Содержание к диссертации
Введение
Оксилипины - сигнальные молекулы процессов развития микроорганизмов и взаимодействия хозяин-грибной патоген 10
2.2.1. Пути биосинтеза оксилипинов 10
2.2.2. Роль грибных оксилипинов 13
2.2.3. Гены биосинтеза оксилипинов в грибах Aspergillus 19
2.2.4. Профиль оксилипинов грибного происхождения 20
2.2.5. Регуляция оксилипин-зависимых путей в грибах рода Aspergillus 22
2.2.6. Оксилипины и вторичный метаболизм в грибах 23
2.2.7. Оксилипины в процессах патогенеза грибковых поражений 25
2.2.8. Оксилипины как молекулы межклеточного сообщения 26
2.2.9. Модели восприятия оксилипиновых сигналов 32
Механизмы митохондриального р-окисления полиненасыщенных жирных кислот 33
2.3.1. Активация жирных кислот 33
2.3.2. Карнитин-зависимое проникновение ЖК в митохондрии 34
2.3.3. Ферменты цепи р-окисления 35
2.3.4. р-Окисление ненасыщенных жирных кислот разного типа 38
Заключение 41
Обсуждение результатов 43
Синтез 3-й 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных 45
3.1.1. Полный химический синтез 3-гидроксиполиеновых кислот и их аналогов 47
3.1.2. Способ ферментативного получения 3(Я),15(5)-дигидрокси- (5Z,8Z,112,13)-эйкозатетраеновой кислоты (15а) 49
3.1.4. Синтез ю-гидроксильных производных линолевои и ос-линоленовой кислот 52
Изучение ферментативной трансформации, метаболизма 3- и 18-гидроксилипинов и их влияния на передачу сигналов в клетках млекопитающих 55
3.2.1. Исследование ферментативной трансформации 3-гидроксиэйкоза- тетраеновой кислоты (9с) и ее аналогов с использованием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих 56
3.2.2. Исследование метаболизма 3(Д/5)-НЕТЕ (9с) и ЩЩ-НЕТЕ (26)
в клетках дрожжей Dipodascopsis uninucleata и Candida albicans 58
3.2.3. Изучение влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в клетках млекопитающих с применением известных репортерных систем 63
Экспериментальная часть 68
Приборы и материалы 69
К разделу 3.1. Синтез 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных 70
К разделу 3.2.1. Конверсия 3-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (9с), ее метилового эфира, 3(і?)-метоксизйкозатераеновой кислоты (96) под действием 12-липоксигеназ и циклооксигеназы-2 млекопитающих 86
К разделу 3.2.2. Наращивание культур дрожжей Dipodascopsis uninucleata и Candida albicans, питавшихся АК, 3- и 18-гидроксилипинами, выделение продуктов метаболизма жирнокислотных субстратов, определение характера и скорости метаболизма 87
К разделу 3.2.3. Изучение влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в клетках млекопитающих с применением известных репортерных систем 89
Выводы 92
Литература
- Роль грибных оксилипинов
- Модели восприятия оксилипиновых сигналов
- Способ ферментативного получения 3(Я),15(5)-дигидрокси- (5Z,8Z,112,13)-эйкозатетраеновой кислоты (15а)
- Исследование ферментативной трансформации 3-гидроксиэйкоза- тетраеновой кислоты (9с) и ее аналогов с использованием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих
Введение к работе
Микозы сопровождают человеческую цивилизацию не одно тысячелетие. Возбудителями микозов являются микроскопические грибы, одноклеточные или многоклеточные эукариоты - хемоорганогетеротрофы по способу питания. В настоящее время наблюдается значительный рост заболеваемости микозами из-за миграции населения и изменения образа жизни в индустриальных странах. Особенно ощутим вред микозов в трансплантологии, онкогематологии, неонаталогии, а наиболее распространенные возбудители микозов, такие как дрожжи Candida spp., уверенно вытесняют с лидирующих позиций внутрибольничных бактериальных возбудителей. Микозы лидируют в структуре СПИД-ассоциированных патологий, поражая организм, лишенный иммунной защиты. Для разработки эффективных подходов к терапии и диагностике микологических инфекций актуальным является фундаментальное изучение метаболических и сигнальных процессов, определяющих вирулентные свойства, механизмы развития и патогенеза болезнетворных грибов.
