Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 7
2.1 Ядрышко - структура и функции 7
2.1.1 Ядрышко и его протеом 7
2.1.2 Биосинтез рибосом 10
2.2 Белок ядрышка SURF^6 14
2.2.1 Локус Surfeit 14
2.2.2 Строение и экспрессия гена Surf-6 18
2.2.3 Экспрессия гена Surf-6 при клеточной дифференцировке и пролиферации 20
2.2.4 Белок SURJF-6 - основные свойства 22
2.2.5 Взаимодействие белка SUKF-б с нуклеиновыми кислотами in vitro 24
2.2.6 Внутриклеточная локализация белка SU.RP-6 25
3. Результаты и обсуждение 29
3.1 Выявление нового семейства белков, обладающих консервативным SURF-6 доменом 29
3.2 Белок RRP14 - гомолог белка SURF-6 мыши 33
3.3 Ядрышковая локализация белков семейства SUR.F-6 консервативна для клеток эукариот 35
3.4 Определение участков молекулы SURF-6 мыши, важных для ядерной локализации белка и его доставки в ядрышко 39
3.5 Анализ взаимодействия SURF-6 с РНК и ДНК ядрышка in situ 44
3.6 Содержание белка SURP-6 в клетках мыши на разных фазах клеточного цикла 48
3.7 Эффекты нокдауна белка ядрышка SURF-6 в клетках мыши NIH/3T3 52
3.8 Определение белков, взаимодействующих с SURF-6 доменом 67
3.9 Эффекты суперпродукции белка SURF-6 к клетках мыши линии NIH/3T3 82
4. Экспериментальная часть 89
4.1. Приборы и оборудование 89
4.2 Методы 90
Выводы 107
- Белок ядрышка SURF^6
- Взаимодействие белка SUKF-б с нуклеиновыми кислотами in vitro
- Определение участков молекулы SURF-6 мыши, важных для ядерной локализации белка и его доставки в ядрышко
- Определение белков, взаимодействующих с SURF-6 доменом
Белок ядрышка SURF^6
Среди идентифицированных с помощью масс-спектрометрического анализа белков ядрышка человека роль около 200 из них в клеточном метаболизме до сих пор остается невыясненной (Рис. 2). К таким белкам относится, в частности, белок SURF-6, Этот белок впервые описан в 1996 г. как продукт экспрессии гена Surf-б, являющегося шестым членом локуса Surfeit в геноме мыши [7]. Локус Surfeit является консервативным локусом генов и широко распространен у позвоночных [33 ]: он выявлен в геномах человека [34], мыши [35], шпорцевой лягушки [10,36], иглобрюхой собаки-рыбы [37] и курицы [38] (Рис.4). Беспозвоночные виды, включая фруктовую мушку D. melanogasler, не имеют локуса Surfeit, характерного для позвоночных, но обладают генами, гомологичными генам локуса позвоночных. Эти гены располагаются на разных хромосомах, а продукты их экспрессии имеют белковых гомологов у позвоночных видов [39]. Локус Surfeit мыши - это плотный кластер шести функционально не связанных друг с другом генов "домашнего хозяйства" - Surf-1, Surf-2, Surf-3, Surf-4, Surj-5 и Surf-б [35], Как было показано, нуклеотидные последовательности шести генов локуса Surfeit и аминокислотные последовательности продуктов их экспрессии не имеют гомологии между собой и с другими генами и белками. Локус Surfeit обладает свойствами, резко отличающими его от других кластеров генов. Они, в частности, включают наличие перекрывающихся генных последовательностей и двунаправленных промоторов транскрипции, а также плотное расположение генов с минимальными межгенными областями [40,41]. Показано, что направление транскрипции для пяти из шести генов локуса Surfeit (кроме Surf 6 гена) противоположно направлению транскрипции соседнего гена. 5 -концы каждого из шести генов ассоциированы с участками геномной ДНК, обогащенными цитозином и гуанином (CpG-обогащенные участки), и не содержат консенсусної! ТАТА-последовательпости [7,35,42] (Рис. 4). Отсутствие консенсусної! ТАТА-последовательности, а также наличие консервативной CpG-богатой области в промоторном участке характерны для многих генов "домашнего хозяйства" [43,44]. Известно, что метилирование таких участков приводит к подавлению активности промотора, расположенного в этой области [45,46].
