Содержание к диссертации
Введение
1. Антибиотики тилозинового ряда и их химическая модификация 8
1.1. Макролиды 8
1.1.1. Общие сведения о макролидах и кетолидах 8
1.1.2. Сайт связывания макролидных антибиотиков 12
1.1.3. Роль альдегидной группы С20 в связывании макролидов в рибосомном туннеле. Особенности нуклеотида А2062 19
1.1.4. Механизм действия макролидов 25
1.1.5. Резистентность бактерий к макролидам 27
1.2. Физические свойства и химическая модификация антибиотиков тилозинового ряда 30
1.2.1. Физико-химические свойства антибиотиков тилозинового ряда 31
1.2.2. Химические свойства антибиотиков тилозинового ряда 32
1.2.3. Реакции гидролиза, восстановления и окисления антибиотиков тилозинового ряда 38
1.2.4. Химическая модификация альдегидной группы антибиотиков тилозинового ряда. Получение производных по положению С20 45
1.2.5. Химическая модификация С9 кетогруппы антибиотиков тилозинового ряда 73
1.2.6. Реакции присоединения по двойной связи С10-С11 лактонного кольца. 76
1.2.7. Химические модификации остатков Сахаров тилозина и его производных 77
1.2.8. Химические модификации ОМТ по положению С23 88
2. Обсуждение результатов 99
2.1. Получение производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20 102
2.1.1. Получение замещенных оксимов по положению С20 антибиотиков тилозинового ряда. Синтез производных тилозина, десмикозина и ОМТ, содержащих остатки L-фенилаланина 106
2.1.2. Получение оснований Шиффа тилозина с остатками ароматических и нуклеоаминокислот 108
2.1.3. Получение замещенного гидразона тилозина, содержащего остаток Z-карнитина по положению С20 110
2.2. Синтез пептидных производных десмикозина по 4-положению микаминозы. 112
2.3. Синтез флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда 117
2.4. Изучение антибиотиков тилозинового ряда методом ЯМР-спектроскопии 121
2.5. Изучение функциональной активности производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих остатки аминокислот и пептидов по положению С20 129
2.5.1. Изучение сродства производных антибиотиков тилозинового ряда к рибосоме. Характеристика комплексообразования антибиотик-рибосома 129
2.5.2. Изучение ингибиторных свойств производных антибиотиков тилозинового ряда, модифицированных остатками аминокислот и коротких пептидов по положению С20, в бесклеточной системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка GFP 131
2.5.3. Антибактериальная активность С20 производных антибиотиков тилозинового ряда 133
2.6. Производные макролидов тилозинового ряда как потенциальные инструменты для изучения рибосомного туннеля 134
3. Экспериментальная часть 140
3.1. Исходные вещества и вспомогательные реагенты 140
3.2. Методы 140
3.3. Методики получения соединений 145
3.3.1. Получение производных аминокислот и пептидов 145
3.3.2. Получение С20-производных макролидов 147
3.3.3. Получение пептидных производных десмикозина по 4'-положению 152
3.3.4. Получение флуоресцентных производных тилозина и десмикозина 155
3.3.5. Биохимические методы исследования 158
Выводы 162
- Физические свойства и химическая модификация антибиотиков тилозинового ряда
- Реакции присоединения по двойной связи С10-С11 лактонного кольца.
- Синтез пептидных производных десмикозина по 4-положению микаминозы.
- Производные макролидов тилозинового ряда как потенциальные инструменты для изучения рибосомного туннеля
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизма функционирования рибосомы, в частности, изучение механизма биосинтеза белка, остается одной из важнейших проблем молекулярной биологии и биохимии.
Рибосомный туннель (РТ) является одним из наименее изученных функциональных центров рибосомы. Долгое время считалось, что он является лишь пассивным каналом для прохождения растущей полипептидной цепи. Однако позже было показано, что полипептидная цепь, образующаяся в процессе биосинтеза белка в рибосоме, может вступать в специфические взаимодействия с участками РТ, благодаря чему осуществляются механизмы общей регуляции трансляции и начальные этапы фолдинга растущего пептида. При этом взаимодействия внутри РТ могут приводить к остановке работы рибосомы. Молекулярные механизмы таких взаимодействий на данный момент не известны. Исходя из литературных данных можно предположить, что одним из важнейших элементов РТ, вовлеченных в узнавание последовательности растущей полипептидной цепи, является нуклеотидныи остаток А2062 23 S рРНК, расположенный рядом с пептидилтрансферазным центром (ПТЦ) рибосомы.