В последнее время интенсивно исследуется липидный метаболизм грибов с целью выявления потенциальных клеточных мишеней, знания о которых могут открыть перспективы создания новых фунгицидных или фунгистатических препаратов. Особенное внимание привлекают оксилипины, представляющие широкое семейство окисленных производных полиненасыщенных жирных кислот и выполняющие регуляторную и сигнальную функции в организме животных, растений и грибов. Среди них гидроксилипины - гидроксипроизводные жирных кислот - наиболее распространены в царстве грибов и играют важную роль в процессах роста и развития этих микроорганизмов. 3- и 18-Гидроксиполиеновые кислоты были обнаружены как продукты трансформации эндогенных и экзогенных жирных кислот в некоторых видах микроскопических грибов и дрожжей (Mucor genevensis, Dipodascopsis uninucleata, Lipomyces yarrowii, Candida albicans, Gaeumannomyces graminis), показано их участие в росте и морфогенезе грибов, а также в модуляции защитных реакций клеток млекопитающих. Для изучения процессов окисления липидных компонентов клеточных мембран растений и грибов, а также с целью выяснения механизмов действия биологически активных оксилипинов необходимы препаративные количества образцов этих соединений, что делает актуальным поиск эффективных методов их получения.
Оксилипины, являющиеся производными длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот, достаточно трудно выделить из природных источников в количествах, необходимых для проведения биохимических исследований. Поэтому для изучения
механизмов биосинтеза липидных метаболитов в грибах и трансдукции сигналов в животных клетках при микозном поражении актуальной задачей является разработка новых подходов к химическому, ферментативному, микробиологическому синтезу 3-гидрокси- и 18-гидроксипроизводных жирных кислот, их предшественников и изотопно-меченных аналогов.
Таким образом, целью настоящей работы является синтез, наработка и изучение биохимических свойств новых и известных 3- и 18-гидроксилипинов природной структуры. Основные задачи исследования состояли в разработке новых методических подходов к химическому и ферментативному синтезу, в том числе препаративному, 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных; в изучении метаболизма синтезированных 3- и 18-гидроксиполиеновых кислот в дрожжах и их ферментативных превращений с использованием оксигеназ млекопитающих; в определении влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в животных клетках.
Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках темы № 1Б-4-355 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины», по грантам РФФИ 02-03-33138, 04-03-32454, 05-03-32392, президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2013.2003.3, а также частью работ, выполняемых в плане проекта по исследованию 3-гидроксиполиеновых жирных кислот в лаборатории эйкозаноидов кафедры гинекологии медицинского университетского центра Свободного Университета Берлина (Германия) при поддержке VW-фонда (грант Ni-1/77643).
Роль грибных оксилипинов
Грибы относятся к эукариотам, по типу питания это хемоорганогетеротрофы. Грибы растут в аэробных условиях и получают энергию путем окисления органических веществ. По сравнению с растениями, имеющими корни, стебли, листья, грибы морфологически слабо дифференцированы, у них почти нет функционального разделения между различными частями организма.
Жизненный цикл грибов состоит из двух стадий - половой (репродуктивной) и бесполой (вегетативной). В репродуктивной фазе тело гриба имеет более сложное строение и состоит из дифференцированных клеток, имеет специальные репродуктивные органы. Среди них выделяют структуры, позволяющие переносить неблагоприятные условия, и структуры распространения (споры и несущие их органы). На различиях в этих признаках основана идентификация родов и видов большинства грибов. Грибы размножаются с помощью спор, которые образуются в результате митоза или мейоза. В первом случае тип спорообразования и стадия развития гриба называются бесполыми, сами бесполые споры - конидиями [18]. Во втором случае тип размножения называется половым, а само имя споры чаще применяется именно к половым спорам. Большинство возбудителей микозов в культуре представлено только вегетативной стадией. В связи с этим в идентификации болезнетворных грибов первоочередное значение имеют особенности морфологии органов бесполого размножения (конидиогенеза). Классификация грибов преследует в основном практические цели, учитывая при этом и филогенетические связи. Номенклатура грибов бинарная: каждый вид имеет родовое и видовое название. Виды объединяются в роды, роды - в семейства (-асеае), семейства - в порядки (-ales), порядки - в классы (-mycetes) [19].
