Содержание к диссертации
Введение
1. Использованные сокращения 4
2. Введение 5
3. Литературный обзор 7
3.1. Общие подходы к разработке фотосенсибилизаторов для ФДТ рака 10
3.2. Новые ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов 11
3.3. Синтез устойчивых производных хлоринов и бактериохлоринов 16
3.3.1. Циклические имиды, содержащие при атоме азота связь N-C 17
3.3.2. N-Гидроксищшюимиды и их производные 26
3.4. Коньюгаты циклических имидов хлоринового ряда с сахарами 27
3.5. Катионные ФС хлоринового типа и их биологическая активность 29
3.5.1. Синтез катионных ФС 30
3.5.2. Антимикробная фотодинамическая активность катионных ФС 33
3.6. Заключение 36
4. Результаты работы и их обсуждение 37
4.1. Получение бактериопурпурина 38
4.2. Синтез N-гидроксициклоимидов в ряду бактериохлорофилла а 40
4.2.1. Изучение реакции бактериопурпурина с гидроксиламином 40
4.2.2. Химические превращения N-гидроксициклоимида бактериохлорина^б 43
4.3. Синтез производных бактериохлорофилла а с дополнительным N-аминоимидным циклом 46
4.3.1. Изучение реакции бактериопурпурина с гидразином 46
4.3.2. Гидразиды бактериохлорина/?б 48
4.4. Катионные ФС бактериохлоринового ряда 53
4.4.1. Синтез катионного ФС 53
4.4.2. Изучение антимикробной и антифунгицидной фотодинамической активности 54
4.5. Изучение распределения в клетке и биологической активности N-гидрокси- и N-аминоциклоимидов 58
5. Экспериментальная часть 61
Выводы 72
- Новые ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов
- Катионные ФС хлоринового типа и их биологическая активность
- Синтез производных бактериохлорофилла а с дополнительным N-аминоимидным циклом
- Изучение распределения в клетке и биологической активности N-гидрокси- и N-аминоциклоимидов
Введение к работе
Одним из перспективных и быстро развивающихся методов диагностики и лечения злокачественных новообразований является фотодинамическая терапия рака. Метод фотодинамической терапии рака основан на введении в организм фотосенсибилизаторов, локализующихся преимущественно в опухоли, которые при световом возбуждении продуцируют цитотоксичные вещества, вызывающие гибель злокачественных клеток.
Синтез фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака - это актуальное и быстро развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений. Поиск новых фотосенсибилизаторов ведется как среди синтетических соединений порфириновой природы, так и среди природных пигментов. Последние привлекают особое внимание, так как значительно быстрее выводятся из организма и подвергаются биодеградации, что существенно снижает побочные эффекты фотодинамической терапии. К настоящему времени большинство модификаций выполнено на производных хлорофилла а. Существенно медленнее развиваются исследования в области бактериохлорофилла а. Однако, спектральные свойства именно этого пигмента позволяют рассматривать его в качестве одного из перспективных источников для создания фотосенсибилизаторов нового поколения. Следует отметить, что лабильность соединений бактернохлоринового ряда ограничивает возможности использования последних в медицине.
Настоящая работа направлена на разработку путей создания новых высокоэффективных фотосенсибилизаторов бактернохлоринового ряда, обладающих высокой стабильностью, поглощающих в ближней ИК-области спектра с улучшенными фотофизическими свойствами.