Ранее в нашей лаборатории для изучения взаимодействий синтезируемой полипептидной цепи со структурными элементами РТ был предложен новый подход, основанный на применении макролидных антибиотиков тилозиновой группы. Макролиды представляют собой класс природных, а также полу синтетических антибиотиков, построенных на основе 12-16-членного лактонного кольца, к которому присоединены один или более углеводных заместителей. Макролиды относятся к наиболее широко используемым клиническим и ветеринарным антибактериальным препаратам. Механизм действия антибиотиков-макролидов, в том числе тилозина и его аналогов, заключается в том, что они ингибируют биосинтез белка, связываясь в специфическом сайте РТ (т.н. "макролидном сайте», MBS) и закрывая при этом просвет для выхода растущей полипептидной цепи. Модифицируя тилозин по разным положениям остатками аминокислот и коротких пептидов, можно получить соответствующие производные антибиотика, которые представляют интерес как потенциальные зонды для исследования взаимодействий синтезируемой цепи с РТ: в этих соединениях антибиотик играет роль "якоря", расположенного строго в MBS, а аминокислотный или пептидный остаток моделирует полипептидную цепь.
Кроме того, известно, что для изучения функционирования рибосомы и процесса трансляции удобными являются флуоресцентные методы исследования. В частности, флуоресцентные метки могут использоваться: для изучения пептидилтрансферазной реакции, для определения конформации пептидов в РТ, для изучения связывания производных
макролидов методом вытеснения флуоресцентно меченого антибиотика той же группы из рибосомного комплекса.
Цель работы. Целью настоящей работы являлось получение аминокислотных, пептидных и флуоресцентных аналогов макролидных антибиотиков тилозинового ряда по положениям С20 и С4', которые могут служить инструментами для изучения функционирования рибосомы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получена серия новых аминокислотных производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих по альдегидной группе С20 остатки гидрофобных, гидрофильных, ароматических и гетероциклических аминокислот (фенил аланина, тирозина, карнитина, 3-(урацил -1-ил)аланина). Отработаны удобные методы получения соединений этого ряда.
Разработан принципиально новый метод введения пептидных модификаций по положению С4' десмикозина. Впервые получены производные, содержащие остатки глицил-Z-пролина и глицил-глицил--пролина, присоединенные к 4'-положению микаминозы через линкер, содержащий остаток бутандиовой кислоты.
Впервые синтезированы и охарактеризованы флуоресцентные производные антибиотиков тилозинового ряда, которые в дальнейшем могут быть использованы для исследования функциональных состояний бактериальной рибосомы.
Исследован характер взаимодействий остатка А2062 РТ с аминокислотами растущего пептида. Наши результаты демонстрируют, что существует непосредственное взаимодействие растущих пептидов с рибосомным туннелем. Предполагается, что ингибирование биосинтеза белка макролидами является результатом сложных взаимодействий между РТ, растущей пептидной цепью и антибиотиком.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации были опубликованы 2 печатные работы. Результаты работы были представлены на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), на XV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2008), на 30-ом международном пептидном симпозиуме (Хельсинки, Финляндия, 2008) и на международной научной конференции по биоорганической химии, посвященной 75-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (180 ссылок). Диссертация содержит 28 рисунков, 18 таблиц и 32 схем.
Физические свойства и химическая модификация антибиотиков тилозинового ряда
Природные макролиды не всегда обладают желаемыми химическими и биологическими свойствами. В связи с этим, неоднократно предпринимались попытки улучшить путём химической или биохимической (микробиологической) модификации их свойства, расширить спектр антибиотической активности к большему количеству штаммов микроорганизмов или создать новые производные, эффективные против резистентных штаммов. В этой главе обзора будут рассмотрены физические и химические свойства антибиотиков тилозинового ряда, основные способы модификации разных функциональных групп тилозина и родственных ему макролидов и проанализировано влияние этих модификаций на антибиотическую активность их производных. Тилозин представляет собой белое кристаллическое вещество, кристаллизующееся из водного ацетона, водных низших спиртов и воды. Обладая обратной растворимостью, тилозин может быть перекристаллизован из воды путем растворения при 2С с дальнейшим медленным нагреванием до комнатной температуры до образования кристаллов. Температура плавления сухого кристаллического тилозина составляет 128-132С [19,90]. Тилозин содержит одну третичную аминогруппу и является слабым основанием. рК а = 7.1 (в растворе ДМФА-вода 2:1). Он растворяется в слабокислых водных растворах (5% водная уксусная кислота), а также в большинстве органических растворителей: ацетоне, метилэтилкетоне, метаноле, этаноле, этилацетате, дихлорметане, хлороформе, диэтиловом эфире, диметилформамиде, пиридине, триэтиламине, тетрагидрофуране и их аналогах. Растворяясь в бензоле, тилозин, однако, не растворим в неполярных алифатических углеводородах, например в гексане и гептане. Он слабо растворим в воде (5 мг/мл при 26 С) и слабощелочных водных растворах. Молекулярная масса тилозина составляет Mr = 915,94. УФ спектр поглощения в водном растворе имеет максимум при 282 нм с молярной экстинкцией ЕіСЛІ1%=245. Оптическое вращение сухого кристаллического вещества [а]о =-46.3 (с=2; метанол).
