каждый при 10.10 и 8.74 м.д., отнесенные к 32-СНО и З -СН, а также дублет дублетов 32-СН (.7=17.0 Гц) при 7.35 м.д. Величина константы спин-спинового взаимодействия указывает на транс- конфигурацию двойной связи формилвинильной группы.
Для снижения гидрофобности верхней части хлоринового макроцикла формилвинилциклоимид (32) восстанавливали боргидридом натрия в тетрагидрофуране до соответствующего спирта (33). В масс-спектре соединения (33) присутствует пик с m/z 666.4 (АҐ+Н). В электронном спектре хлорина (33) по сравнению с исходным формилвинилпроизводным (32) наблюдается гипсохромный сдвиг основной полосы поглощения на 28 нм. Максимум поглощения хлорина (33) находится при 711 нм. На основании данных по формилированию Си(П)-комплекса пурпурина 18 (24), Cu(II)- и Мі(ІІ)-комплексов TV-ацетоксициклоимидов (25) и (26) в условиях реакции Вильсмейера можно сделать вывод, что наличие формилвинильной группы в этих системах снижает реакционную способность 20--мезо-положения, В пользу этого свидетельствует также и тот факт, что при повторной обработке Си(П)-3-(2-формилвинил)циклоимидов (30) и (32) комплексом Вильсмейера образования 20-л езо-замещенных продуктов не наблюдалось. Таким образом, циклоимиды хлорина рб, имеющие в положении 3 макроцикла сильные электроноакцепторные заместители, являются, с точки зрения спектральных характеристик, перспективными соединениями для ФДТ. Дальнейшие исследования должны показать будут ли эти соединения удовлетворять и другим требованиям, предъявляемым к сенсибилизаторам второго поколения. Известно, что 3-формилхлорин Єб [54] и 3-формилпурпурин 18 [23] взаимодействуют с тетраоксидом осмия с образованием соответствующих 7,8-дигидрокси-З-формилбактериохлоринов, в электронных спектрах которых полосы поглощения смещены по сравнению с исходным 3-формилхлорином в длинноволновую область на 80 - 90 нм. Среди ранее полученных 7,8-дигидрокси-З-формилбактериохлоринов наибольший батохромный сдвиг имеют 7,8-дигидрокси-З-формилбактериопурпурин (до 813 нм) и 7,8-дигидрокси-З-формилбактериоциклоимид (до 816 нм) [23], содержащие ангидридный и имидный циклы, сопряженные с основным макроциклом. Введение двух гидроксильных групп в пиррольное кольцо В Л З-гидроксипропил)- и Аґ-метоксициклоимидов нами осуществлялось обработкой соответствующих 3-формилциклоимидов тетраоксидом осмия в присутствии пиридина с последующим разрушением осматного комплекса сероводородом (схема 5). Ранее неизвестное 7,8-дигидроксибактериопроизводное (346) было получено окислением З-формил-ТУ-метоксициклоимида (236) тетраоксидом осмия с выходом 81%. В его масс-спектре присутствует пик молекулярного иона с m/z 643.3.
