Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Пепициллинацнлаза из E.coli 8
1.1.1 Общие свойства 8
1.1.2 Структура активного центра пенициллинацилазы 9
1.1.3 Механизм действия 12
1.2 Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков 17
1.2.1 Основные подходы 17
1.2.1.1 Термодинамически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков 17
1.2.1.2 Кинетически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков 19
1.2.2 Кинетические закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил 20
1.2.3 Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных (раствор/осадок реагентов) водных системах 24
1.3 Факторы оптимизация синтеза р-лактамных антибиотиков 30
1.3.1 Эволюция кинетической схемы ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков 30
1.3.2 Влияние ионной силы на ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков 33
1.3.3 рН-зависимость эффективности биокаталитических процессов, катализируемых ПА 38
1.3.4 Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков 42
2. Экспериментальная часть 46
2.1 Материалы 46
2.2 Методы 46
2.2.1 Определение констант специфичности (ккат I Ки ) гидролиза антибиотиков и доноров ацильной части 46
2.2.2 Количественная характеристика связывания нуклеофила в активном центре ПА 47
2.2.3 Количественная характеристика связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом 47
2.2.4 Анализ влияния добавленного нуклеофила на реакцию гидролиза ампициллина 48
2.2.5 Изучение растворимости компонентов реакции 48
2.2.6 Создание кинетически пересыщенных водных систем в реакциях ферментативного синтеза р-л актам ных антибиотиков 49
2.2.7 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина 49
2.2.8 Изучение нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина в присутствии неорганических солей 50
2.2.9 Изучение реакций ферментативного синтеза ампициллина, амоксициллина и цефалексина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения 50
2.2.10 Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 51
2.2.11 Математическая обработка результатов и моделирование реакций 51
3. Результаты и их обсуждение 52
3,1 Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза р-лактамных антибиотиков 52
3.2 Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацилыюй группы на нуклеофил 56
3.2.1 Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил 56
3.2.2 Изучение влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию 72
3.3 Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах 80
3.3.1 Эффект кинетического пересыщения 80
3.3.2 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в высококонцентрированных водных системах 83
3.3.3 Влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК 86
3.3.4 Изучение зависимости нуклеофильности 6-АПК от концентрации анионов 88
3.3.5 Влияние неорганических солей на скорости синтеза и гидролиза при катализируемом ПА переносе ацильной группы на 6-АПК 90
3.3.6 Связывание аниона вблизи активного центра ПА 91
3.3.7 Изучение влияния природы аниона на нуклеофильность 6-АПК 96
3.3.8 Разработка и применение модели ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков 97
3.4 Катализируемый ПА синтез р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах 103
3.4.1 Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и амоксициллина с использованием эффекта кинетического пересыщения 103
Основные результаты и выводы 111
- Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков
- Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков
- Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацилыюй группы на нуклеофил
- Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) из Escherichia coli
несколько десятков лет успешно применяется в процессе синтеза полусинтетических р-лактамных антибиотиков. Одним из исходных веществ для химического синтеза р-лактамных антибиотиков является ядро антибиотика, которое получают катализируемым ПА ферментативным гидролизом природных пенициллинов и цефалоспоринов. Химический синтез р-лактамных антибиотиков включает в себя большое количество стадий (защита боковой цепи, активация карбоксильной группы, реакция ацилирования ядра Р-лактамного антибиотика , снятие защиты боковой цепи), которые проводятся в органическом растворителе.