Тилозин дает положительную реакцию на тест Молиша и антроновый тест на присутствие углеводных остатков; обесцвечивает раствор перманганата калия. Он дает отрицательный нингидриновый тест, биуретовую реакцию и тест Сакагучи на белки. Отсутствие фенольньгх групп подтверждается отрицательной реакцией с хлоридом железа (II) [19]. Тилозин стабилен в растворах с кислотностью рН = 4 - 9 и подвергается деструкции в сильнощелочный и сильнокислых растворах [91]. В начале происходит отщепление микарозы с образованием демикарозилтилозина (десмикозина). Более глубокий кислотный гидролиз тилозина или десмикозина приводят к дополнительному отщеплению остатка мицинозы с образованием 5-0-микаминозилтилонолида (ОМТ) (Схема 1.5, см. с.38) Десмикозин представляет собой макролидный антибиотик, получаемый из тилозина в результате отщепления остатка микарозы в процессе мягкого кислотного гидролиза (водный раствор с рН=2.8, 3 дня при комнатной температуре). Он устойчив при рН=1 - 9. Десмикозин - белое кристаллическое вещество, растворяющееся в тех же растворителях, что и тилозин. Кристаллизуется из ацетонитрила или хлороформа. В последнем случае образуется сольват с хлороформом с tra=95-115C. При нагревании сольвата под вакуумом при 75С в течение 2 ч получают несольватированный десмикозин с W 114 - 116С [19]. рК а = 8.0 (в растворе ДМФА-вода 2:1). Тесты на присутствие функциональных групп аналогичны соответствующим для тилозина. Молекулярная масса десмикозина Мг= 771,83. УФ спектр поглощения десмикозина в воде имеет максимум при 282 нм с молекулярной экстинкцией /см/%=285. Оптическое вращение в метаноле [а]с =-14.80 [19] (с=2; метанол)) Ряд тилозиновых антибиотиков продолжает 5-О-микамипозгіл тшонолид (ОМТ), имеющий всего один углеводный остаток микаминозы. Его получают при кислотном гидролизе (рН=1,5 - 2,5, г=70 С, 3 суток) тилозина, десмикозина, DMT или микробиологически. ОМТ представляет собой белое кристаллическое вещество с температурой размягчения tPa3M==1130C и температурой плавления tnn=115-118C. Он растворим в таких органических растворителях как хлороформ, бензол, ацетон, метанол и, в меньшей степени, в диэтиловом эфире и в воде [92]. Молекулярная масса ОМТ Мг= 597,68. УФ спектр поглощения ОМТ в 95% этаноле имеет максимум при 284 нм с молекулярной экстинкцией ЕіачІ%=315. Оптическое вращение 0,863% раствора ОМТ в метаноле [ab25=+8,ll [92]. рК а = 8.0 (в водном растворе ДМФА). Наличие большого количества реакционноспособных функциональных групп (гидроксильных, альдегидной, кето- и амино-) у тилозина, с одной стороны, открывает множество возможностей для модификации, а с другой, создает значительные трудности для проведения селективной модификации по какой-либо группе.