По сравнению с расположением других генов, гены локуса Surfeit имеют достаточно малые межгениые расстояния. Например, у мыши 5 -концевые последовательности противоположно транскрибируемых генов Surf-1 и Surf-2 имеют межгенное расстояние всего лишь около 15-73 и.о. [47], а для генов Surf3 и Surf-5 такое расстояние составляет 159 п.о. [42], З -концевые последовательности генов Surf-2 и Surf 4 перекрываются на 133 п.о. [40], а З -концы генов Surf-1 и Surf-З разделены всего лишь 70 и.о. [48]. Также необходимо заметить, что в локусе Surfeit мыши был обнаружен псевдогеи, расположенный на расстоянии в 68 п.о, от З конца гена Surf-5 [42]. Псевдогенная последовательность также содержится в локусе человека и соответствует рибосомному белку rpL21 [9] (Рис. 4). Необычно плотное расположение генов, характерное для генов локуса Surfeit, является консервативным для млекопитающих и птиц. Этот факт свидетельствует в пользу того, что подобная организация может иметь биологическое значение и играть важную функциональную или регуляторную роль [33,38,49]. В частности, «кластеризованное» расположение генов в локусе может свидетельствовать о г/ие-взаимодействии генов или взаимной регуляции экспрессии генов данного локуса у позвоночных [39]. Возвращаясь к рассмотрению организации промоторных областей генов локуса Surfeit позвоночных, необходимо заметить, что промоторная область генов Surf-1 и Surf-2 человека содержит четыре сайта связывания транскрипционных факторов. Два из этих сайтов узнаются транскрипционными факторами Spl и YY1 [50]. Показано, что белки Spl и YY1 взаимодействуют как между собой, так и с транскрипционным фактором с-Мус [51, 52]. Транскрипционный фактор с-Мус является ядерным белком, который регулирует экспрессию генов, участвующих в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки, биогенеза рибосом и апоптоза [53 ]. Показано, что взаимодействие YY1 и с-Мус возникает в ответ на действие митогенных (ростовых) факторов, присутствующих в среде культивирования клеток [50]. Позднее было доказано, что активность промотора гена Surf 1 напрямую зависит от активности МАР-киназы, участвующей в передачи митогенных сигналов внутрь клетки по так называемому Ras-зависимому МАР-кииазгюму каскаду, который, в частности, активирует фактор транскрипции с-Мус [53-55]. Таким образом, активация промотора гена Surf-1 происходит вследствие взаимодействия транскрипционных факторов YY1 и с-Мус в ответ на присутствие ростовых факторов в среде. Сравнительно недавно было обнаружено, что экспрессия гена Surf-б у D. melanogaster также активируется транскрипционным фактором с-Мус [12]. С использованием В-лимфоцитов человека, в которых экспрессия эндогенного с-Мус контролировалась тетрациклин-зависимым промотором, и фибробластов крысы, постоянно экспрессирующих с-Мус, были идентифицированы 38 генов, кодирующих белки с ядрышковои локализацией, экспрессия которых находилась в зависимости от уровня эндогенного фактора с-Мус [13]. К числу таких генов относится ген Surf-б человека, а также геиы других ядрышковых белков, включая нуклеолин, В23/нуклеофозмин, фибрилларин и Noppl40. Все эти белки играют ключевые роли в биогенезе рибосом.