Наряду с полусинтетическим методом в последнее время наблюдается всё возрастающий интерес к разработке полностью биокаталитических методов получения р-лактамных антибиотиков, в которых ПА катализирует ферментативный перенос ацильной группы активированного донора (в роли которых выступают эфиры и амиды карбоновых кислот) на ядра антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) в водной среде. В связи с этим, особую актуальность приобретает задача изучения общих закономерностей катализируемых ПА биокаталитических превращений с переносом ацильной группы, понимание которых позволило бы разработать эффективные методы оптимизации технологических процессов. Целью настоящей работы явилось: изучение закономерностей реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил на примере синтезов ряда р-лактамных антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой; исследование реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в
высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения; изучение влияния неорганических солей на реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; создание математической модели, адекватно описывающей процесс ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК; разработка общих алгоритмов оптимизации процесса ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков и выбор оптимальных условий синтеза ампициллина, цефалексина и амоксициллина, катализируемого пенициллинацилазой.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые было показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина включает стадии образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил, установлена кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; качественно и количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина; показано, что параметры нуклеофильности, определяющие эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК, сохраняют свои значения при переходе от истинных растворов к кинетически пересыщенным; изучено влияние ионной силы на нуклеофильность 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, показано селективное влияние анионов неорганических солей на параметры нуклеофильности; предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах; разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков; разработан метод
проведения ферментативных синтезов (3-лактамных антибиотиков в высококонцеитрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения и показаны преимущества данного метода перед ранее разработанными.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков с выходами, превышающими значения, представленные в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологических процессах биокаталитического получения ампициллина, цефалексина и амоксициллина.
Ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков
Принципиальная возможность использования пенициллинацилазы для проведения ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков впервые была показана Кауфманом и Бауэром на примере обратимого гидролиза бензилпенициллина пенициллинацилазой из Escherichia coli еще в 1960 году [26]. С тех пор в данной области ведутся интенсивные исследования. Так, в работах [27, 28, 29, 30] было показано, что специфичность данного фермента к донору ацильной части антибиотика не ограничивается остатком фенилуксусной кислоты и пенициллинацилаза способна распознавать целый ряд субстратов, таких как производные фенилглицина, п-гидроксифенилглицина, а- гидроксифенилуксусной кислоты и др. Это открыло широкие возможности для ферментативного получения новых высокоэффективных полусинтетических р-лактамных антибиотиков. В настоящее время существует два метода ферментативного синтеза антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой: термодинамически контролируемый и кинетически контролируемый синтезы. Так называемый термодинамический метод, заключается в прямой конденсации ядра антибиотика и донора ацильной части, в роли которого выступают различные карбоновые кислоты (Рис. 5). Рис.5 Схема «прямого» термодинамически контролируемого синтеза 3-лактамных антибиотиков. RCOOH - карбоновая кислота (донор ацильной части); Nu - ядро антибиотика; RCONu - целевой антибиотик: к син =-=--1—- -)—, - константа равновесия синтеза. Эффективность синтеза в данном случае определяется константой равновесия соответствующей реакции. Исследование термодинамики ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков показало, что оптимум реакции прямого синтеза находится в районе значений рН 4-5 [31]. Учитывая тот факт, что оптимум каталитической активности пенициллинацилаза проявляет при рН 7-8 [23], можно ожидать значительных трудностей, связанных с низкой активностью фермента при проведении реакций прямого синтеза. Кроме того, известные пенициллинацилазы не способны распознавать субстраты, имеющие заряженную группу в боковой цепи [29, 23].