Являясь производным тилозина, десмикозин проявляет сходные химические свойства, однако отсутствие микарозы приводит к появлению дополнительной реакционноспособной 4 -гидроксильной группы. ОМТ отличается наличием свободной первичной гидроксильной группы в положении С23, что открывает возможности для селективного получения производных по этому положению. Химические модификации антибиотиков тилозинового ряда могут осуществляться как селективно, так и с затрагиванием одновременно нескольких функциональных групп. Наиболее реакционноспособными являются этилальдегидная группа в положении С6 лактонного кольца, а также 2 -гидроксильная (у десмикозина и ОМТ) и 4 -ОН (у ОМТ) группы микаминозы. Эти группы можно селективно модифицировать. Для модификации других групп требуется предварительное введение временных защитных групп. Для защиты альдегидной группы макролидных антибиотиков наиболее часто используются ацетальная и тиоацетальная защиты, гидроксильные группы углеводных остатков, как правило, защищают ацетилированием. Введение защитных групп по альдегидной функции. Образование ацеталей и тиоацеталей Для проведения различных модификаций тилозина и его аналогов, а также для селективной модификации кетогруппы С9 требуется предварительная защита альдегида. Реакция образования ацеталей взаимодействием первичных и вторичных спиртов с альдегидной группой катализируется кислотами, обычно для этих целей используют дифторуксусную и трифторуксусную кислоты, п-толуолсульфокислоту [93-95] или камфорсульфоновую кислоту CSA [96]. Реакцию образования ацеталей проводят при перемешивании при комнатной температуре. В ряде методик в реакционную смесь добавляют молекулярные сита для связывания выделяющейся в ходе реакции воды. Выходы реакций близки к количественным.
Реакции присоединения по двойной связи С10-С11 лактонного кольца.
Помимо реакций диенового фрагмента антибиотиков тилозинового ряда, которые обсуждались выше (см. «восстановление» и «окисление» с.40-43), возможно селективное присоединение соединений, содержащих тиоловую группу, по двойной связи С10=С11 с образованием С11-тиоэфиров [136]. Для образования желаемого продукта необходимо предварительно защитить альдегидную группу диметил- или дитиоацетальной защитой. Присоединение тиолов типа RSH (R = Ph, СН2СН3, СН2СН2ОН, 4-метилфенил, 4-метокси-фенил, др.) по Михаэлю к диеновому фрагменту макролидного кольца в растворе триэтиламина в атмосфере азота дает соединения типа: Схема 1.18. Присоединение к 10,11-двойной связи соединений типа RSH. В случае отсутствия защиты альдегидной группы, присоединение RSH к тилозину в присутствии триэтиламина не приводит к желаемому С11-присоединению, а образуется внутримолекулярный эфир между С8 и С20 8,20-цикло-20-гидрокси-тилозина (Рис.1.13). С-11-тиопроизводные десмикозина получаются с количественным выходом с помощью гидролиза С-11-тиороизводных тилозина в смеси 0,1 N НС1 - CH3CN (2,5:1) [136]. Тилозин имеет 5 гидроксильных групп в положениях 2 микаминозы, 4" и 3" микарозы, 4" мицинозы и 3 лактонного кольца (Рис.1.2). Соответственно, десмикозин содержит 4-ОН группы в положениях 2 и 4 микаминозы, 4" мицинозы и 3 лактонного кольца. В случае ОМТ ОН-группы находятся в положениях 23 и 3 лактонного кольца, а также 2 и 4 микаминозы. DMT имеет гидроксилы в положениях 23 и 3 лактонного кольца, а также 2 микаминозы, 4" и 3" микарозы. Интересно, что гидроксильные группы обладают разной реакционной способностью, благодаря чему существуют способы их селективной модификации. Причина этого заключается в пространственном строении и взаимном расположении лактонного кольца и углеводных остатков, а также характере заместителей, находящихся в непосредственной близости от гидроксильной группы. Так, наиболее активными являются вторичные гидроксилы микаминозы, благодаря наличию соседнего электроно-акцепторного заместителя - З -диметиламиногруппы остатка микаминозы.