Можно предположить, что, несмотря на отсутствие локуса Surfeit у беспозвоночных и, в частности у фруктовой мушки, гены локуса могут обладать схожими механизмами с- Мус-зависимой регуляции, а также являются эволюционно консервативными и значимыми в процессах клеточного метаболизма, независимо от их расположения в геномной ДНК. На сегодняшний день продукты экспрессии каждого из шести генов локуса Surfeit мыши идентифицированы. Белки, кодируемые этими генами, по-видимому, обладают разными функциями, но имеют межвидовых гомологов, принадлежащих к белковым семействам, представленным в базе данных Pfam (Protein Families Database, http://www.Sanger.ac.uk/SofWare/Pfam/) [56]. Так, белки принадлежащие семейству SURF- 1, являются трансмембранными митохондриальными белками, предположительно участвующими в биогенезе цитохрома С [ 57 ]. Функции белков семейства SURF-2 на сегодняшний день неизвестны. Продукт экспрессии гена Surf-З является рибосомным белком L7a, входящим в состав большой субъединицы рибосомы; на сегодняшний день L7a не отнесен ни к одному известному белковому семейству [58]. В семейство SURF-4 входят консервативные эукариотические интегральные мембранные белки, локализующиеся в эндоилазматическом ретикулуме [59]. Ген Surf-5 человека кодирует два цитоплазматических белка с неустановленной функцией и являющихся продуктами альтернативного сплайсинга мРНК Surf-5 [ 60 ]. И, наконец, ген Surf-б кодирует ядрьшшовый белокSURF-6 [7,8]. Таким образом, можно заключить, что локус Surfeit является уникальным как по строению и взаимному расположению генов, так и по разнообразию функций белков, кодируемых генами локуса. 2.2.2 Строение и экспрессия TeimSurf-6 Белок SURF-6 был описан в 1996 г. как продукт экспрессии шестого гена локуса Surfeit (Surf-6), что послужило обоснованием для его названия [7]. С помощью Саузерн-блоттинга, ГЩР и секвенирования ДНК было показано, что ген Surf-б мыши содержит четыре экзона и распространяется на 14 000 п.о. геномной ДНК. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что самая длинная открытая рамка считывания кодирует основный белок состоящий из 355 а.о. с изоэлектрической точкой р! 10.52. С помощью Нозерн-блоттинга было установлено, что транскрипты гена Surf-6 присутствуют во всех тканях мыши, включая сердце, мозг, селезенку, легкое, печень, скелетные мышцы, почку и семенники. Экспрессия Surf-б в разных тканях мыши, отсутствие консенсусний ТАТА-последовательности и наличие консервативной CpG-области ДНК в промоторном участке позволили отнести его к генам "домашнего хозяйства" [7,43]. В 5 -области Surf-б мыши обнаружены нуклеотидные последовательности, имеющие гомологию с мотивом TdT, представляющим простейший промотор, а также участки связывания транскрипционных факторов Spl и АР2 [7,61]. Открытой рамке считывания гена Surf-б предшествует последовательность, аналогичная консенсусной последовательности Козака, которая необходима для эффективной инициации трансляции с мРНК транскрипта.
Взаимодействие белка SUKF-б с нуклеиновыми кислотами in vitro
В предсказанной вторичной структуре белка SURF-6 мыши с большой вероятностью превалирует а-спиральная укладка [7], присутствие которой характерно для белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами [75], Для определения способности белка SURF-6 связываться с нуклеиновыми кислотами in vitro был использован метод аффинной хроматографии и нитроцеллюлозные фильтры с сорбированной на них ДНК или РНК [8], Из клеток мыши линии NIH/3T3 была получена фракция белков, обогащенная ядрышковыми белками, а в бактериальной системе экспрессирован рекомбинантный SURF-6 мыши. После хроматографирования экстракта ядрышковых белков и рекомбинантного SURF-6 через аффинную колонку с фрагментами плазмидной ДНК было показано, что белок SURF-6 выявляется в белковой фракции, полученной при элюции 0.5 М раствором КС1. Результаты проведенного эксперимента позволили сделать вывод о высоком сродстве как эндогенного, так и рекомбинантного белков SURP-6 мыши к ДНК in vitro. Использование нитроцеллюлозных фильтров с сорбированной на них ДНК (линеаризованная плазмида pBlueScript) или РНК (рРНК, выделенная из Е.соїї) выявило способность рекомбинантного белка SURF-6 связываться как с ДНК, так и с РНК. При этом наблюдалось насыщение связывания нуклеиновых кислот с белком, которое для 2 мкг рекомбинантного белка составило 35 % ДНК я 50 % РНК связавшихся нуклеиновых кислот. Также было найдено, что повышение концентрации КС1 до 0.5 М уменьшало связывание SURF-6 с ДНК с 35 % до 1.5 %. В то же время, повышение концентрации соли снижало количество РНК, связанной с белком, с 50 % до 30 %, что говорило о более высоком сродстве рекомбинантного SURJF-6 к РНК, чем к ДНК [ 8 ]. На сегодняшний день известно большое количество белков ядрышка, связывающих нуклеиновые кислоты как in vivo, так и in vitro. К ним, в частности, относятся фактор раннего процессинга пре-рРНК фибрилларин [26,76], фактор позднего процессинга рРНК В23/нуклеофозмин и многофункциональный белок пуклеолин [27, 77 ]. Однако, в отличие от этих белков, в молекуле SURF-6 отсутствуют канонические ДНК- и РНК-связывающие мотивы. 2.2.6 Внутриклеточная локализация белка SURF-6 Методом иммуноцитохимической окраски культивируемых клеток мыши линии NIH/3T3 с использованием аффинно-очищенных антител к белку SURF-6 мыши была определена внутриклеточная локализация белка SURF-6.