Учитывая, что значение рКа ионизации аминогруппы фенилглицина (остаток этой аминокислоты представляет собой ацильную часть ампициллина, цефалексина, и других антибиотиков) равно 9.1 видно, что при проведении прямого синтеза в области значений рН, соответствующей термодинамическому оптимуму, в реакции будет принимать участие менее 0.01 % используемого субстрата. Этот факт существенно ограничивает кинетические возможности прямого синтеза для получения антибиотиков пенициллинового ряда, содержащих аминогруппу в боковой цепи. Более того, проведенные термодинамические исследования показали, что константы равновесия синтеза недостаточно велики для эффективного использования метода прямой конденсации, особенно с учетом низкой растворимости соответствующих аминокислот, являющихся донором ацильной части [32, 33,34]. Кинетически контролируемый метод состоит в ферментативном переносе ацильной части энергетически обогащенного производного соответствующей карбоновой кислоты (такого как эфир, амид или др.) на ядро антибиотика (Рис.6). В этом случае накопление целевого продукта имеет вид кривой с максимумом, т.е. выход целевого антибиотика контролируется кинетикой процесса и в ходе реакции может значительно превышать уровень, достижимый при проведении прямого синтеза [35]. Основными проблемами при проведении кинетически контролируемого ферментативного синтеза являются: нежелательный гидролиз донора ацильной части, приводящий к потере части исходного ацильного донора, а также гидролиз образовавшегося антибиотика [36, 37]. Реакции синтеза Р-лактамных антибиотиков, катализируемые пенициллинацилазой, представляют собой перенос ацильной части субстрата на нуклеофил, в роли которого в данном случае выступает ядро антибиотика. Побочный гидролиз обусловлен переносом ацильной части на воду, которая выступает в роли конкурирующего нуклеофил а. Впервые кинетика реакций ферментативного переноса ацильной группы в присутствие иуклеофила была детально изучена в работах [38, 39] на примере гидролиза различных субстратов а-химотрипсина в присутствии добавленных нуклеофилов (таких как метанол, этанол, гидроксиламин) и предложена кинетическая схема протекания реакции (Схема 1). Схема 1. «Минимальная» кинетическая схема ферментативного переноса аг ильпой группы на нуклеофил. Е - свободный фермент, S - активированный донор ацильной части, Pi — первый продукт, выделяющийся при образовании ацилфермента, Nu - нуклеофил (ядро антибиотика), Р2 - продукт гидролиза ацилферментного комплекса, Р - продукт переноса на нуклеофил (целевой антибиотик), ES - комплекс фермент-субстрат, ЕА — ацилфермент, ЕР -комплекс фермент-продукт. Было также высказано предположение о возможности протекания реакции по более сложной схеме с образованием ацилфермент-нуклеофильного комплекса. Дальнейшие исследования реакции переноса ацильной группы в присутствии нуклеофилов для таких ферментов как папаин [40] и трипсин [41, 42] подтвердили эти предположения. Более того, была показана возможность связывания нуклеофила не только с ЕА, но и с Е и ES. В настоящее время показано, что реакции, катализируемые пенициллинацилазой, также протекают через образование промежуточного ацилферментного соединения. В работах [43, 44, 45, 46,16] было проведено изучение кинетических закономерностей переноса ацильной группы на нуклеофил, катализируемого пенициллинацилазой, на примере синтеза различных р-лактамных антибиотиков.
Предполагалось, что во всех случаях реакция протекает через образование ацилферментного комплекса. Более того, в работе [46] , были получены данные, которые не описывались в рамках существующей кинетической схемы, и было сделано предположение о связывании нуклеофила с ацилферментом, комплексом фермент-субстрат и свободной формой фермента. Позднее в работе [16] на основании изучения зависимости параметров к т и Км от концентрации добавленного нуклеофила показано, что реакция протекает по более сложной схеме, и включает, по-видимому, стадию образования ацилфермент-нуклеофильного комплекса. Был также предложен метод оценки эффективной реакционной способности нуклеофила на основании анализа накопления продуктов Р и Рг. Данный подход получил развитие в серии работ [47, 48, 49]. Авторами был предложен метод изучения такого типа реакций на основании анализа наблюдаемого соотношения констант деацилирования ЕА и EANu нуклеофилом и водой. Проведенный анализ показал, что схема, учитывающая связывание нуклеофила с ацилферментом, справедлива как для реакций пептидного синтеза, так и для реакций синтеза ампициллина и бензилпенициллина, катализируемых ПА. Такой подход был применен также в работе [50] для изучения реакции переноса ацильной группы на 7-АДЦК, катализируемой ПА. Вопросы, возникающие при описании кинетики ферментативного переноса ацильной группы, наиболее подробно и систематически разобраны в работах [51, 52, 53, 54]. Так, в работе [51] проведен детальный анализ переноса ацильной группы согласно схеме 1. Исследованы условия максимума образования целевого продукта при различных соотношениях начальных концентраций исходных реагентов. Показано, что даже в случае данной упрощенной схемы аналитическое решение для максимума может быть получено лишь для отдельных граничных режимов, анализ же общего случая может быть осуществлен лишь при помощи численных методов. В данной работе сделан очень важный вывод о том, что значение максимума накопления продукта синтеза зависит исключительно от значения таких кинетических параметров, как относительная реакционная способность нуклеофила ф), параметра специфичности - соотношения бимолекулярных констант гидролиза донора ацильной части и целевого продукта (а), а также от начальных концентраций донора и нуклеофила (s0 и п0), причем данная зависимость сохраняется и в случае более сложной схемы 2. Данный подход был развит далее в работах [52, 53, 54], где авторы проанализировали более сложную схему с образованием ацилфермент-нуклеофильного комплекса.
Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков
Как известно, ПА из Е.соІІ способна катализировать не только ферментативную реакцию синтеза Р-лактамных антибиотиков, но и реакции гидролиза активированного донора и целевого продукта. Эффективность синтеза, а именно выход продукта реакции, существенно ухудшается благодаря побочным реакциям гидролиза активированного донора и целевого продукта, поэтому для оптимизации ферментативного синтеза необходимо искать пути подавления нежелательных гидролитических реакций. Одним из методов оптимизации является добавление в реакционную систему органических веществ, способных влиять на каталитические свойства фермента, растворимость субстратов, а также на активность воды. Поэтому в водную среду для подавления ферментативных реакций гидролиза часто добавляются органические растворители. Обычно влияние органических растворителей на выход кинетически контролируемого синтеза не меняет термодинамического равновесия ферментативной реакции [56, 49, 91]. Однако органические растворители влияют непосредственно на каталитические свойства фермента, которые напрямую зависят от структуры фермента. Некоторые авторы считают, что небольшие конформационные изменения пространственной структуры фермента могут изменить форму активного центра и тем самым существенно повлиять на его каталитические свойства [92, 93]. При кинетически контролируемом ферментативном синтезе р-лактамных антибиотиков выход продукта может быть увеличен с помощью добавленных органических растворителей. Для катализируемого ПА из E.coli синтеза цефазолина авторами работы [94] было показано, что при добавлении к реакционной смеси этилацетата (30% по объёму) и тетрахлорида углерода(30% по объёму) выход продукта увеличивался на 65% и 56%, соответственно. При обзоре литературы по влиянию высокомолекулярных спиртов на катализируемые ПА синтезы различных В-лактамных антибиотиков отмечается их позитивное влияние на выход продукта. Так, для катализируемых ПА из различных источников (E.coli [95] и В. megaterium [96]) синтезов ампициллина сообщается об увеличении выхода продукта в присутствии этиленгликоля и оптимизации условий синтеза.
По литературным данным [97] при синтезе ампициллина и цефалексина, катализируемого ПА из В. megaterium, в присутствии сорбитола (20% по массе) выход продукта увеличивался на 28% (в случае ампициллина) и на 20% (в случае цефалексина). Данный эффект объясняется более высокой стабильностью ПА в присутствии высокомолекулярных спиртов. Вероятнее всего высокомолекулярные спирты препятствуют разворачиванию полипептидной цепи фермента за счет стабилизации водородных связей при гидрофильных взаимодействиях [98]. При катализируемом ПА из E.coli синтезе цефалоглицина [99] и ампициллина [100] в присутствии метанола наблюдается увеличение выхода продукта. В то же время стабильность ПА в метаноле и изопропаноле низкая, поэтому для увеличения выхода продукта ферментативного синтеза в присутствии низкомолекулярных спиртов необходимо использовать высокие концентрации фермента. В литературе также отмечается, что органические растворители могут уменьшать выход продукта [94], подавляя каталитическую активность фермента или нарушая стабильность пространственной структуры фермента. Например, для катализируемого ПА синтеза цефазолина в присутствии водорастворимых органических растворителей таких, как этиленгликоль, диметилсульфоксид, диметилформамид, метанол и ацетонитрил наблюдается уменьшение начальных скоростей реакций, как синтеза, так и гидролиза, а так же уменьшение выхода продукта. Степень ингибирования реакции органическим растворителем коррелирует с его гидрофобностью. Чем более гидрофобен растворитель, тем сильнее проявляется эффект ингибирования. Уменьшение начальных скоростей реакции, а так же выхода продукта происходит, по-видимому, из-за взаимодействия органического растворителя с ферментом [94]. Хотя для многих катализируемых ПА ферментативных реакций в присутствии водорастворимых органических растворителей начальные скорости реакции уменьшаются [100. Ю1], зависимость выхода целевого продукта от концентрации добавленного органического растворителя варьируется в зависимости от его химической природы. Таким образом, для получения хороших выходов продукта в водно-органических системах необходимо, учитывая столь противоположное влияние различных органических растворителей, грамотно подбирать состав реакционной смеси. Несмотря на увеличение эффективности процессов биокаталитического получения Р-лактамных антибиотиков, данный метод имеет ряд существенных недостатков по сравнению с водными системами.