Эффект влияния этой группы настолько силен, что вторичные гидроксилы микаминозы оказываются гораздо более реакционноспособными, чем другие ОН-группы тилозина и десмикозина, а также, чем первичная ОН-группа в положении С23 ОМТ. Подтверждением этого может служить ацетилирование ОМТ уксусным ангидридом в дихлорметане при комнатной температуре, результатом которого является образование 2 ,4 -ди-0-ацетил-ОМТ с выходом 99,3% [137]. В общем случае, ацилирование (Схема 1.4) антибиотиков тилозинового ряда в отсутствии основания в реакционной смеси приводит к селективной модификации 2 -0Н группы. Гидроксильная группа в положении СЗ лактонного кольца, будучи вторичной, как и 4"- и 4 "-ОН, менее реакционноспособна, так как жесткая структура цикла осложняет процесс образования переходного тетраэдрического комплекса в реакциях нуклеофильного замещения. В связи с этим для селективной модификации З-ОН требуются более жесткие условия и предварительная защита 2 , (4 ), 4 " и 4"-ОН групп, а также альдегида. Наименее реакционноспособной является третичная 3"-ОН группа остатка микарозы. Таким образом, функциональная активность падает в ряду 2 -ОН 4 "-ОН 4"-ОН З-ОН » 3"-ОН (тилозин), 2 4 4 " 4" 3 (десмикозин), 2 4 23 3 (ОМТ), 2 23 3 4" DMT [138]. При кинетическом контроле реакций или при введении стерически затрудненных заместителей ацилирование может протекать «против правил». Далее будут рассмотрены наиболее общие примеры модификации гидроксильных групп антибиотиков тилозинового ряда. Одним из самых распространенных методов модификации гидроксильных групп является ацилирование [138] с помощью карбонових кислот, их ангидридов и галогенангидридов. В общем случае ацилирование тилозина может быть произведено по 3, 2 , 4", 4" гидроксильным группам, а также по С-20 альдегидной группе с образованием 3,20-полуацеталя (Схема 1.4). Оптимальными условиями реакции ацилирования являются следующие: безводный растворитель (ацетон), комнатная температура (20С-30С), перемешивание 10-48 ч. Обычно в таких условиях (в отсутствии основания в реакционной смеси) происходит избирательное ацилирование 2 -ОН группы микаминозы. Для одновременного ацилирования всех гидроксилов в положениях 3, 2 , 4", 4 " в реакционную смесь вводят большой избыток ацилирующего агента (5-15 экв.) и большой избыток органического основания (5-15 экв.) в растворе дихлорметана или хлороформа, перемешивают 12-36 ч при температуре 10С-50С или комнатной [100,113]. В качестве органического основания часто используют пиридин или триэтиламин вместе с каталитическими количествами ДМАП. Дальнейшее ацилирование 2 -ацилтилозина в присутствии смеси пиридина или триэтиламина с 0,02-0,1 экв. ДМАП в дихлорметане при комнатной температуре приводит к образованию диацилированного продукта 2 , 4" -ди-0-ацилтилозина.
Селективное ацилирование 4"-ОН группы осуществляют обработкой 2 , 4" -ди-0-ацилтилозина стехиометрическим количеством ацилирующего агента в присутствии 0,1-1,0 экв. ДМАП на 1 экв. ацилирующего агента. В таких условиях образование побочного продукта 3-О-ацилтилозина сводится к минимуму ( 1%). В случае, когда соотношение ацилирующий агент/тилозин нестехиометрическое ( 1,5) наблюдается одновременная модификация 3-ОН группы лактонного кольца. Так, в случае получения тилозина, ацетилированного по трём положениям 2 , 4" и 4 ", наиболее удобно использовать уксусный ангидрид, 2,5 экв. пиридина или триэтиламина и 0,2-0,5 экв. ДМАП в дихлорметане. Ацилирование 3"-гидроксильной группы происходит в наиболее жестких условиях ввиду того, что эта группа является третичной. Обычно реакция проводится при нагревании до 60С-100С в присутствии трибензиламина и хлорангидрида соответствующей кислоты в качестве ацилирующего агента в неполярном органическом растворителе. Обработка 2 -,4"-,4,,,-три-0-ацилтилозина ацилирующим агентом в присутствии основания и 0,5-1,5 экв. ДМАП при температуре 25 С в течение 20-30 ч приводит селективному ацилированию 3-ОН группы лактонного кольца. Модификацию первичной 23-ОН группы ОМТ проводят эквимолярньши количествами ацилирующего агента в присутствии небольшого избытка основания (1,1 экв.), предварительно защитив 2 - и 4 -гидроксилы. Однако благодаря кинетическому контролю реакции ацилирования ОМТ (охлаждение), можно селективно промодифицировать 23-ОН группу в присутствии незащищенных 2 и 4 гидроксилов [100,113,139]. Производные антибиотиков тилозинового ряда, содержащие ацилированные гидроксильные группы, значительно теряют способность ингибировать рост бактерий, чувствительных к макролидам. В случае 2 -0-ацил-производных и in vitro, и in vivo активность падает, видимо, из-за увеличения объема углеводного заместителя, а также в результате невозможности образования водородной связи с остатком А2058 в MBS. Предполагается, что такие производные должны быть вовсе неактивными. Однако 2 -0-ацильная группа легко подвергается гидролизу в водном растворе. Видимо, в процессе метаболизма в организме происходит отщепление 2 -0-ацильной группы, благодаря чему в экспериментах по ингибированию роста бактериальных культур наблюдается проявление некоторой активности подобных производных. Модификация 4-ОН группы микаминозы Модификация 4 -ОН группы десмикозина представляет собой достаточно сложную задачу, поскольку, во-первых, 2 - и 4 - гидроксильные группы остатка микаминозы обладают более высокой активностью, чем другие гидроксильные группы остатков Сахаров и лактонного кольца, а во-вторых, 2 - и 4 - ОН-группы обладают одинаковой активностью и модифицировать их селективно друг от друга не представляется возможным [95,140-142].