В результате проведенных экспериментов было показано, что белок имеет четкую ядрышковую локализацию [8]. На ультраструктурном уровне SURF-6 выявляется преимущественно в гранулярном компоненте ядрышек клеток мыши, который, как известно, участвует в созревании и сборке рибосом (Рис. 1) [78]. Таким образом, характер локализации SURF-6 в ядрышке предполагает его участие в процессах сборки и созревания рибосомных частиц. Об этом же свидетельствуют результаты ко-локализации SURF-6 с белками ядрышка фибриллариыом и В23/нуклеофозмином [79]. Двойное иммуномечение клеток антителами к SURF-6 и В23/нуклеофозмину или антителами к SURF-6 и фибрилларину показало, что локализация SURF-6 больше соответствует таковой фактора сборки пре-рибосом - белка В23/нуклеофозмина, чем фактора раннего процессинга пре-рРНК - фибрилларина [ 8 ], Аналогичные свойства были выявлены при анализе локализации белков SURF-6, В23/нуклеофозмина и фибрилларина в митозе. Как известно, в зависимости от распределения белков ядрышка в митотических клетках, их принято объединять в две группы [82,83,84], Первую группу составляют белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами хромосом и участвующие в транскрипции рибосомных генов. К таким белкам, в частности, относятся большие субъединицы РНК полимеразы I и ее специфический транскрипционный фактор белок UBF [85-88]. Вторую группу составляют ядрышковые белки, которые располагаются в цитоплазме и на поверхности хромосом митотических клеток. К этой категории относятся белки, участвующие в процессинге рРНК и созревании рибосом, включая В23/нуклеофозмин, нуклеолин и фибрилларин [87, 89,90] С помощью специфических антител расположение SURP-6 в динамике митоза было проанализировано и сопоставлено с локализацией ядрышковых белков В23/нуклеофозминаи фибрилларина. Результаты показали, что в профазе SUR_F 6 сохраняется в связи с распадающимися ядрышками, в прометафазе находится в цитоплазме клеток, в анафазе и телофазе отчетливо выявляется в перихромосомной области хромосом. Существенно, что SURJF-6 в митозе не ко-локализуется с белками транскрипционного комплекса РЫК полимеразы I. Эти наблюдения говорят о том, что SURF-6 в большей степени обладает свойствами, характерными для белков, вовлеченных в процессинг рРНК, и отсутствующих у белков, участвующих в транскрипции рибосомных генов [85-87,91]. Отличительной особенностью белка SURF-6 является его прочная связь с ядрышками клеток мыши на протяжении интерфазного периода клеточного цикла. По этому признаку SURF-6 отличается от некоторых других белков ядрышка (например, В23/нуклеофозмина, нуклеолина и КІ-67), которые в зависимости от состояния клеток располагались только в ядрышках или в ядрышках и ядрах клеток [69, 80].
Принимая во внимание связь SURF-6 с матриксом ядрышка, было высказано предположение, что SURF-б необходим для поддержания структурной целостности ядрышка в течение клеточного цикла [81]. Следует отметить, что транскрипционный фактор оМус, который активирует транскрипцию гена Surf-б у D. melanogaster и человека, также регулирует экспрессию генов кодирующих белки нуклеолин и В23/нуюгеофозмин, т.е. белки, основной функцией которых является участие в биогенезе рибосом [ 12, 92, 93 ]. Таким образом, анализ имеющихся литературных данных, позволяет предположить участие белка ядрышка SURF-б в нескольких процессах - биогенезе рибосом, регуляции клеточной пролиферации и дифференцировке. Однако прямые данные о функциональной значимости SURF-6 в клетках млекопитающих до сих пор отсутствуют. Принимая во внимание сведения, изложеннвіе ввіше, в настоящей работе мы продолжили изучение структуры, свойств и функций белка ядрышка SURF-6. 2.3 Цели и задачи работы Основной целью работы было изучение структурных особенностей и функциональной значимости белка SURP-6 в клетках мыши. Для достижения поставленной дели в работе решали следующие конкретные задачи: 1. С помощью современных Интернет-ресурсов и наиболее полных баз данных провести анализ аминокислотных последовательностей известных белков для выявления новых гомологов белка SURF-б мыши у разных биологических видов. Исследовать структурное сходство и особенности аминокислотных последовательностей гомологичных белков. 2. С помощью анализа аминокислотной последовательности in siiico и генно-инженерных методов выяснить, присутствуют ли в SURF-б мыши участки, ответственные за локализацию белка в ядре и ядрышке. 3. С использованием синхронизованных клеток мыши линии NIH/3T3 проанализировать содержание SURP-6 иа разных стадиях клеточного цикла. 4. Оценить возможность взаимодействия SURF-б с ядрышковой РНК и ДНК in situ. 5. Разработать условия для индукции нокдауна белка SURF-б в клетках МН/ЗТЗ с помощью РНК-интерференции и "Tet-On" системы регуляции экспрессии генов. Выявить основные последствия истощения пула SURF-6, проявляющиеся на клеточном уровне. 6. На основе "Tet-On" системы регуляции экспрессии генов разработать подходы для индуцированной суперпродукции белка SURF-б в клетках мыши NIH/3T3. Изучить влияние повышения уровня SURF-б на содержание 18S и 28S рРНК. . Приступить к определению возможных белковых партнеров SURF-6 in vitro методом аффинной хроматографии с использованием консервативного домена SURF-6 мыши, слитого с глутатион-3-трансферазой. Разработать условия выделения и очистки рекомбинантного SURF-6 домена/GST.