Новые ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов
Как известно, хлорофиллы выполняют функцию переноса электронов в растительных организмах и у бактерий. Их производные обладают оптимальными свойствами для использования в качестве фотодинамических агентов - интенсивно поглощают в длинноволновой области спектра (650 - 700 нм) и характеризуются низкой темновой токсичностью [57-59]. В настоящее время производные хлорина ев находятся на различных стадиях клинических испытаний [60-63]. Так, водорастворимый N - аспартилхлорин е$ (препараты NPe6, MACE), поглощающий при 664 нм с молярным коэффициентом поглощения около 25000, является одним из первых ФС, предложенных как альтернатива Фотофрину - 2 [36-38]. Близким химическим аналогом хлорина ее является хлорин ре, который также оценивается как перспективный агент для ФДТ [64-66]. Производные бензопорфирина с максимумом поглощения при 690 нм (є = 33000) являются синтетическими аналогами хлорина. Эти соединения нерастворимы в воде и используются в виде липосомальных композиций или масляных эмульсий. Завершаются клинические испытания одного из этих соединений BPD-MA (бензопорфирин монокислота, кольцо А). Достаточно эффективными фотосенсибилизаторами с низкой кожной токсичностью показали себя феофорбиды - производные хлорофилла, не содержащие металла и остатка фитола в положении 17 макроцикла. Другим не менее перспективным классом ФС природного происхождения ЯВЛЯЮТСЯ производные бактериохлорофилла а, для которых характерно дальнейшее смещение длинноволновой полосы поглощения в красную область. Природные бактериохлорины имеют интенсивную полосу поглощения в области 770 нм и обладают высокой фотодинамической активностью. Известно использование в качестве потенциальных ФС Pd-комплексов бактериофеофорбида и бактериохлорина, а также их эфиров [71-76]. Эти производные бактериохлорофилла а показали высокую активность как в экспериментах in vivo для диагностики и терапии злокачественных опухолей, так и in vitro для фотодинамического повреждения вирусов и микроорганизмов. Проблемой здесь является поиск устойчивых при хранении производных бактериохлорина ре, поскольку при гидрировании порфиринового кольца одновременно со спектральным смещением уменьшается стабильность молекулы в реакциях окисления. Хлорины и бактериохлорины имеют четыре основных типа спектров, представленных на рисунке 2. При переходе к бактериохлоринам полоса Q в спектрах поглощения смещается в длинноволновую область, что способствует увеличению глубины проникновения возбуждающего света в ткани [77-80].
Таким образом, при разработке путей синтеза новых ФС хлоринового и бактериохлоринового рядов, как правило, решаются две основные задачи, включающие создание более стабильных производных с улучшенными фотофизическими и спектральными свойствами и повышение общей гидрофильное ФС, что улучшает их растворимость в водных растворах и способствует накоплению в опухоли. 3.3, Синтез устойчивых производных хлоринов и бактериохлоринов Включение в хлориновый макроцикл ангидридного цикла приводит к повышению устойчивости соединения, а также к улучшению спектральных характеристик (Хта . = 700 им и 818 нм для пурпурина 18 и бактерио пурпурина, соответственно) (рис. 3), однако в щелочных средах ангидридный цикл способен раскрываться с образованием хлорина ре или бактериохлоринарб. Описанный в литературе способ стабилизации ангидридного цикла включает замену атома кислорода на атом азота, приводящую к получению стабильных циклон мидов как в хлориновом, так и в бактериохлориновом рядах [81-83]. Подобная модификация включает взаимодействие пурпурина 18 и бактерио пурпурина с различными аминами и последующую внутримолекулярную циклизацию образующихся моноамидов [84-86]. В качестве аминокомпоненты используются алкиламины, диамины, амино спирты, аминокислоты и т.д. При этом была получена группа азапурпуринов (2 - 6) с различными активными спейсерными группами (схема 1). В группе К. Смита вышеописанным способом был синтезирован ряд циклоимидов хлорина/ с алкильными заместителями различной длины при атоме азота экзоцикла и проведено систематическое изучение влияния длины цепи на распределение данных соединений в биоматериале [87, 88].