Вегетативное тело (таллом) гриба состоит из сильно разветвленных нитей - гиф, состоящих из клеточных стенок и цитоплазмы с включениями. Всю совокупность гиф грибного таллома называют мицелием или грибницей. Широкая сеть гиф обеспечивает многим грибам большую площадь всасывания питательных веществ. Грибы, образующие гифы или псевдогифы, называются филаментообразующими. Грибы с талломом, представленном гифами, называются плесневыми ли мицелиальными [20]. Другим вариантом роста является почкование, когда происходит отделение дочерней клетки от материнской, так что дрожжевой вариант таллома является одноклеточным. Грибы, существующие преимущественно в виде почкующихся клеток, называются дрожжами, их тип роста также называется дрожжевым. Те грибы, которые могут менять тип таллома, переходя из дрожжевой фазы в плесневую или обратно, называются диморфными (например, Candida albicans).
Candida albicans представляет один из самых значимых в клинической практике возбудителей микозов человека. Колонии С. albicans включают как почкующиеся клетки, так и настоящие гифы. Многие разновидности Candida spp. образуют псевдогифы, которые внешне напоминают настоящие гифы, но ими не являются. По этим причинам для описания изменчивой морфологии Candida spp. больше подходит термин «полиморфизм». Основной культуральной фазой существования С. albicans является дрожжевая форма клеток. Конидии в дрожжевой фазе, или бластоконидии, - это дочерние клетки, образующиеся при почковании. Клетки дрожжевой фазы круглые или овальной формы. При почковании клеточная стенка выпячивается на одном из полюсов клетки, возникает проростковая пора. Через пору выходит часть цитоплазмы с органеллами, при этом увеличивается размер будущей дочерней клетки, немногим не достигая размера материнской. К перешейку между материнской и формируемой клетками перемещается ядро. После деления ядра новая клетка уже сформирована, начинается построение двойной клеточной перегородки. Отпочковавшиеся новые клетки иногда не отделяются от материнских, а вытягиваются в цепочку и удлиняются, напоминая мицелий плесневых грибов. Такие цепочки называют псевдогифами, а их совокупность - псевдомицелием. Каждая клетка псевдогифы соединена со своей материнской клеткой на одном полюсе и дочерней клеткой - на другом. Поскольку почкование и формирование перегородки происходит в области перешейка, все псевдогифы имеют сужение в области перегородок [21]. Это их главное видимое под простым микроскопом отличие от истинных гиф (рис. 3).
Самая впечатляющая картина полиморфизма - образование у дрожжевых грибов Candida настоящего мицелия, неотличимого от мицелия плесневых грибов. Настоящие гифы развиваются у большинства штаммов С. albicans и у некоторых штаммов С. tropicalis. Предшественниками настоящих гиф являются проростковые, или зародышевые (герминативные) трубки. Они развиваются из бластоконидии, подобно другим проросткам гиф, развивающимся из спор. Клетки гиф отличаются от дрожжевых клеток продолговатой формой и меньшей толщиной клеточной стенки. Настоящие гифы Candida spp. могут ветвиться так же, как гифы плесневых грибов. Возможно одновременное существование истинных гиф и бластоконидии. Последние образуются позади септ, а не в местах перемычек, как у псевдогиф. Помимо бластоконидии С. albicans образует округлые толстостенные клетки - хламидоконидии. Это органы переживания, обеспечивающие бесполое размножение в неблагоприятных условиях. Хламидоконидии окружены двух- или трехслойной стенкой, более толстой, чем стенка любых клеток дрожжевой или мицелиальной фазы. Хламидоконидии располагаются на концах или между клетками псевдогиф и истинных гиф [21].
Модели восприятия оксилипиновых сигналов
Некоторые липоксигеназы играют важную роль в грибковом патогенезе растений. Существуют данные об участии LOX в формировании ответа при грибковом поражении растения. Грибок риса вызывает индукцию экспрессии LOX-1 (ленолеат-13-LOX) в ответ на патогенное воздействие, тогда как рисовая LOX-2 с другими каталитическими свойствами и местоположением в хлоропластах не индуцируется. Патогенный грибок табака Phytophthora parasitica nicotianae также индуцирует экспрессию LOX в табачных листьях и локализованное отмирание клеток. Эксперименты с генетически модифицированными растениями табака, при использовании кДНК гена lox, показали усиление восприимчивости к грибам P. parasitica и Rhizoctonia solani. Генноинженерное сокращение экспрессии 13-LOX в картофеле сделало растение более уязвивым для насекомых-вредителей [84].