Определение участков молекулы SURF-6 мыши, важных для ядерной локализации белка и его доставки в ядрышко
Принимая во внимание результаты, полученные путем анализа последовательности SURF-6 мыши in silico, мы предприняли попытку экспериментального определения NLS-сигналов в молекуле белка (Табл. 1). С этой целью была создана серия генетических конструкций, кодирующих укороченные формы SURF-6 мыши, слитые с EGFP (Рис. 9). Для создания этих плазмид фрагменты кДНК М. musculus, кодирующие различные участки аминокислотной последовательности белка SURF-6, были амплифицированы с помощью ДНК-полимеразы pjx и ген-специфических праймеров (Табл. 4), очищены на аффинных колонках и клонированы в вектор pEGFP-СЗ. Для создания девяти из десяти конструкций был использован сайт, созданный эндонуклеазами рестрикции ЕсоШ и БатШ; для создания конструкции, схематически изображенной на Рис, 9К, было использовано три сайта рестрикции - ЕсоШІКрпУВатШ (Табл. 4). В результате мы получили 10 генетических конструкций, которые обозначили как GFP mSURF6(X где в скобках указаны позиции а.о., сохраненных в укороченном белке (Табл. 4, Рис. 9). Для анализа внутриклеточной локализации мутантных белков клетки Р19 выращивали на субстрате на стеклах и при достижении 60 % плотности популяции трансфецировали плазмидами, как указано выше. После инкубации трансфецированных клеток в полной ростовой среде в течение 24-48 ч их фиксировали 3 %-ым раствором параформальдегида и использовали для анализа внутриклеточной локализации химерных белков с помощью светового флуоресцентного или конфокального микроскопов. Как видно на Рис. 9, подавляющее большинство фрагментов молекулы SURF-6, различающихся по длине и местоположению в полноразмерном белке, проявляли способность мигрировать в ядрышки и ядра клеток Р19. Три из десяти мутантных белков, включая продукты экспрессии плазмид GFP mSURJF6 (полноразмерный белок), GFP mSURF6(l-261/288-355) и GFP mSURF6(l-195) (обозначения белков см. Табл. 4), обладали четко выраженной ядрышковой локализацией и не выявлялись в нуклеоплазматической зоне ядра (Рис. 8А, Б и К).