При взаимодействии метилового эфира пурпурина 18 (1) с бутиламином происходит раскрытие ангидридного цикла с получением смеси соответствующих моноамидов хлорина ре [85]. Аналогично, метиловый эфир пурпурина 18 (1) взаимодействует с гексилам ином (схема 2), эфирами аспарагиновой кислоты, орнитином. Для синтеза соответствующих циклоимидов хлорина ре и бактериохлорина/? 5 предложено два подхода [86]. В первом смесь амидов 7, 8 обрабатывали дициклогексилкарбодиимидом (ДЦК) с образованием двух изоимидов 9,10 (Хта = 690 и 696 нм) в соотношении 6:1 с суммарным выходом 96 %. У одного из них азот гексиламина находится в положении 13і, у другого в положении 15 . Смесь изоимидов при действии диазабициклоундецена (ДБУ) в толуоле в щелочной среде при 60 С превращается в целевой пурпуринимид 13 с низким выходом. Замена ДБУ на более сильные основания, такие как КОН или NaOH в метаноле, приводит к повышению выхода до 85 %. Второй подход предполагает этерификацию промежуточных моноамидов 7, 8 диазометаном с последующей обработкой полученных эфиров 11, 12 раствором КОН в метаноле, приводящей к целевому пурпуринимиду 13 с выходом около 80% на стадии внутримолекулярной циклизации. Однако в ходе реакции образуется побочный продукт 12-формилпурпуринимид 14 с полосой Q в электронном спектре при 714 нм. Оптимизированные вышеописанным способом условия были затем применены к синтезу производных бактериохлорина рб (схема 3) [86]. Для циклизации смеси моноамидов 16, 17 использовали ДЦК и в результате получали циклические изоимиды 18, 19. Последние находились в смеси в соотношении 6:1 и были разделены методом препаративной хроматографии на индививидуальные изомеры с основными полосами поглощения 804 и 796 нм, соответственно. Катализируемая основанием внутримолекулярная перегруппировка изоимидов приводит к циклическому имиду 20 с полосой Q при 822 нм и выходом 45%. Подобные результаты были получены и с моноамидами 16, 17, карбоксильные группы которых были предварительно прометилированы, В отличие от природного бактериохлорофилла а, соответствующие изоимидные аналоги 18,19 и циклоимид 20 оказались исключительно стабильными [89-91]. В качестве другого нуклеофильного агента была использована аминокислота лизин [78]. При обработке метилового эфира пурпурина 18 (1) водным раствором последней получена смесь лизиламидов хлорина р6 21, 22 (схема 4), которые при длительном стоянии в растворе самопроизвольно циклизовались, превращаясь в циклоимид 23а с основной полосой поглощения при 706 нм. Дія ускорения внутримолекулярной циклизации смесь амидов обрабатывали диазометаном и далее выдерживали со смолой марки Montmorillonite К-10 [92]. В результате получали смесь изоимидов 24 и 25, которые в основных условиях быстро перегруппировывались в циклоимид 23а.
Катионные ФС хлоринового типа и их биологическая активность
Известно, что спектральные и фотофшические характеристики, а также терапевтический эффект ФС, используемых для ФТД рака, в основном определяется их физико-химическими свойствами, которые, в свою очередь, зависят от природы макроцикла, Напротив, селективность накопления в злокачественных опухолях в основном определяется природой боковых заместителей и их взаимным расположением. Исследования последних лет позволили выявить определенную корреляцию между структурой и электронным строением ФС, с одной стороны, и распределением в био матер нале и фармакокинетическими характеристиками, с другой стороны. Установлено, что количество электроотрицательных групп в молекуле определяет ее способность проникать в клетку и распределяться внутри нее. Так, два и более заместителя препятствуют поступлению ФС в клетку через внешнюю гидрофобную мембрану. Такие ФС могут проникнуть в клетку лишь посредством механизма захвата внешних объектов, получившего название эндоцитоз. Полярный характер этих веществ препятствует также их диффузии в цитоплазме клетки и дальнейшей миграции в митохондрии. Напротив, катионные ФС повреждают лизосомы, сосудистую сеть, питающую опухоль кровью, и что наиболее важно - митохондрии. Причем одним из важных конечных пунктов их внутриклеточной локализации является клеточное ядро. 3.5.1. Синтез катионных ФС Обычно катионные группировки вводятся в молекулу ФС путем реакции кватернизации атома азота в различных азотсодержащих заместителях, таких как, амино, диметиламино группы, остатки пиридина. В качестве алкилирующего агента, как правило, используют метилиодид [ПО]. Группой К. Смита был синтезирован катионный ФС [111], представляющий 5,15- ди (4-пиридил)октаалкил пурпурин (59), по методу Понтера и Робинсона [112, 113], включающему конденсацию дипирролилметана (56) и 4-формшширидина (57) с образованием порфирина 5S, формилирование последнего по Вильсмайеру смесью хлорокиси фосфора и ДМФА и циклизацию акрилатного заместителя в положении 20 макроцикла с образованием хлорина 59 (схема 9). Кватернизация остатков пиридина в 5 и 15 положениях макроцикла проводилась метилиодидом на Zn-комплексе хлорина для защиты центральных атомов азота. Последующее деметаллирование трифторуксусной кислотой привело к образованию пурпурина 60 с 90% выходом. Разработка эффективных способов борьбы с микробными заражениями является одной из важнейших задач биомедицины.