Интересно, что первичная структура новой LOX, выделенной из картофеля похожа на стуктуру индуцибельной LOX табака и может быть индуцирована в листьях картофеля грибом P. infestans. В клетках картофеля грибок P. infestans стимулирует экспрессию ленолеат-9-LOX, которая играет важную роль в механизмах защиты против патогенных грибов. Другая важная биологическая функция LOX - катализирование клеточного распада при повреждении биомембран. Так очищенный микотоксин гриба P.cryptogea -криптогеин - вызывает индукцию 9-LOX в листьях табака и отмирание клеток, сопровождаемое перекисным окислением липидов. Ингибирование активности LOX понижало токсический эффект криптогеина [85].
Грибные инфекции в свою очередь индуцируют экспрессию генов растительных липоксигеназ. Инфекционные штаммы гриба Aspergillus, поражающие семена арахиса, вызывают сопутствующее подавление фермента 13-LOX и, одновременно, индукцию 9-LOX, что приводит к повышению общего уровня продукции AF/ST-стимулирующих оксилипинов (9S) и к понижению уровня AF/ST-подавляющих оксилипинов (13S) [86]. В семенах кукурузы инфекции Aspergillus и Fusarium индуцируют экспрессию гена cssap92 (кодирующего 9-LOX) в линиях кукурузы, восприимчивой к AF-стимулированному заражению, но подавляют экспрессию этого же гена cssap92 в линиях, резистентных к продукции AF [87]. Дальнейшие исследования подтвердили тот факт, что специфические гены, связанные с экспрессией 9-LOX, ответственны за восприимчивость, а гены, связанные с экспрессией 13-LOX, - за резистентность к микотоксин-стимулированному заражению хранящегося зерна.
Создание мутантов A. nidulans, которые контролируют экспрессию кукурузного гена, кодирующего 9-LOX, посредством постоянно экспрессируемого промотора гена глицероальдегид-3-фосфата (gpdA), приводило к повышению образования конидий и продукции ST (аналогично действию метаболита 9(5}-HPODE in vitro), позволяя предположить, что ген cssap92 (ZmLOXS: 9-LOX) может частично замещать природные Рро диоксигеназы в A. nidulans. Дополнительные эксперименты показали, что уровень экспрессии гена PnLOX2-3, кодирующего 13-LOX в семенах арахиса, понижался при инфицировании семян Арро мутантами A. nidulans по сравнению с вариантом инфицирования семян штаммом грибов этого вида дикого типа. Эти результаты представляют генетическое доказательство влияния грибных оксилипинов на изменения уровня экспрессии генов растительных LOX, потенциально приводящих к изменениям во взаимодействии хозяин-патоген. Все вышеизложенные данные подтверждают гипотезу о том, что оксилипин-зависимая передача сигналов в патосистемах «стєпаїAspergillus» является системой обратной связи [88]. Другой важный класс оксилипинов для взаимодействий «CQMena/Aspergillus» включает летучие соединения состава Сб, такие как альдегиды, спирты и их эфиры [88] (рис. 5). Эти соединения, образующиеся по ферментативному пути гидропероксидлиазы, также важны как для передачи сигналов внутри и между растениями, так и для обеспечения взаимоузнавания и конкуренции патогенных микроорганизмов растений [89].
Способ ферментативного получения 3(Я),15(5)-дигидрокси- (5Z,8Z,112,13)-эйкозатетраеновой кислоты (15а)
Замещение хлора на цианогруппу давало цианид 4, омыление и последующее метилирование которого приводило к соединению 5. В соответствии с разработанной нами стратегией получение полиацетиленовых предшественников 3(7?)-гидроксикислот 7 и 12 проводили с использованием кросс-сочетания оптически активного гидроксилсодержащего ацетиленового соединения - метил-3(7?)-гидрокси-5-гексиноата (5) и пропаргильных бромидов: 1-бром-тетрадека-2,5,8-триина (6) [109] или 1-бром-2-октина (И) [113] с последующим гидрированием на катализаторе Линдлара и омылением метиловых эфиров 8 и 13. Синтезированные полиеновые соединения 8 и 13 были дополнительно очищены при помощи препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе. Метоксильный аналог 3(І?)-НЕТЕ (96) был получен действием йодистого метила на полиен 8 в присутствии гидрида натрия с последующим щелочным омылением. Кратномеченыый тритием аналог 3(І?)-НЕТЕ - [5,6,8,9,11,12,14,15-3Н]-3(і?)-гидрокси-(5Z,8Z,llZ,14Z)-3fiK03aTeTpaeHOBafl кислота (10) - со специфической молярной радиоактивностью 1.65 Ки/ммоль была получена при использовании в процессе гидрирования полиинового предшественника 7 газовой смеси тритий/водород, содержащей 1% трития , с последующим омылением (схема 2А) [114]. В ходе синтеза не наблюдалось рацемизации по С-3 положению, что было подтверждено анализом продуктов 9а, 96, 14 при помощи ВЭЖХ на хиральной фазе. С целью оптимизации условий проведения ключевых реакций предварительно нами был получен рацемат 3 (ЛЬНЕТЕ (9с) на основе гас-эпихлоргидрина.