Так, использование органических растворителей в ферментативных реакциях синтеза р-лактамных антибиотиков неизменно приводит к необходимости дополнительной очистки целевого продукта и утилизации отработанной реакционной смеси, а также затрудняет или делает невозможной регенерацию фермента. Эффекты противоречивы и часто наблюдаются в разбавленных растворах, т. е. в условиях, не представляющих практического значения. Целью настоящей работы явилось исследование закономерностей ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил и разработка общих критериев для оптимизации процесса биокаталитического получения Р-лактамных антибиотиков. Изучение доступного на сегодняшний день в научной и патентной литературе материала, а также анализ результатов по данной теме, накопленных в нашей лаборатории, позволили определить приоритетные направления исследования и круг задач, решение которых необходимо для достижения поставленной цели. Основными из этих задач являются: детальное изучение кинетики переноса ацильной группы на нуклеофил, катализируемой пенициллинацилазой, на примере реакции ферментативного синтеза ампициллина; исследование особенностей протекания реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах; изучение влияния добавленных неорганических солей на эффективность катализируемого пенициллинацилазой синтеза р-лактамных антибиотиков; создание математической модели реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков, адекватно описывающей особенности протекания реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем; проведение оптимизации ферментативного синтеза ряда р-лактамных антибиотиков с учетом полученных экспериментальных данных. Препарат нативной пенициллинацилазы из Е.соН был предоставлен компанией DSM (Нидерланды). Концентрация активных цеіпров фермента (3 10 М в исходном растворе) была определена титрованием при помощи необратимого ингибитора фенилметилсульфонилфторида, по ранее разработанной методике [14]. Ампициллин, цефалексин, амоксициллин, 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота (7-АДЦК), амид D-фенилглицина (D-ФГА), D-фенилглицин (D-ФГ), амид D-п-гидроксифенилглицина (D-ГФГА), D-п-гидроксифенил глицин (D-ГФГ) -препараты компании DSM (Нидерланды). Натрия додецилсульфат - препарат фирмы Merck (Германия). Другие реагенты и компоненты буферных растворов отечественного производства марки ос.ч. и ч.д.а. 2.2 Методы 2.2.1 Определение констант специфичности (ккот/Ки) гидролиза антибиотиков и доноров ацильной части Константы специфичности { кат1Ки) ферментативного гидролиза ампициллина, амоксициллина, метилового эфира D-фенилглицина и D-фенилглицинамида определяли на основании анализа величин начальных скоростей ферментативного гидролиза при концентрации субстрата 0.5 Км S 5 Км из уравнения Михаэлиса-Ментен.
Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацилыюй группы на нуклеофил
Кинетический анализ «минимальной» схемы 2 в данной работе проводился с двух сторон - со стороны синтеза целевого антибиотика и со стороны его гидролиза, катализируемого ПА. Для получения количественной характеристики влияния добавленного нуклеофила на кинетику катализируемых ПА реакций были исследованы зависимости кинетических параметров ферментативного синтеза и гидролиза ампициллина и амоксициллина от концентрации добавленного нуклеофила (6-АГТК). Кинетической анализ схемы 5, которая является частью "минимальной" схемы 2 со стороны гидролиза антибиотика, показывает, что в стационарном режиме реакция протекает в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен. В рамках схемы 5 очевидно, что значения индивидуальных констант {ккат, Км) и так называемая "бимолекулярная константа" (или константа специфичности ккяп/Км) являются сложными нелинейными функциями от концентрации добавленного нуклеофила. Тем не менее, в выражения для индивидуальных констант (ккат, Км) входит большое число кинетических констант, значения которых неизвестны, в то время как параметры, входящие в выражение для константы специфичности, могут быть определены из независимых экспериментов. Таким образом, для проведения кинетического анализа в качестве изучаемого параметра была выбрана константа специфичности. Полученные экспериментальные данные подтверждают нелинейную зависимость константы специфичности от концентрации 6-АПК (Рис. 7 и 8), но, тем не менее, не описываются в рамках схемы 5. Для адекватного описания экспериментальных данных необходимо ввести в рассмотрение связывание нуклеофила со свободной формой фермента. Таким образом, схема 5 преобразуется в схему 6. Используя уравнение 6.1 и уравнения 2.9-2.10 получаем, что в рамках схемы 6 бимолекулярная константа имеет следующий вид: Из данной зависимости, видно, что бимолекулярная константа зависит от ряда параметров (S0, у, k_4/KF , Кп\) и концентрации нуклеофила. Параметры Ро, у и k_4/KF можно определить из независимых экспериментов, исследуя зависимость нуклеофильности ядра Р-лактамного антибиотика от его концентрации, что позже будет описано более подробно. Таким образом, в зависимости бимолекулярной константы гидролиза антибиотика от концентрации добавленного нуклеофила остаётся неопределённым только один параметр Кп1. Константу связывания нуклеофила со свободной формой фермента Kni можно определить, аппроксимируя экспериментальную зависимость бимолекулярной константы уравнением 6.3, предварительно подставив в него все известные параметры (к_4{К{, ,у, ро).
Значение константы Кпі=3,8±0,1 мМ было получено аппроксимацией экспериментальных зависимостей обратной бимолекулярной константы гидролиза ампициллина (Рис.7) и гидролиза амоксициллина (Рис.8) от концентрации нуклеофила (6-АПК), используя ранее определённые из независимых экспериментов параметры Полученные экспериментальные данные говорят о необходимости учёта связывания нуклеофила со свободной формой фермента при анализе кинетической схемы гидролиза продукта. Экспериментально определённые значения константы связывания нуклеофила со свободной формой фермента (Клі) в случае ампициллина и амоксициллина одинаковы, что является подтверждением адекватности сделанного предположения. В соответствии со сделанными выводами необходимо ввести в рассмотрение связывание свободной формы фермента с нуклеофилом, в результате схема 2 преобразуется в схему 3. С учётом полученных результатов был проведён кинетический анализ схемы 3 со стороны переноса ацильной группы донора на нуклеофил (синтеза антибиотика из 6-АПК). При изучении гидролиза активированного донора (D-ФГА и D-ФГМЭ) в присутствии нуклеофила (6-АПК) были получены зависимости бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила, которые не описывались в рамках схемы 3 (Рис.9 и Рис.Ю). Для адекватного описания полученных экспериментальных данных необходимо ввести в рассмотрение связывание нуклеофила (Nu) с фермент-субстратным комплексом (ES). Таким образом, схема 3 модифицируется в схему 4. Зависимость бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила, полученная из уравнения 4.7 и уравнений 2.9-2.10 имеет вид: Очевидно, что зависимость бимолекулярной константы накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила (уравнение 4.8) зависит от ряда параметров (Ро, у. k2/Ks К К Д). Как уже отмечалось, параметры Ро, у и k2jKs определяются из независимых экспериментов, исследуя зависимость нуклеофильности ядра р-лактамного антибиотика от его концентрации. Константа связывания нуклеофила со свободной формой фермента (Кп]) была определена из зависимости бимолекулярной константы гидролиза антибиотика от концентрации добавленного нуклеофила. Таким образом, видно, что в уравнении 4.8 единственным неизвестным параметром является сложная константа (КП2/Х).