Особенно остро этот вопрос стоит в последнее время в связи с возрастающей устойчивостью патогенов к химиотерапии. В 90-е годы после значительного перерыва активизировались исследования в области фотосенсибилизации микроорганизмов [116]. Метод, основанный на инактивации вирусов, бактерий, дрожжевых грибов и простейших активными формами кислорода, которые генерируются фотосенсибилизаторами в фотовозбужденном состоянии, получил название фотодинамической антимикробной хемотерапии [117]. Большое значение имеет то обстоятельство, что, в отличие от химиотерапии, множественный характер потенциальных мишеней окислительной деструкции (в первую очередь, структурные белки, ферментные системы, ненасыщенные жирнокислотные остатки липидов) при фотохимиотерапии препятствует развитию клеточной устойчивости. Фотодинамическая антимикробная химиотерапия может использоваться при лечении: раневых и ожоговых инфекций, воспалительных процессов в дерматологии (акне, паронихии и др.) и стоматологии, кандидозов кожи и слизистых, инфекций половых органов. Вместе с тем, анализ имеющихся литературных данных свидетельствует о том, что метод фотодинамической антимикробной хемотерапии значительно отстает по уровню фундаментальной разработки и практического внедрения не только от химиотерапии, но и противоопухолевой фотодинамической терапии. В рамках этого направления наиболее широко исследована антивирусная активность красителей, что нашло практическое применение при стерилизации препаратов плазмы крови. Антибактериальная активность фотосенсибилизаторов изучена в меньшей степени [117-118] и показана in vitro в отношении азиновых красителей (фенотиазины, акридины) и некоторых макроцикл ических фото сенсибилизаторов (порфирины, фталоцианины), имеются отдельные данные о фотосенсибилизации непатогенных дрожжей в присутствии порфиринов и фталоцианинов и патогенных дрожжевых грибов Candida albicans в присутствии фенотиазинов и гематопорфирина [118].