Анализ данных по биологической активности Л^гидроксиалкил- и JV-гидроксициклоимидов хлорина pg и их производных
Фотобиологические свойства Л ю-гидроксиалкил)- и /V-гидроксициклоимидов хлорина рб, а также их производных, в отличие от JV-алкилциклоимидов, к началу настоящей работы были изучены недостаточно. Циклоимиды (2), (3), (6а,б), (9) и (10а) были синтезированы в необходимых количествах, что обеспечило более глубокое исследование их селективного накопления в раковых клетках, генерирования синглетного кислорода при облучении светом и фотодинамической активности в условиях in vitro и in vivo [84-89]. Для 13,15-ЛЦ2чтідроксизтил)циклоимнда хлорина рб (2), ІЗЛб-Л З-гидроксипропил иклоимида р# (3), метилового эфира 13,15-Л -гидроксициклоимида/ б (66), метилового эфира 13,15-ЛГ-метоксициклоимида/ б (9) и ІЗДЗ-Л ацетоксициклоимида pg (10а) были выполнены биологические испытания in vitro, а для циклоимида (3) получены также данные по ФДТ in vivo . Все перечисленные циклоимидные производные хлорина ре обладают низкой темновой токсичностью. Хлорины характеризуются достаточно высоким квантовым выходом синглетного кислорода (0.35-0.73), при этом максимальное значение 0.73 наблюдалось для N-метоксициклоимида хлорина ps (9), а минимальное 0.35 зарегистрировано для /У-гидроксициклоимида (бб) (таблица 2). Фотостабильность циклоимидов снижается в ряду (бб) (3) (2),(9),(10а). Интересно отметить, что наибольшую фототоксичность на клетках аденокарциномы легкого человека А549 проявил метиловый эфир Аґ-гидроксициклоимида хлорина рб (бб). Для изученных циклоимидов она убывала в ряду (66) (9) (3) (2) (10a). Активность хлорина (66) в 8 раз выше, чем у соединения (10а), а фото динамическая активность цикл о- имида (10а) в 100 и 280 раз выше, чем для хлорина рб и препарата Фотогем, соответственно. При этом не наблюдалось прямой взаимосвязи между фотодинамической активностью этих циклоимидных производных и их концентрацией в раковой клетке, которая достигала наибольших значений у соединений (9) и (10а). Ранее полученные данные по фотодинамической активности Лг-гексилциклоимидов хлорина ps [21,22] также свидетельствовали о том, что высокая концентрация сенсибилизатора в опухоли не является главным критерием его эффективности.
Было высказано предположение, что для того, чтобы фотосенсибилизатор был эффективен, он должен локализоваться в наиболее чувствительных к фотодинамическому воздействию участках раковой клетки. Изучение внутриклеточного распределения циклоимидов (2), (3), (66), (9) и (10а) на клетках А549 показало, что соединения с полярными группами (циклоимиды (2), (3) и (66), содержащие гидроксильную или ю-гидроксиалкильные группы при атоме азота имидного кольца, а также Лґ-ацетоксициклоимид (Юа) со свободным остатком пропионовой кислоты) накапливаются в митохондриях и аппарате Гольджи, тогда как гидрофобный метиловый эфир Л -метоксициклоимида (9) локализуется в лизосомах. Согласно литературным данным [90-99], воздействие сенсибилизатора на вышеперечисленные участки может инициировать процесс апоптоза клетки. Возможно, характер внутриклеточной локализации N-гидроксициклоимида (66) является одной из причин того, что, имея самые низкие квантовый выход синглетного кислорода и концентрацию накопления в раковой клетке, это соединение проявляет высокую фотодинамическую активность. Предварительные данные по фотодинамической активности Лг-(3-гидроксипропил)циклоимида хлорина рб (3) in vivo получены на мышах с лимфолейкозом Р388. Циклоимид (3) вызывает практически 100% торможение роста опухоли с 7 по 14 день наблюдения при дозе 2.5 мг/кг. При этом наблюдался высокий процент животных без опухоли с полным восстановлением кожного покрова. Таким образом, полученные данные по накоплению в раковых клетках и фотодинамической активности ІУ-гидроксиалкил- (2), (3) и iV-гидрокси- (66) циклоимидов хлорина ре, а также производных (9) и (10а), подтверждают ранее высказанное предположение о существовании корреляции между характером внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора и его фотодинамической активностью. Аналитическая ТСХ проведена на пластинках HPTLC-Kieselgel 60 с концентрирующей зоной (Merck, Германия). Для препаративной ТСХ применяли Kieselgel 60 Н (Merck, Германия) (А) и силикагель CHEMAPOL L 5/40 (Чехия) (Б) на пластинках 20x20 см с толщиной слоя 1 мм. Электронные спектры соединений записаны на спектрофотометре "Jasco 7800" в области 400-800 нм в СНСЬ. Н и 13С ЯМР спектры в CDC13 регистрировали на спектрометре "Bruker АМХ 500". ИК-спектры в таблетках КВг сняты на спектрометре "Nicolet Magna 750" в области 400-3600 см 1. Масс-спектры записаны на приборе "Vision 2000" с использованием метода MALDI в сочетании с время-пролетным анализатором (А). Масс-спектры высокого разрешения (HMRS) (Б) для соединений (30) и (31) получены на приборе "Micromass Autospec" (EI, 70eV, 200C). Используемый в синтезах пурпурин 18 (la) приготовлен из синезеленых водорослей Spirulina platensis по методике [69]. Метиловый эфир пурпурина 18 (16) синтезирован обработкой пурпурина 18 (1а) диазометаном [70а]. Cu(II)- Комплексы пурпурина 18 (24) и ЛГ-ацетоксициклоимида (25) и №(П)-комплекс (26) получены из метиловых эфиров пурпурина 18 (16) и Мацетоксициклоимида хлорина рб (106) по аналогии с методиками [706]. 13,15-Лг-(2-Гидрокснэтил)циклонмид хлорина / (2). К раствору 76.0 мг (0.134 ммоль) пурпурина 18 (1а) в 40 мл хлороформа добавляют 32.7 мг (0.536 ммоль) аминоэтанола и перемешивают 24 часа при 25 С.