Данная сложная константа есть комбинация константы связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом К„2 и величины X, которая является отношением констант ацилирования в комплексах фермент-субстрат-нуклеофил и фермент-субстрат. Константу Kn2fk можно определить, аппроксимируя экспериментальную зависимость бимолекулярной константы накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации добавленного нуклеофила уравнением 4.8, предварительно подставив в него все известные параметры (Ро, у, k2/Ks, KnI). Константа К Д, очевидно, зависит от конкретного субстрата, связанного с ферментом. Таким образом, К /Х, в случае D-ФГА (Рис.9) и в случае D-ФГМЭ (Рис.10) равняется 22±0,5 мМ и 6,4±0,2 мМ, соответственно. В научной литературе в ряде статей [67, 68, 69] встречаются попытки описать влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию синтеза р-лактамных антибиотиков как ингибирование ферментативной реакции нуклеофилом. В связи с этим авторы пытаются определить константу ингибирования добавленного нуклеофила. Считается, что в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка существует точка пересечения прямых зависимостей обратной скорости реакции от обратной концентрации субстрата при различных концентрациях добавленного нуклеофила. В связи с этим, был проведён анализ зависимостей скорости гидролиза амициллина от его концентрации в присутствии различных концентраций 6-АПК в двойных обратных координатах. Математический анализ схемы 6 показал, что при ферментативном гидролизе антибиотика в присутствии добавленного нуклеофила прямые зависимости обратной скорости реакции от обратной концентрации субстрата при различных концентрациях добавленного нуклеофила описываются следующим выражением: Из уравнения 6.4, используя уравнения 2.9-2.10, получаем уравнение описывающее зависимость обратной скорости гидролиза продукта от обратной концентрации продукта для любой концентрации добавленного нуклеофила (C(Nu)=n М):
Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах
Как отмечалось ранее, для эффективного проведения катализируемого ПА ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков необходимо использовать максимальные концентрации реагентов. Предложенный метод с использованием эффекта кинетического пересыщения позволяет создавать высококонцентрированные водные системы, где действующая концентрация реагентов в несколько раз больше, чем концентрация насыщенных растворов данных соединений. Метод создания кинетически пересыщенных растворов основан на зависимости растворимости компонентов реакционной смеси от рН. На рис.14 схематично представлен процесс создания пересыщенного раствора ядра антибиотика на примере 6-АПК. Итак, для создания кинетически пересыщенного раствора ядра антибиотика при заданном значении рН необходимо: Увеличить рН раствора до значения, при котором раствориться необходимое количество 6-АПК (Рис.14, этап 1). Приготовить насыщенный раствор 6-АПК при данном рН (Рис. 14, этап 2). Плавно вернуть значение рН к исходному (Рис.14, этап 3). При этом получается гомогенный раствор, в котором содержание 6-АПК превышает её растворимость при данном рН. Такие растворы называют кинетически пересыщенными. Полученные гомогенные кинетически пересыщенные растворы реагентов не являются термодинамически стабильными и со временем они распадаются на насыщенный раствор и осадок реагента (Рис.14). Распад метастабильного кинетически пересыщенного раствора требует образования зародышей, их роста и может быть кинетически заторможен. Поэтому такие растворы могут существовать довольно продолжительное время, достаточное для проведения ферментативного синтеза. Наряду с этим, в ходе ферментативного синтеза концентрации исходных веществ уменьшаются вследствие их расходования, тем самым постепенно снижается степень пересыщения раствора, что увеличивает время его существования. При создании растворов важную роль играет чистота растворяемого вещества, так как любые нерастворимые в воде примеси являются центрами кристаллизации и ускоряют распад кинетически пересыщенного раствора.