Синтез пептидных производных десмикозина по 4-положению микаминозы.
Как указывалось выше, перед нами стояла задача получить пептидные производные антибиотиков тилозинового ряда, пептидный заместитель которых должен был быть направлен условно «вверх» по РТ в сторону ПТЦ. С этой точки зрения было удобно заменить остаток микарозы на пептидный фрагмент. Для сохранения направления пептидной цепи, которое она принимает в процессе биосинтеза белка на рибосоме, необходимо было присоединять пептиды к 4 -гидроксилу микаминозы N-концом, поэтому был выбран линкер - остаток янтарной кислоты, содержащий две карбоксильные группы. Для получения 4 -пептидных производных были выбраны два пептида: глицил--пролин и глицил-глицил--пролин. Длина пептидных фрагментов варьировалась и была подобрана, исходя из данных рентгеноструктурного анализа комплексов 50S субъединицей рибосом с тилозином, с одной стороны [4], и с аналогами 3 -концевых участков аминоацил- и пептидил-тРНК, с другой [166]. Синтез выбранных пептидов был осуществлен в растворе путем последовательного присоединения аминокислотных остатков, начиная с С-конца, методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, которые получали in situ [160,161]. Для защиты N-концевых аминокислот использовали Вос-группу, карбоксильная группа пролина была защищена метиловым эфиром. Схемы получения H-Gly-Pro-OMe (XVb) и H-Gly-Gly-Pro-OMe (XVIb) представлены ниже (Схема 2.9): Выделение Вос-защищенных пептидов (XVa, XVIa) из реакционной смеси проводили зкстраіщиеи этилацетатом, затем очищали перекристаллизацией из смеси гексан - этилацетат. Пептид XVa не требовали дополнительной очистки, в то время как XVIa очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ-метанол, 11:1. Доказательство состава пептидов XVa и XVIa проводили с помощью аминокислотного анализа. Удаление защитной Вос-группы пептидов XVa, XVIa проводили в растворе абсолютной трифторуксусной кислоты при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку пептидов XVb, XVIb, полученных после удаления Вос-группы, осуществляли перекристаллизацией из смеси этилацетата и диэтилового эфира.
Схема синтеза 4 -пептидных производных десмикозина, модифицированных по положению 4 остатками пролин-содержащих пептидов представлена ниже (Схема 2.10). Существенной проблемой при разработке метода оказалась селективная модификация 4-ОН группы микаминозы. Сложность этого процесса обусловлена тем, что тилозин содержит пять гидроксильных групп, и четыре из них достаточно реакционноспособны. В связи с этим на первой стадии осуществляли ацетилирование 2 -, 2"-, 4"- и 4 "- ОН-групп тилозина уксусным ангидридом в присутствии пиридина и каталитических количеств ДМАП при комнатной температуре [167]. В результате реакции образуется смесь три-, тетра- и пента-ацетильньгх производных тилозина (по положениям 2 , 4", 4 ", 3 3" - в порядке убывания реакционной способности) с преимущественным содержанием необходимого нам тетраацетилтилозина (XVII). Очистку продукта осуществляли методом колоночной хроматографии в системе хлороформ - метанол, 9:1, или в системе бензол - ацетон - хлороформ - уксусная кислота, 100:50:60:2. Далее тетраацетилтилозин (XVII) подвергался гидролизу в присутствии 1 н. серной кислоты в смеси вода — ацетонитрил, в результате чего был получен десмикозин, защищенный по всем реакционноспособным гидроксильным группам, кроме 4-ОН группы микаминозы (соединение XVIII). 4 -ОН группа образуется в результате гидролиза гликозидной связи между остатками углеводов - микаминозы и микарозы. Эта свободная ОН-группа вводилась в реакцию с янтарным ангидридом в присутствии триэтиламина с раскрытием цикла янтарного ангидрида и образованием реакционноспособной карбоксильной группы (соединение XIX). Дальнейшую конденсацию аминогруппы пептидов H-Gly-Pro-OMe (XVb) и H-Gly-Gly-Pro-OMe (XVIb) с карбоксильной группой производного (ХК) проводили в присутствии активирующих агентов DCC/HOBt. В основе оптимизированной нами методики лежит способ, описанный в [170,171]: к раствору родамина В в минимальном количестве метанола добавляли гидразин-гидрат (50 экв.) и перемешивали при комнатной температуре, наблюдалось постепенное образование слабоокрашенного осадка, количество которого увеличивалось по мере протекания реакции. Данная реакция идет до полного обесцвечивания раствора с высоким выходом и практически не дает побочных продуктов. Полученное соединение было охарактеризовано методом LCMS (выход = 95%, MS m/z 457,1). Согласно литературным данным, которые хорошо согласуются с нашими экспериментальными результатами, гидразид родамина В не флуоресцирует, в отличие от исходного родамина В. Продукт очищали методом переосаждения из системы метанол - вода.