Реакционную массу промывают водой, органический слой отделяют, сушат сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 2 мл уксусного ангидрида и снова перемешивают 15 мин. К реакционной смеси постепенно прибавляют 10 мл 5%-ного водного раствора гидроксида натрия и перемешивают в течение 1.5 часа. Реакционную массу нейтрализуют 0.1 N раствором соляной кислоты, продукт экстрагируют хлороформом, органический слой промывают водой, сушат сульфатом натрия и растворитель упаривают в вакууме. Остаток разделяют флэш-хроматографией на колонке (30x80 мм) с силикагелем (А) в системе хлороформ:метанол (50:4). После перекристаллизации из смеси хлороформ-гексан получено 36.8 мг (45%) хлорина (2). Электронный спектр, Хмакс, нм (е/10э): 420 (91.2), 513 (4.7), 552 (17.7), 654 (6.9), 711 (33.0). По литературным данным [28] Я.макс, нм (є/103), СНС13: 420 (90.8), 513 (4.6), 552 (17.2), 654 (6.7), 711 (32.6). 13,15-ЛГ-(3-Гидроксипропил)циклоимид хлорина р$ (3). Аналогично синтезу хлорина (2) из 68.8 мг (0.122 ммоль) пурпурина 18 (1а) и 36.6 мг (0.488 ммоль) 3-аминопропанола в 40 мл хлороформа после очистки флэш-хроматографией на колонке (30x80 мм) с силикагелем (Б) в системе хлороформ :метанол (50:4) и перекристаллизации из смеси хлороформ-гексан получено 35.6 мг (47%) целевого продукта (3). Электронный спектр, Хкс, нм (є/103): 420 (128.8), 484 (6.8), 513 (7.6), 552 (19.0), 671(12.5), 711 (31.9). По литературным данным [28] Хмакс, нм (є/103), СНС13: 420 (128.3), 484 (6.6), 513 (7.4), 552 (18.6), 671 (12.1), 711 (31.5). 13Д5-Лг-(5-Гидроксипентил)циклоимид хлорина рв (4). К раствору 54.0 мг (0.096 ммоль) пурпурина 18 (1а) в 30 мл хлороформа прибавляют 39.5 мг (0.383 ммоль) 5-аминопентанола и перемешивают 72 часа при 25. Реакционную массу промывают водой, органический слой отделяют, сушат сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 2 мл уксусного ангидрида и снова перемешивают 15 мин. К реакционной смеси прибавляют 20 мл 5%-ного водного раствора гидроксида натрия и перемешивают в течение 1.5 часа. Реакционную массу нейтрализуют раствором 0.1 N соляной кислоты, продукт экстрагируют хлороформом, органический слой промывают водой, сушат сульфатом натрия и растворитель упаривают в вакууме. Остаток разделяют флэш-хроматографией на колонке (30x80 мм) с силикагелем (А) в системе хлороформ :метанол (50:4). После перекристаллизации из смеси хлороформ - гексан получено 21.7 мг (35%) хлорина (4). Электронный спектр, XuaKQt нм (є/103): 419 (86.7), 482 (6.1), 509 (7.0), 550 (16.4), 597 (3.0), 661 (7.2), 708 (31.2).