Из перечисленных выше патогенов наиболее устойчивыми к фотодинамическим воздействиям являются грамотрицательные бактерии [116], что связывают с низкой проницаемостью их внешней плазматической мембраны для ФС. Относительная фототоксичность ФС хорошо согласуется с их физико-химическими свойствами, определяющими эффективность связывания с клетками-мишенями. Как известно, внешняя поверхность бактериальных клеток несет отрицательный заряд, в связи с чем наиболее эффективного связывания с бактериальными клетками и, следовательно, фотодинамического действия, следует ожидать для катионных ФС [117]. Обзор литературы последних лет показывает, что исследования в области создания новых ФС наиболее активно проводятся в ряду хлорофилла а. Существенно меньше работ посвящено производным бактериохлорофилла а. Тем не менее, представители именно этого класса благодаря своим спектральным и фотофизическим характеристикам могут занять достойное место среди новых ФС для ФДТ. Данная диссертационная работа посвящена исследованиям в ряду бактериохлорофилла а, а разработанные в ней методы функционализации бактериохлоринового макроцикла открывают новые возможности создания высокоэффективных ФС третьего поколения. В последние годы наблюдается повышенный интерес к производным природных хлорофиллов, содержащим дополнительный шестичленний имидньш экзоцикл [95-96, 99, 104]. Отличительными особенностями этих соединений являются повышенная стабильность и улучшенные спектральные и фотофизические свойства, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака и иных заболеваний. Известны два метода получения подобных циклоимидов. В обоих случаях в качестве исходных соединений используются ди- и тетрагидропорфирины с дополнительным ангидридным циклом, такие как пурпурин 18 и бактериопурпурин. В первом случае [86] замена атома кислорода на азот осуществляется действием аминов с последующей циклизацией образующихся моноамидов под действием различных реагентов в соответствующие циклоимиды. Во втором методе [104], разработанном на кафедре ХТТОС, используется гидроксиламин, в результате чего циклоимиды образуются в одну стадию с высокими выходами. Целью настоящей работы являлась разработка способов модификации ангидридного цикла бактериопурпурина и синтез производных, содержащих
Синтез производных бактериохлорофилла а с дополнительным N-аминоимидным циклом
В рамках исследования взаимодействия БП с нуклеофильными агентами нами была изучена реакция БП с пщразином. Гидразин и его производные обнаруживают чрезвычайно высокую нуклеофильную активность по отношению к углеродным атомам с //-гибридизацией. В связи с этим ангидриды кислот являются удобными реагентами для ацилирования гидразина. При добавлении к раствору бактериопурпурина (1) в пиридине гидразингидрата практически моментально происходит гипсохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения в область 750 нм, что соответствует раскрытию ангидридного цикла и образованию смеси изомерных моногидразидов 7а и 7Ь (схема 4), Спектрофотометрический контроль за ходом реакции показал, что с течением времени появляется новая полоса поглощения при 834 нм, свидетельствующая о самопроизвольной циклизации моногидразидов (рис. 6). Добавление в реакционную среду соляной кислоты приводит к быстрому образованию экзо цикла. Конечный продукт 10 представлял собой не ожидаемый гидразон, а содержал свободную ацетильную группу в положении 3 макроцикла. Предположение о возможном образовании гидразона в ходе реакции и последующем его гидролизе в кислой среде было подтверждено реакцией бактериохлорина рб 8 с гидразином (схема 4). Продукт 9 выделяли, не используя кислот. Масс-спектр последнего, в котором присутствует молекулярный ион с m/z 614.4, подтвердил образование гидразона, последующий кислотный гидролиз которого привел к исходному бактериохлоринурб- Особенностью реакции гидразина с ангидридами дикарбоновых кислот является возможность увеличения размера исходного цикла с образованием 1,2-дизамещенных гидразидов. Известно, что при взаимодействии ангидридов ненасыщенных или ароматических дикарбоновых кислот, таких как малеиновая или фталевая, с гидразином происходит трансформация пятичленного ангидридного цикла в шестичленный циклический гидразид (схема 5). В случае бактериопурпурина это могло приводить к образованию гидразида с шести-или семичленным экзоциклом (рис, 7), Определение размера цикла в циклоимиде 10 проводилось с помощью химических модификаций последнего, а также с привлечением спектроскопии ЯМР.