Для получения дигидроксипроизводных жирных кислот нами был разработан метод ферментативного синтеза 3,15-DiHETE (15а) с применением индивидуального препарата соевой 15-LOX-1 и 3(J?)-HETE (9а) в качестве субстрата (схема 3). Концентрация субстрата (9а) была увеличена в 1.5 раза, а концентрация фермента - в 2 раза по сравнению с проводимыми ранее экспериментами по липоксигеназному окислению арахидоновой кислоты [115], так как 3-гидроксиарахидоновая кислота является худшим субстратом для липоксигеназы. Продукт ферментативной реакции 15а был выделен после очистки с применением ВЭЖХ на обращенной фазе с выходом 34% (образование сопряженного диена фиксировали при X 234 нм). Для дополнительного подтверждения энантиомерной чистоты 3,15-DiHETE был получен метиловый эфир (156), подобраны условия проведения анализа этого соединения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе, в качестве полярного компонента подвижной фазы были исследованы изопропанол, метанол, этанол в концентрациях от 1.5% до 15%. Оптимальным было разделение изомеров при элюировании раствором гексан/этанол (10% об. этанола), которое давало одиночный пик (Rt =31.36 мин) с оптической чистотой более 96%. Структура соединения была подтверждена GC-MS анализом TMS-производного продукта 156, согласно которому были идентифицированы ионные фрагменты (m/z): 175 [+CH(OTMS)CH2COOCH3], 173 [+CH(OTMS)(CH2)4CH3], а также молекулярный ион с m/z 479[М+-15] [116].
Были разработаны новые универсальные подходы к химическому синтезу 18-гидрокси-(52,8г,112,142)-эйкозатетраеновой кислоты (18-НЕТЕ, 26) (схема 4), 3(іг),18(іг/5)-дигидрокси-(5г,82,1іг,142)-зйкозатетраеновой кислоты (3,18-DiHETE, 29) и ее кратно меченного тритием аналога 31 (схема 5) с использованием ацетиленовой стратегии. Получение рацематов 26 и 29 является приемлемым, так как разделение оптических изомеров возможно с помощью ВЭЖХ на хиральной фазе. В качестве исходного компонента при синтезе 18-НЕТЕ был выбран гас-1-хлор-З-пентанол (16), который превращали в иодид 17 по стандартной методике. Алкилирование этинилтриметилсилана 2 с использованием иодида 17 и BuLi в THF/HMPA приводило к образованию триметилсилильного производного гептинола 18 [117]. Кросс-сочетание бифункционального пропаргильного фрагмента 20 [118] с бензоилированным производным 19 давало метиленразделенный трииновый спирт 21 с выходом 74%. Замена ОН-группы в соединении 21 на Вг [109] и кросс-сочетание бромида 22 с терминальным ацетиленовым производным 23 позволили получить тетраацетиленовый предшественник 24, последующее гидрирование которого на катализаторе Линдлара, а затем одновременное удаление бензоильной и метильной защитных групп в условиях щелочного гидролиза привели к 18(/?/5}-гидроксиэйкозатетраеновой кислоте 26 (схема 4).
Исследование ферментативной трансформации 3-гидроксиэйкоза- тетраеновой кислоты (9с) и ее аналогов с использованием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих
С целью выяснения возможности участия 3-гидроксикислот в ферментативном каскаде окисления липидов млекопитающих были проведены исследования по окислению 3(i?,S)-HETE (9с) и ее метилового эфира очищенными ферментными препаратами липоксигеназ млекопитающих. Были использованы липоксигеназа лейкоцитов свиньи (/(12S)-LOX) и эпидермальная липоксигеназа ((12i?)-LOX), полученная генноинженерным методом. Продукты окисления были выделены с помощью экстракции [123] и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе. Наличие 3-гидроксигруппы было установлено с применением хромато-масс-спектрометрии. Было обнаружено образование конъюгированного диена, 3,12-DiHETE (41) (рис. 4). Анализ дигидроксикислот с применением ВЭЖХ на хиральной фазе не показал предпочтительного окисления R- или iS-энантиомера по С-3 положению жирной кислоты какой-либо из липоксигеназ (рис. 5).