Выход при подобном способе очистки оказался не очень высок, однако, выделенный продукт не требовал дополнительной очистки. Для получения замещенных гидразонов макролидов мы применяли условия, аналогичные разработанным для получения гидразона тилозина, замещенного остатком 1-карнитина (ацетатный буфер рН 4,7, 20С) (Схема 2.10). При синтезе родаминовых производных тилозина и десмикозина (соединения XXV и XXVI) отличие методики состояло в том, что ввиду низкой растворимости гидразида родамина В в воде в реакционную смесь добавляли ДМСО до полного растворения. Производное тилозина, содержащее остаток Alexa Fluor 488, (соединение XXVIII), было получено также в виде замещенного гидразона. Реакция проводилась в натрий- ацетатном буфере рН 4,7 без добавления ДМСО, так как реагенты и продукты обладали хорошей растворимостью в воде (Схема 2.10). Производное тилозина, содержащее остаток флуоресцеина, (соединение XXVII), было получено способом, заключающимся во взаимодействии альдегидной группы тилозина и ЫНг-группы флуоресцеин-тиосемикарбазида, в условиях, аналогичных описанным выше для получения замещенных гидразонов тилозина (Схема 2.10). Однако в этом случае реакция проходила не так однозначно, как в случае с родамином В. Очистка продуктов реакций осуществлялась методом колоночной хроматографии в системах хлороформ -метанол с различными соотношениями. Характеристики полученных флуоресцентных производных антибиотиков тилозинового ряда представлены в Таблице 2.3 (с. 122). Все соединения охарактеризованы методами масс-спектрометрии, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ, измерены спектры их флуоресценции. Модификация по положению С20 была доказана методом ЯМР-спектроскопии на примере соединения XXV (см. часть 2.4).
Производные макролидов тилозинового ряда как потенциальные инструменты для изучения рибосомного туннеля
Как указывалось ранее, нашей главной задачей было исследование возможных контактов между аминокислотными остатками образующейся в процессе трансляции полипептидной цепи белка и нуклеотидными остатками 23S рРНК, формирующими стенки РТ в той его области, которая примыкает к ПТЦ. Нами была исследована серия производных антибиотиков тилозинового ряда, содержащих в положении С20 остатки аминокислот различной природы. Как уже отмечалось, выбор С20-производных макролидов определялся тем, что рентгеноструктурный анализ комплекса аланилаланинового производного тилозина (Ту1-А2) по этому положению выявил контакты пептидного остатка с функционально важным нуклеотидом А2062, расположенным в т.н. «адениновом кармане» РТ. Более того, связывание пептидного фрагмента в «адениновом кармане» вызывало сильное изменение конформации А2062. Характерная особенность антибиотиков тилозинового ряда заключается в том, что, связываясь с MBS рибосомы, они образуют ковалентную связь с аминогруппой аденинового основания в А2062, благодаря наличию у них ацетальдегидной группы в положении С20. Модификация макролидов по альдегидной группе исключала образование такой ковалентной связи. В качестве «реперного» производного тилозина, лишеннного не только возможности ковалентно связываться с А2062, но и вступать с ним в какие бы ни было нековалентные взаимодействия, мы использовали антибиотик, альдегидная группа которого была восстановлена до гидроксильной (Ту1-Н2 (IV)). Это соединение практически не подавляло трансляцию зеленого флуоресцентного белка (Таблица 2.7) и не конкурировало с радиоактивно меченым эритромицином за образование комплекса с 50S субчастицей рибосомы даже при концентрациях, превышающих концентрацию эритромицина в 100 раз (Таблица 2.6). Это подтверждает то, что образование ковалентной связи является исключительно важным для нормального функционирования антибиотика.