Спектр Н ЯМР соединения 10 в CDCb оказался неинформативен из-за отсутствия в нем сигналов протонов при атомах азота экзоцикла. Введение в экзоцикл двух дополнительных метальных групп путем обработки соединения 10 метилиодидом с образованием диметильного производного 11 (схема 6) привело к появлению в спектре Н ЯМР двух близко расположенных синглетов при 3.37 и 3.3б м.д. и позволило привлечь метод двумерной гетероядернои корреляции (НМВС) для выяснения вопроса о размере экзоцикла (рис. 8) . В спектре НМВС отсутствуют кросс-пики протонов метальных групп при атоме азота с карбонильными атомами углерода, что свидетельствует о наличии между ними не менее четырех связей (C13J-N132-N133-C134-H13S) и подтверждает шестичленную структуру экзоцикла (рис. 9). В случае семичленного цикла таких связей было бы три (С131—N132-C133-H134) и наблюдалось бы ]3С - Н взаимодействие. Подтверждением этому являются данные спектра Н ЯМ?, снятого при нагревании образца до 50 С, в результате чего происходит слияние двух сигналов СНз-групп при атоме азота в один синглет интенсивностью в б протонов, что подтверждает наличие в молекуле Ы,1М-диметиламиногруппы (рис, 10). Химический подход к доказательству структуры циклоимида 10 включал его взаимодействие с 4-диметиламинобензальдегидом (схема 6). В спектре Н ЯМР полученного соединения 12 имеется добавочный сигнал атома водорода, находящийся в слабом поле рядом с сигналом 20-Н мезо-протона (8.64 и 8.61м.д.), Для их отнесения использовали спектроскопию Ш NOE, облучая протоны в орто-положениях фенил ыюго кольца. В результате наблюдалось изменение интенсивности сигнала протона при ІЗ4углеродном атоме (8,64м.д.) (рис. 11). Обработка последнего триацетоксиборгидридом натрия (для сохранения ацетильной группы в макроцикле) не привела к восстановлению связи C=N, и с течением времени он разрушался с образованием исходного циклоимида 10. Более удачный вариант модификации циклоимида 10 имел место при обработке последнего тозилхлоридом (схема 6). Сульфамид 13 был получен с высоким выходом и являлся стабильным соединением, которое в дальнейшем может быть использовано для модификации молекулы пигмента.
Для N-гидрокси- и N-аминоциклоимидов и их производных характерно батохромное смещение основной полосы поглощения в район 830-836 нм, что превосходит аналогичные характеристики для бактериопурпурина на 12-17 нм, при сохранении высоких значений коэффициента молярной экстинкции (є = 30000). Данные соединения были наработаны в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний. Так, для тестирования фотоцитотоксичности в Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена были переданы три партии по 20 мг гидразида 11 для экспериментов in vivo, а так же другие циклоимиды в количествах, требуемых для экспериментов in vitro. Для усиления гидрофильных свойств N-аминоциклоимида 10 была проведена модификациия его аминогруппы. С этой целью циклоимид 10 обрабатывали хлорангидридом изоникотиновой кислоты в пиридине (схема 7). Хроматографическая подвижность полученного соединения оказалась значительно ниже по сравнению с исходным амидом 10, а молекулярная масса (М4" 716) соответствовала молекуле последнего с присоединенной молекулой изоникотиновой В спектре Н ЯМР соединения 14 наблюдалось удвоение сигналов всех протонов (рис. 12), которое исчезало при съемке спектра в условиях нагревания образца до 50С. Вышеописанное явление, по-видимому, можно объяснить присутствием двух изомеров, которые возникают из-за сопряжения неподеденной электронной пары азота и к- электронов карбонильной группы, приводящего к затрудненному вращению вокруг связи C(0)-N. Кватернизация циклоимида 14 осуществлялась путем обработки последнего метилиодидом. Полученное соединение 15 обладало чрезвычайно низкой хроматограф ической подвижностью, что указывало на появление заряда в молекуле. Молекулярный ион (М+730) полученного соединения показал появление дополнительной метальной группы, а синглет интенсивностью в три протона при 3.68 м.д. в спектре ]Н ЯМР, появившийся после обработки циклоимида 14 метилиодидом, окончательно подтвердил структуру четвертичной пиридиниевой соли.