Поскольку один из этих белков - GFP mSUFJF6(l-195) - состоял только из N-концевой части полноразмерного SURF-6 (Рис. 8Б), можно сделать заключение о том, что именно N-концевая часть белка определяет его специфическую локализацию в ядрышках. Об этом же говорит анализ гюкализации химерного белка - продукта экспрессии плазмиды GFP mSURF6(l-261/288-355), лишенного высококоисервативной части («ядра») SURF-б домена (а. о. с 262 по 287), но сохраняющего N-консервативную область (Рис. 8К), При дальнейшем дроблении полипептидной цепи N- концевой области SURF-6 были получены химерные белки GFP mSURF6(l-99) и GFP mSURF6(100-195), которые утрачивали способность специфически накапливаться в ядрышках и располагались как в ядрышках, так и в ядрах клеток (Рис. ЗВ, Г), Анализ in silico предсказывает наличие в N-концевой области белков одного одинарного и двух перекрывающихся двойных NLS-сигналов (Табл, 1). Характер расположения фрагментов N- концевой области белка, слитых с EGFP, позволяет заключить, что условием для их специфической локализации в ядрышке клеток мыши является наличие всех NLS-сигналов, присутствующих в этой области белка. С целью экспериментального выявления сигнальных последовательностей в С- концевом консервативном домене SURF-6, предсказанных анализом in silico, мы создали плазмидные конструкции, кодирующие мутантные формы этого домена, маркированные EGFP. Использование конструкций для трансфекции клеток показало, что SURF-6 домен, полностью отсутствующий у одного химерного белка (Рис. 8Б) или частично укороченный у другого (Рис. 8К), не оказывает заметного влияния на адресную доставку химерных белков в ядрышки. Анализ внутриклеточной локализации продуктов экспрессии конструкций GFP mSURF6(198-355), GFP mSURP6(2S8-355) и GFP mSURF6(318-355) показал, что химерные белки накапливаются не только в ядрышках, но и ядрах трансфецировашшх клеток (Рис. 8 Д-Ж). Дальнейшее укорочение SURF-6 домена приводило к тому, что химерные белки помимо ядра и ядрышка начинали выявляться в цитоплазме (плазмида GFP mSURF6( 198-318); Рис. 8 3) или только в цитоплазме (плазмида GFP mSURF6(198- 287); Рис. 8 И). Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что SURF-6 домен обладает меньшим потенциалом к локализации в ядрышках (Рис, 8 Д-И), чем N-концевая часть молекулы SURF-6 (Рис. 8Б-Г). Можно также заключить, что эффективность локализации частей белка SURF-6 в ядрышках клеток характеризуется не количеством NLS- сигналов в первичной структуре белка, а их пространственной доступностью и биологической приоритетностью (функциональной значимостью). Действительно, присутствие только консервативного SURF-6 домена, который содержит четыре NLS- сигнала, не является достаточным условием для его избирательной локализации в ядрышках, тогда как N-концевая область, содержащая меньшее количество NLS-сигналов, полностью удовлетворяет этому условию. Из литературных данных известно, что участки белковых молекул, отвечающие за транспорт белков в ядрышко, состоят, как и NLS-сигналы, из основных аминокислотных остатков и в большинстве случаев перекрываются с двойными NLS-сигналами ядерной локализации [116]. Говоря другими словами, наличие у ядрышковых белков двойных NLS-сигналов является условием, достаточным для их адресной доставки в ядрышки. В соответствии с этими данными, способность участков молекулы SLJRF-6 мигрировать в ядро сопровождалась их накоплением в ядрышках.
В тех случаях, когда транспорт белков не связан с наличием двойных NLS-сигналов в первичной структуре белков, выраженная ядрышковая локализация обеспечивается функциональными белковыми доменами, включая домены, обеспечивающие связь белка с (р)РНК [117,118]. Наличие функционального домена является необходимым условием для ядрышкового транспорта большинства мажорных белков ядрышка, включая нуклеолин [70], В23/нуклеофозшш [72] и фибрилларин [71]. Сигнальные последовательности в первичной структуре были также обнаружены нами в белках SURF-6 у D. melanogaster и дрожжей S. pombe (Табл. 1, Рис. 8). Как видно из рисунка 8, большинство определенных in silico NLS-сигналов содержится в консервативных SURF-б доменах, хотя двойные NLS-сигналы присутствуют также в N-концевых областях белков. Принимая во внимание способность этих белков мигрировать в ядрышки клеток мыши, можно предположить, что, возможный механизм ядрьшжовой локализации для белков семейства SURF-6 является эволгоционно консервативным. Весьма вероятно, что за локализацию белков SURF-б в ядрышках отвечают N-концевые части их молекул. Наличие в консервативном SURF-б домене двойных перекрывающихся NLS-сигналов, составляющих от 20 до 45 % последовательности SURF-6 домена различных видов, является характерным свойством белков семейства SURF-б (Рис. 6, 9). Как показано более чем для 79 % проанализированных белков ядра и ядрышка с известными функциями, NLS-сигналы входят в состав или непосредственно примыкают к белковым доменам, отвечающим за ДНК- и (или) РНК-связывающие свойства белковых молекул [119]. Принимая во внимание эти данные, а также способность SURF-б мыши взаимодействовать с РНК in vitro [В] л in situ (см. ниже), можно предположить, что связь SURF-б с нуклеиновыми кислотами осуществляется с участием SURF-б домена. Если это предположение справедливо, SURF-6 домен может быть отнесен к новому семейству белковых доменов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, поскольку, как указывалось выше, он ие обнаруживает структурной гомологии с известными белковыми мотивами, взаимодействующими с РНК или ДНК [120-122]. 3.5 Анализ взаимодействия SURF-6 мыши с РНК и ДНК ядрышка in situ Одним из известных свойств белка SURP-б мыши является его способность взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами в бесклеточной системе, т.е. in vitro. При этом сродство SURF-6 к одноцепочечным нуклеиновым кислотам (РНК) оказывается почти на два порядка выше, чем к двухцепочечным нуклеиновым кислотам (ДНК), добавленным в инкубационную смесь, содержащую рекомбинантный белок [7].