Также были проведены исследования по взаимодействию 3(Я)-метокси-ЕТЕ (96) с овечьей циклооксигеназой СОХ-2. Продукты окисления были выделены при помощи известного метода [124] и затем разделены с применением ВЭЖХ на обращенной фазе. Структура полученных продуктов установлена с использованием GC-MS анализа метиловых эфиров их TMS-производных. Соединения были идентифицированы как простагландин 3(/?)-метокси-РОЕ2 (42) и 3(і?)-метокси-11(5)-гидроксизйкозатетраеновая кислота (43).
Проведенные исследования показали, что 3-гидроксиполиеновые кислоты и их аналоги могут служить субстратами для ферментов окисления липидов млекопитающих -липоксигеназ и циклооксигеназ. При окислении 3-гидроксипроизводных жирных кислот образуются метаболиты, аналогичные оксигенированной АК, за исключением наличия 3-гидроксигруппы, что, вероятно, делает их узнаваемыми для клеток грибов
Клетки на репродуктивной стадии развития инкубировали с субстратом 3(R,S)-НЕТЕ, после чего определяли степень превращения R- и 5-энантиомеров. Остаток 3(R,S)-НЕТЕ был выделен из супернатанта при помощи стандартных процедур [125] с применением ВЭЖХ на обращенной фазе, и энантиомерный состав проанализирован с использованием ВЭЖХ на хиральной фазе. Результаты ВЭЖХ показали (рис.8), что преимущественному метаболизму в дрожжах Dipodascopsis uninucleata подвергается изомер 3(Д)-НЕТЕ, в то время как 3(5)-НЕТЕ практически не расходуется.
Следующим этапом работы явилось изучение продуктов окисления АК и ее производных - 3(І?,5)-НЕТЕ (9с), 18(І?,5)-НЕТЕ (26) - в клетках Dipodascopsis uninucleata или Candida albicans 1386 (бронхоизолят), которые были инкубированы с жирнокислотными субстратами. Ранее 3,18-DiHETE была обнаружена на стадии развития гиф в дрожжах Candida albicans как продукт трансформации экзогенной АК [122] (рис. 9).
Нами были проведены исследования на предмет обнаружения данного метаболита в разных типах дрожжей при добавлении 3(R/S)-HETE в питательную среду. Продукты метаболизма дрожжей были выделены из клеточного лизата или супернатанта при помощи модифицированного (применением этилацетата в качестве растворителя для экстракции) метода [125] с последующей фильтрацией на картридже Sep-Pack Cjg [126] и препаративной тонкослойной хроматографией гидроксилированных жирнокислотных компонентов на силикагеле [127] (рис. 10).
TMS-производные метиловых эфиров продуктов окисления были проанализированы с применением GC-MS на наличие 3-гидроксиэйкозаноидов. Результаты анализа ионных фрагментов позволили идентифицировать 3,18-DiHETE, 3,18,20riHETE (45) (полученные в результате трансформации АК, 3-НЕТЕ и 3,18-DiHETE) как в дрожжах Candida albicans (А), так и в Dipodascopsis uninucleata (В). Причем продукт (45) был характерен только для Candida albicans (А), инкубированной с субстратом 18(/?,5)-НЕТЕ (26) (рис. 11). На наличие 3-гидроксиметаболитов были тестированы как клеточный лизат, так и супернатант; 3-оксилипины были обнаружены в каждой фракции. Важным представляется тот факт, что Di- и Tri-HETE экскретируются в межклеточное пространство и, по-видимому, участвуют в передаче клеточных сигналов.
При сравнении масс-спектров 3,18-DiHETE, полученной микробиологическим синтезом, со спектром химически синтезированного стандарта 3,18-DiHETE (29) установлена их полная идентичность [114]. В результате проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что (со-З)-гидроксилирование полиненасыщенных кислот является общим процессом для указанных типов дрожжей.
Похожие диссертации на Синтез и изучение свойств оксилипинов грибной и растительной природы