Изучение распределения в клетке и биологической активности N-гидрокси- и N-аминоциклоимидов
Для анализа накопления, распределения и взаимодействий синтезированных соединений в клетках был использован метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции двух- и трехмерных спектральных изображений (КОМИРСИ) . Исследования выполнены в ИБХим. КІМ. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, под руководством С.Н.С. А.В. Феофанова. Было показано, что Кремофор, используемый для повышения растворимости ФС в водных растворах, влияет на дезагрегацию молекул пигмента и стабилизацию мономерной формы, за счет чего удается обеспечить высокое проникновение циклоимидов 6Ь, 10 и 11 в клетки аденокарциномы легкого человека А549, эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека НЕр2, рака шейки матки человека HeLa и в клетки эритроидной лейкемии человека К562. Для исследуемых соединений 6Ь, 10 и 11 характерно гранулярное распределение в клетках с преимущественным накоплением в липидных каплях, клеточных органеллах, ответственных за хранение и метаболизм нейтральных липидов (рис. 18). При облучении светом мембранно-связанные производные 6Ь и 11 характеризуются достаточно высокими квантовыми выходами генерации сингл етного кислорода (0.53 и 0.47, соответственно), что выше аналогичного параметра для бактериохлорина (0.33). Электронные спектры получены на спектрофотометре Jasco - UV 7800 в хлороформе. Спектры Н ЯМР сняты в CDCh на спектрометрах Bruker WM 250, Bruker AM 300 с использованием программы DisNMR94 под управлением Adakos и Bruker DRX 500 с использованием программы xWinNHR под управлением Irix 5.3. Эксперименты NOE выполнены в варианте NOEFAST, время облучения 1.5 с. Масс-спектры получены на время-пролетном масс-спектрометре VISION 2000 методом MALDI с использованием в качестве матрицы дигидроксибензола (DHB). Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) регистрировали на масс-спектрометре Micromass Autospec (электронный удар, энергия ионизации - 70 eV, 200С). РЖ-спектры получены на FT-спектрометре Nicolet Magna-750 в КВг с разрешением 2 см _і. Для колоночной хроматографии применяли силикагель L 40/100 (Chemapol). Для препаративной ТСХ использовали силикагель 60 » (Merck) на пластинах 20x20 с толщиной слоя 1 мм. Аналитическую ТСХ проводили на пластинах Kieselgel 60 F24J (Merck). Бактериопурпурин (1) 100 грамм биомассы Rhodobacter capmlatus заливали 500 мл изопропанола и проводили экстракцию при перемешивании в течение 12 часов. Экстракт отфильтровывали, промывая шрот на фильтре изопропанолом.
О полноте экстракции судили по цвету маточного раствора. В полученный экстракт добавляли 100 мл 50% раствора гидроксида калия и барбатировали воздух 1 час, после чего добавляли концентрированную соляную кислоту до рН 5 и выдерживали 30 мин. Бактериопурпурин экстрагировали хлороформом (3x100 мл), экстракт промывали водой (2x250 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. Раствор бактериопурпурина упаривали на роторном испарителе до 20 мл и заливали 200 мл петролейного эфира. Выпавший осадок отфильтровывали и получали 80 мг бактериопурпурина. Электронный спектр, Хтах, нм: (относительные интенсивности): 363, 412 (Соре), 546 и 818 (1:0.75: 0.4:0.8). Rf = 0.48 система ацетон-хлороформ (4:1). Н ЛМР (5, м.д.): 9.19 (Н, с, 10-Н), 8.79 (Н, с, 5-Н), 8.60 (Н, с, 20-Н), 4.21 (2Н, м, 17, 18-Н), 4.0 (2Н, м, 7, 8-Н), 3.57 (ЗН, с, 2-СН3), 3.47 (ЗН, с, 12-СНэ), 3.13 (2Н, м, 172-СН2), 3.09 (ЗН, с, 32-СН3), 2.68 (2Н, м, П -СНз), 2.26 (2Н, м, 8 -СН2), 1.72 (ЗН, д, 18-СНз), 1.62 (ЗН, д, 7-СНз), 1.04 (ЗН, м, 82-СН3), -0.34 (с, NH), -0.77 (с, NH). Масс-спектр (MALDI), т/г. 583 (М++Н). Метиловый эфир бактериопурпурина (1а) В охлаждаемую льдом смесь 5 мл 40% - ного раствора КОН и 15 мл эфира добавляли при перемешивании 30 мг (0.3 ммоль) N-нитрозометил мочевины таким образом, чтобы температура реакционной смеси не превышала 5 С. Эфирный раствор сушили в течение 30 мин над твердым КОН. Раствор диазометана постепенно при охлаждении добавляли к раствору 40 мг (0.068 ммоль) бактериопурпурина (1) в 10 мл хлороформа и смесь перемешивали 20 мин. Избыток диазометана разрушали, добавляя 0.5 мл уксусной кислоты в ловушку и растворитель отгоняли в вакууме. Метиловый эфир бактериопурпурина (1а) получен с выходом 35 мг (87%). Электронный спектр, Х, нм: (относительные интенсивности): 363, 412 (Соре), 547 и 817.5 (1:0.75: 0.45: 0.8). Масс-спектр (MALDI), т/г. 596.5 (М+).