В тех случаях, когда на этапе приготовления насыщенного раствора (Рис.14, этап 2) наблюдалось его замутнение, прибегали к фильтрованию раствора от механических примесей перед дальнейшим понижением рН. Таким образом, был разработан метод, позволяющий повысить действующие концентрации реагентов в водном растворе более чем на порядок, причём время существования таких кинетически пересыщенных растворов является достаточным для проведения биокаталитического превращения (Таблица 1). Как было показано выше, параметры нуклеофильности (р\ и У) являются важной характеристикой эффективности ферментативного синтеза. Для определения параметров нуклеофильности 6-АПК и 7-АДЦК было изучено соотношение скоростей синтеза и гидролиза (VAMI/VD-ФГ» см. уравнения 2.8-2.12) в широком интервале концентраций нуклеофила, включая кинетически пересыщенные растворы. Из Рис. 15 и 16 видно, что характер зависимостей соотношения скоростей синтеза и гидролиза от концентрации нуклеофила сохраняется при переходе от истинных к пересыщенным растворам. Это означает, что значения параметров нуклефильности сохраняют постоянные значения на всём исследуемом интервале концентраций нуклеофила. Так, при увеличении действующей концентрации 6-АПК в 2.2 раза вследствие эффекта кинетического пересыщения соотношение скоростей возрастает в 1.5 раза, что характеризует увеличение эффективности синтеза при переходе от истинных к пересыщенным растворам. Ещё больший эффект можно наблюдать в случае такого малорастворимого соединения как 7-АДЦК: при увеличении действующей концентрации 7-АДЦК почти в 7 раз вследствие эффекта кинетического пересыщения соотношение скоростей возрастает в 4 раза, что приводит к значительному увеличению эффективности ферментативного синтеза. При проведении реакций ферментативного синтеза в высококонцентрированных водных системах существенную роль, помимо обсуждаемых выше факторов (таких как параметры нуклеофильности и концентрации реагентов), может играть влияние ионной силы. Например, для поддержания постоянной рН раствора используют различные буферные растворы, которые содержат неорганические соли. Очевидно, что компоненты буферных растворов вносят дополнительный вклад в суммарную ионную силу, создаваемую компонентами реакционной смеси. К тому же очень часто в реакционную систему неизбежно вносятся неорганические соли и кислоты при доведении рН раствора до необходимого значения. В целях минимизации флуктуации значений экспериментальных данных по причине различия ионной силы в серии экспериментов применяют неорганические соли для создания большой постоянной ионной силы. Поэтому возникает необходимость изучения влияния ионной силы на катализируемые ПА ферментативные реакции. Обычно для поддержания постоянной ионной силы раствора используют хлорид калия. Поэтому сначала было проведено определение параметров нуклеофильности при поддержании постоянной ионной силы, созданной добавлением соответствующего количества хлорида калия.
Полученные результаты (Рис.17, СГ) существенно отличаются от обсуждаемых ранее (Рис.17, без поддержания ионной силы). Соотношение скоростей синтеза и гидролиза в области пересыщенных растворов в присутствии хлорида меньше, чем при насыщенной концентрации 6-АПК без добавления солей. Это говорит о существенном ухудшении эффективности ферментативного синтеза в присутствии хлорида. Наиболее очевидным в данной ситуации являлось предположение о влиянии ионной силы на параметры нуклеофильности 6-АПК. Для проверки данного предположения было проведено определение параметров нуклеофильности 6-АПК при поддержании ионной силы другими неорганическими солями (сульфатом и нитратом калия) и получен неожиданный результат - различные соли оказывали различное влияние на поведение ферментативной реакции. Полученные результаты (Рис. 17) говорят о том, что эффект, наблюдаемый в присутствии различных солей, не может быть сведён только к влиянию ионной силы. Кроме того, использование во всех случаях солей калия исключает возможность специфического влияния катиона добавленной соли. Таким образом, во всех приведённых случаях наблюдается негативное влияние аниона, существенно снижающее эффективность синтеза. С другой стороны, факт селективного влияния анионов неорганических солей на реакцию катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил является принципиально новым наблюдением и говорит о потенциальной возможности связывания неорганического аниона вблизи активного центра ПА. Для проверки предположения о связывании аниона необходимо подробнее исследовать зависимость нуклеофильности 6-АПК от концентрации добавленного аниона. Было важно установить, с какими свойствами аниона связано его селективное влияние на параметры ферментативной реакций и как сильно различаются эффекты в ряду гомологичных анионов. Поэтому была изучена зависимость соотношения скоростей синтеза и гидролиза (VAMn/VD-on см. уравнения 2.8-2.12) в реакции синтеза ампициллина от концентрации анионов галогенового ряда. Из экспериментальных данных (Рис. 18) видно, что даже в ряду близких по своим свойствам галоген-анионов наблюдается отчётливо выраженное селективное влияние. Вид кривых с насыщением по концентрации галоген-анионов говорит о том, что имеет место связывание аниона вблизи активного центра ПА, влияющее на одну или несколько стадий ферментативного превращения. Возможно, эффективность связывания коррелирует с ионным радиусом, т.е. с доступностью какой-то области активного центра ПА для аниона определённого размера.