Как видно из данных, представленных в Таблицах 2.6 и 2.7 и на Рис. 2.8 и 2.9, включение в положение С20 тилозина аланилаланинового остатка (соединение XXIX) в значительной степени восстанавливало сродство к рибосоме и ингибирующую активность, хотя и не до уровня немодифицированного антибиотика. Важно также, что остаток Ala-Ala существенно повышал ингибирующую активность десмикозина, компенсируя таким образом не только отсутсвие ковалентоной связи, но и остатка микарозы. Согласно данным РСА, остаток Ala-Ala располагается в «адениновом кармане» параллельно плоскости гетероциклического основания А2062 (Рис 2.10). Такая ориентация обусловлена гидрофобными взаимодействиями остатков аланина с аденином, а также пока еще достоверно не идентифицированными взаимодействиями другой природы (например, образованием водородных связей между карбонильным атомом кислорода пептидного остова и сахарофосфатными остатками). Логично было предположить, что замена остатка Ala-Ala на ароматические и гетероциклические аминокислоты существенно улучшит связывание антибиотика с РТ, поскольку в этом случае можно ожидать появления стэкинг-взаимодействий между аденином в А2062 и боковыми группами аминокислотных остатков. Однако для серии соединений, в которых остатки аминокислот образовывали с тилозином основания Шиффа, таких эффектов мы не наблюдали: тилозин, содержащий остаток урацилилаланина (Tyl=Ual (X)), обладал ингибирующей активностью в 2 раза ниже, чем Ту1-А2 (XXIX). Активность и сродство к рибосоме Ту1=Туг (IX) также оказались значительно хуже, чем у Ту1-А2 (XXIX) (Рис 2.8 и 2.9). Возможно, что наличие двойной связи в линкере уменьшает его гибкость и ограничивает конформационную подвижность боковой аминокислотной цепи. Действительно, после восстановления основания Шиффа в соединении IX был получен Tylyr (ХП), ингибирующая активность которого в экспериментах по транскрипции-трансляции была намного выше (сравнимая с активностью тилозина), чем у Ту1=Туг (IX) и Ту1-А2 (XXIX) (Рис. 2.8 и 2.9). Эти данные подтверждают предположение о наличии стэкинг-взаимодействий между остатком тирозина и А2062 (Рис 2.11). Серия производных, в которых тилозин, десмикозин и ОМТ модифицированы остатком фенилаланина с использованием удлиненного (оксимного) линкера, (соединения VI-VIII), обладала высоким сродством к рибосоме.
Более того, Tyl-Phe (VI) оказался очень сильным ингибитором трансляции GFP - в 3 раза сильнее, чем тилозин (I); в 5 раз сильнее, чем Ту1-А2 (XXIX) и в 40 раз сильнее, чем Ту1-Н2 (IV). Соединения Des-Phe (VII) и OMT-Phe (VIII) также оказались гораздо активнее немодифицированных антибиотиков; особенно сильный эффект наблюдался в случае фенилаланинового производного ОМТ, поскольку сам ОМТ практически не ингибирует трансляцию GFP (Рис 2.9). Согласно данным компьютерного моделирования, часть модифицирующего остатка, несущего фенилаланин, взаимодействует с А2062, в то время как его ароматическое кольцо, скорее всего, находится в кон формации, позволяющей стэкинг-взаимо действия с основанием С2586, расположенным на противоположной стенке «аденинового кармана» (Рис. 2.12). В настоящее время структура комплекса Tyl-Phe с 50S субчастицей рибосомы изучается метом PC А в лаборатории П.Фучини (Франкфуртский университет, Германия). Большой интерес представляла оценка возможного участия во взаимодействии с боковыми радикалами аминокислотных остатков фосфатных групп фрагмента сахаро-фосфатного остова 23S рРНК, расположенного в «адениновом кармане». С этой целью был получен тилозин, содержащий остаток карнитина в положении С20, (XIV); карнитин имеет постоянный положительный заряд. Как видно из графиков (Рис 2.8 и 2.9), Ту1-Саг (XIV) обладает высокими ингибирующей активностью и сродством к рибосоме, сравнимыми по уровню с исходным немодифицированным тилозином. Следовательно, введение остатка карнитина (несмотря на его гидрофильность) компенсирует отсутствие ковалентнои связи между альдегидной группой тилозина и аминогруппой А2062, благодаря взаимодействию с отрицательно заряженными фосфатами группами РТ (Рис. 2.13).