Оксим бактериопурпурина (2, син- и анти- изомеры) К раствору 30 мг {0.05 ммоль) бактериопурпурина (1) в 10 мл пиридина по каплям добавляли 17.2 мг (0.25 ммоль) хлоргидрата гидроксиламина, растворенного в 5 мл пиридина. Ход реакции контролировали спектрофотометрически, отбирая каждые 30 минут по 0.2 мл реакционной смеси, которую экстрагировали хлороформом, промывали водой и высушивали сульфатом натрия. При гипсохромном смещении полосы Q до 792 нм реакция была остановлена, полученный аддукт 2 выделен вышеуказанным способом и очищен с помощью препаративной ТСХ в системе хлороформ-метанол (8; 1). Выход 18 мг (62%). Электронный спектр, Атак, нм: (относительные интенсивности): 365, 412 (Соре), 538 и 792 (1:0.7; 0.33: 0.36). Масс-спектр (MALDI), m/z: 596.7 (М+). Оксим N-гидроксицикломмид бактериопурпурина (3) Оксим N-гидроксициклоимид бактериопурпурина (3) получали аналогично оксиму 1, контролируя полноту протекания реакции по смещению основной полосы поглощения Q в электронном спектре продукта до 812 нм. Время реакции 10 ч. Выход 12 мг (40%). Электронный спектр, Атах, нм: (относительные интенсивности): 369, 420 (Соре), 547 и 810(1: 0.4: 0.33: 0.43). Масс-спектр (MALDI), m/z: 612.6 (М+). Диацетоксипроизводное оксима 1Ч-гндрокснбактернохлорина/7й(6а) 10 мг оксима N-гидроксициклоимид бактериопурпурина (3) растворяли в 10 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида и выдерживали при перемешивании 1 ч. Реакционную смесь разбавляли водой, нейтрализовали 15 мл 10% раствора NaHC03 и экстрагировали хлороформом (2x20 мл). Экстракты объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали. Продукт 6а выделяли с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (10:1). Выход 6.3 мг (56.7%). Электронный спектр, Хттх, нм: (относительные интенсивности): 368.5, 419 (Соре), 544.5 и 810.5 (1:0.6:0.36: 0.44). Масс-спектр (MALDI), m/z(%): 696.2 (М+, 66), 638.1 (М-ОСОСН3, 100), 580 (М-2 ОСОСНз, 71). Метиловый эфир N-метоксицнклонмид оксима бактернохлорина/ (6Ь, син- и анти- изомеры) Раствор диазометана в эфире, полученный по методике, описанной при синтезе соединения 1а при охлаждении медленно добавляли к раствору 15 мг соединения 3 в 10 мл хлороформа и реакционную смесь перемешивали 20 мин. Избыток диазометана разрушали, добавляя 0.5 мл уксусной кислоты в ловушку и растворитель отгоняли в вакууме. Продукт, представляющий смесь сип- и аити- изомеров, выделяли с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (12:1). Выход соединения 6Ь 9.9 мг (62%, смесь сип- и анти- изомеров). Стереоизомеры разделяли с помощью многократной ТСХ на силикагеле, повышая полярность системы хлороформ-метанол за счет увеличения содержания метанола от 0 до 20%.