Определение белков, взаимодействующих с SURF-6 доменом
Одно из направлений работы было посвящено поиску возможных белковых партнеров SURF-6 в клетках NIH/3T3 in vitro методом аффинной хроматографии. В качестве лиганда мы изначально планировали использовать две рекомбинантные формы белка - полноразмерный SURF-6, слитый с глутатион-5-трансферазой (GST) (SURF-6/GST) и консервативный SURF-6 домен, слитый с GST (SURP-6 домен/GST). Ожидалось, что использование GST позволит выделить рекомбинантные белки из бактерий в недепатурирующих условиях, а затем иммобилизовать их на глутатиои-сефарозе для проведения дальнейших экспериментов. Получение рекомбинантных белков в бактериальной системе предполагало использование двух плазмид, кодирующих полноразмерный SURF-б мыши и его консервативный SURJF-6 домен (Рис. 6); слитые с GST, Для создания таких плазмид с помощью подобранных и синтезированных праймеров из библиотеки кДНК мыши М. nmsciiius были амплифицированы последовательности ДНК, соответствующие кДНК Surf-6 и его консервативному домену. Полученные амплифицированные фрагменты ДНК были встроены в коммерческий вектор pGEX-2T, позволяющих осуществлять их экспрессию в Е. соН. В ходе выполнения работы нами также была разработана методика выделения и очистки рекомбинантных белков SURF-6/GST (Рис. 22) и SURF-6 домен/GST (Рис. 23) в неденатурирующих условиях. Бактерии Е.соН штамма BL21-Codon-Plus ("Stratagene", США) трансформированные полученными плазмидами, инкубировали в среде с индуктором 1PTG в течение 4 часов при комнатной температуре, разрушали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил) амииометана (рН 7,5), 150 мМ NaCl с добавлением 1 мМ PMSF и коктейля протеазных ингибиторов для бактерий ("Sigma", США). Бактериальные клетки разрушали на льду с помощью ультразвукового дезинтегратора и к полученной суспензии добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 0.5 %. Суспензию центрифугировали и к полученному супернатанту добавляли NaCl до конечной концентрации 4М. Полученные фракции, содержащие растворимые бактериальные белки, инкубировали в течение двух часов с глутатион-сефарозой. После стадий последовательных промывок рекомбинантные белки SURF-6/GST и SURF-6 домен/GST конкурентно элюировали с аффинных колонок раствором 10 мМ L-глутатиона.
Элюаты разделяли с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях, белки переносили на нитроцеллюлозиую мембрану в стандартных условиях и проявляли антителами к SURP-6. Результаты представлены на Рис. 22 и Рис. 23. Как видно на Рис. 22, белок SURF-6/GST подвергался сильной деградации или неполному синтезу в бактериях, что проявлялось в наличии нескольких «легких» полос, расположенных под полосой в районе 43 кДа, которая соответствовала полноразмерному SURF-6 (полипептиды с электрофоретической подвижностью менее 43 кДа указаны звездочками). Несмотря на попытки предотвратить появление продуїо ов экспрессии с малой молекулярной массой, добиться желаемого результата нам не удалось и поэтому от использования рекомбинантного белка SURF 6, слитого с GST, для последующего использования в качестве аффинного лиганда мы решили отказаться. В то же время, рекомбинантный белок SURF-6 домен/GST удалось успешно наработать и очистить (Рис. 23). Для выявления белковых партнеров SURF-6 в клетках NIH/3T3 мы использовали экстракты, обогащенные ядерными и ядрышковыми белками. Особенностью разработанной методики приготовления таких экстрактов являлся этап обогащения фракции белками, прочно связанными с клеточной ДНК и РНК in vivo, что достигалось с помощью последовательных обработок клеток ДНКазой I и РНКазой А, условия которых описаны в разделе «Экспериментальная часть». После обработок ферментами, белки экстрагировали путем последовательных экстракций в условиях повышения концентрации NaCl. Затем экстракты преинкубировали с глутатион-сефарозой в течение 2-х часов. Эта стадия позволила исключить белки экстракта, неспецифически взаимодействующие с сорбентом. Экстракты, обогащенные ядерными и ядрышковыми белками, хроматографировали на колонке, содержащей иммобилизованный на глутатион-сефарозе рекомбинантный SURF-6 домен/GST. В контрольных опытах на колонке иммобилизовали рекомбинантный GST, наработанный в бактериях E.coli, трансформированных вектором pGEX-2T без вставки. После инкубации и последующих стадий отмывок рекомбинантный SURF-6 домен/GST, GST (контрольный эксперимент) и взаимодействующие с ними белки, были конкурентно элюированы с носителя раствором 10 мМ L-глутатиона. Смытые белки разделяли гель-электрофорезом в 12% ПААГ и окрашивали в геле коллоидным раствором Coomassie blue G-250. Эксперименты были повторены дважды, их результаты были одинаковыми. Результаты одного из экспериментов представлены иа рис. 23. Как видно из рисунка, на опытной дорожке отчетливо выявляются восемь основных полос, на контрольной - до трех полос (Рис. 23). Полосы аккуратно вырезали из геля, обрабатывали трипсином и полученные пептидные фрагменты анализировали с помощью MALDIOF масс-спектрометрии в НИИ БМХ им. В.Н. Ореховича РАМН. М - белковые маркеры; гель-электрофореграмма в 12% ПААГ суммарных белков, полученных из культуры бактерий до индукции экспрессии (1) и после 4-х часовой индукции IPTG (2); 3 - рекомбинантный белок SURF-6/GST, аффинно-очищенный на глутатион-сефарозе; 4 - иммуноблоттинг рекомбинантного белка SURF-6/GST с использованием поликлональных антител кролика к белку SURF-6.
Стрелкой указан продукт экспрессии, соответствующий 68.4 кДа. Звездочками обозначены мажорные продукты распада рекомбинантного белка. 1-3 - фотографии гелей после электрофореза белков, окрашенных Coomassie blue G-250; 4 отсканированное изображение рентгеновской пленки после проведения иммуноблоттинга. Белковые маркерные полосы указаны в кДа справа от изображения; цифрами от 1 до 8 обозначены белковые полосы, которые подвергли гидролизу трипсином, а затем - масс-спектрометрическому анализу полученных пептидных фрагментов. Справа указаны положения белковых маркеров. Семь из восьми подготовленных для масс-спектрометрического анализа белковых образцов были впоследствии идентифицированы с помощью программы Matrixscience, которая на основании значений М/Мг позволяет идентифицировать белок. Белки, содержащиеся в полосах с 6-ой по 8-ую, соответствовали продуктам деградации (и) или вероятного неполного синтеза рекомбинантного белка SURF-6 домен/GST в бактериях. Белок из полосы под номером 5 является рекомбинантным белком SURF-6 домен/GST, т.е. основным продуктом экспрессии клонированного в плазмиду фрагмента кДНК Surf-6, кодирующего SURF-6 домен. Белковая полоса под номером 4 соответствовала бактериальному белку теплового шока Hsp70, который, взаимодействует с рекомбинантными белками, продуцируемыми в E.coli. Белок под номером 2 не был идентифицирован. Пептидные фрагменты, полученные при трипсинолизе 1-ой белковой полосы геля, принадлежали белку р107 мыши (Табл. 2). Определенные пептиды являлись характерными только для р107 и перекрывали 12 % полной последовательности белка р107. Белок р107 (или RBL1) вместе с белками pRb и р130 относится к семейству ретинобластомных белков, принимающих активное участие в регуляции клеточной пролиферации и клеточного цикла [ 149-154 ], Согласно литературным данным, белки pRb и р130 сверхэкспрессированы в раковых клетках человека [155]. Они влияют на транскрипцию рибосомных генов, регулируя активность РНК полимеразы I [156], и взаимодействуют in vivo с мажорными белками ядрышка, включая специфический кофактор РНК полимеразы IUBF [157] и В23/нуклеофозмин [158]. На сегодняшний день известно, что белок р107 (подобно другим белкам ретинобластомного семейства) взаимодействует с транскрипционным фактором E2F и с циклин-зависимой киназой CDK2 [ 159].
