Содержание к диссертации
Введение
2. Список сокращений 5
3. Литературный обзор 7
3.1. Строение реакционных центров пурпурных бактерий 8
3.2. Роль аминокислотных остатков белковой матрицы, как аксиальных лигандов кионуМд бактериохлорофиллов 13
3.3. Участие аминокислот в образовании водородных связей с кофакторами 22
3.4. Электростатические взаимодействия белка с пигментами 37
3.5. Заключение 44
3. Результаты работы и их обсуждение 46
3.1. Синтез производных дейтеропорфирина IX, содержащих один или два аминокислотных остатка 47
3.2. Синтез модельных триадных систем 54
3.3. Исследование фотохимических свойств синтезированных соединений 62
4. Экспериментальная часть 71
Выводы 87
Список литературы 88
- Роль аминокислотных остатков белковой матрицы, как аксиальных лигандов кионуМд бактериохлорофиллов
- Электростатические взаимодействия белка с пигментами
- Синтез модельных триадных систем
- Исследование фотохимических свойств синтезированных соединений
Введение к работе
Актуальность работы. В связи с ростом потребности человечества в энергии и уменьшением запасов природных горючих ископаемых актуальной проблемой становится поиск новых источников энергии. Солнечная энергия представляет собой один из наиболее экологически чистых источников энергии, а ее резервы значительно превышают энергетические потребности общества, поэтому концепция ее использования вызывает в настоящее время все больший интерес. Зеленые растения и бактерии в ходе фотосинтеза поглощают солнечную энергию и преобразуют ее в химическую форму. В основе этого явления лежат фотоиндуцируемые процессы переноса энергии между тетрапиррольными пигментами и последующего многостадийного переноса электрона от фотовозбужденных тетрапиррольных доноров к хиноновым акцепторам с образованием состояния с разделенными зарядами. Усилия многих исследовательских групп направлены на разработку и создание молекулярных фотокаталитических систем, способных, подобно растениям и фотосинтезирующим бактериям, преобразовывать энергию солнечного излучения в энергию химических связей. В искусственных системах в качестве фоточувствительных пигментов вместо хлоринов часто используют порфирины, родственные им, что обусловлено их большей устойчивостью к физико-химическим воздействиям и синтетической доступностью.
В природных фотосинтетических системах компоненты, участвующие в формировании состояния с разделенными зарядами, окружены молекулами белков. Современные исследования подтверждают участие полипептидных цепей в формировании оптимальных условий процесса первичного разделения зарядов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ароматические аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин и триптофан, осуществляют электронное взаимодействие д-орбиталей донора и акцептора, расположенных на достаточно большом расстоянии друг от друга, таким образом ускоряя реакции электронного переноса. Включение этих аминокислот в искусственные фотопреобразующие системы, способные давать состояние с разделением зарядов, позволяет выяснить факторы, влияющие на эффективность процессов переноса энергии и электрона. Поэтому синтез и исследование структурно-организованных комплексов, содержащих связанные с фотосинтетическими пигментами ароматические аминокислоты, имеет большой научный и практический интерес.
Работа была выполнена в рамках программ научных исследований Министерства образования РФ, проводимых в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.ЛомрйЭСОМЦЙОИф9Й|&ОДЫмии И
\ ^^
технологии тонких органических соединений по теме № 1Б-3-865 «Химический и микробиологический синтез биологически активных соединений, моделирующих процессы энергопереноса и биорегуляции», а также при поддержке фантов РФФИ (руководитель - чл.-корр. РАН Евстигнеева Р.П.) № 97-03-33158а, № 00-03-32872а, «Ведущие научные школы» № 96-15-97709, № 00-15-97866, НШ-2013.2003.3.
Цель работы. Диссертационная работа посвящена синтезу модельных соединений на основе дейтеропорфирина IX двух типов: молекулярных диад, содержащих ароматические (Phe, Туг, Тгр) аминокислотные остатки, а также трехкомпонентных систем — триад, включающих остаток ароматической аминокислоты, порфирин и хиноновую компоненту; изучению физико-химических и фотохимических свойств этих соединений с целью исследования возможности использования ароматических аминокислот в искусственных фотопреобразующих системах.
Научная новизна. В процессе работы осуществлен синтез ранее неописанных соединений, содержащих дейтеропорфирин IX и ароматическую аминокислоту. Получены новые триадные системы, состоящие из аминокислотного, порфиринового и хинонового фрагментов. Изучены физико-химические и фотохимические свойства полученных соединений. Спектрально-флуоресцентные и кинетические исследования выявили наличие эффективного переноса энергии от аминокислоты к порфирину. Введение ароматической аминокислоты в состав триад вызывает увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни возбужденного состояния дейтеропорфирина по сравнению с диадой, содержащей порфирин и хинон. Показано, что полученные соединения способны моделировать процессы переноса энергии и электрона.
Практическая ценность работы. Синтезированные системы могут найти применение в разработке и создании наноразмерных фотогальванических устройств для молекулярной электроники и нанотехнологии. Нанесение триад на поверхность электродов позволит модифицировать их электро или фотоэлектрокаталитические свойства. Полученные соединения также могут быть использованы в качестве фотокатализаторов для окисления органических субстратов.
На защиту выносятся следующие положения.
1. Синтез производных дейтеропорфирина IX, содержащих ароматические
аминокислотные остатки.
2. Синтез триадных систем, включающих порфирин, хинон и ароматическую
аминокислоту.
3. Изучение фотохимических свойств полученных соединений.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 8 докладов.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1999), на Школе-конференции молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на XIII Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001), на III Съезде Фотобиологов России (Воронеж, 2001), на III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на XXIV Научной сессии Российского семинара по химии порфиринов и их аналогов (Иваново, 2003), на IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003) и на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003).
Роль аминокислотных остатков белковой матрицы, как аксиальных лигандов кионуМд бактериохлорофиллов
Во всех известных бактериальных реакционных центрах остатки гистидина- служат аксиальными лигандами центрального атома. Мд бактериохлорофиллов [19-21, 50], поэтому важно оценить их роль в формировании условий для переноса электрона (направленности переноса вдоль области А, скорости разделения и рекомбинации зарядов, величины окислительно-восстановительного потенциала ионной пары Р/Р+ и т.д.).
Для этого были использованы мутантные РЦ, в которых отсутствуют остатки гистидина в положениях, удобных для координации атомов Мд бактериохлорофиллов. На примере Rb.sphaeroldes и Rb.capsulatus проведен ряд исследований [36, 39, 51-56], в которых один из остатков гистидина, связанного с атомом Мд бактериохлорофилла PL или Рм, замещали на лейцин.
Как в случае мутантов по L ряду, так и по М ряду, происходило формирование так называемого гетеродимера D, состоящего из бактериохлорофилла и бактериофеофитина. В той части, где производили замену остатка гистидина, при сборке РЦ вместо бактериохлорофилла в белковую матрицу встраивался бактериофеофитин [31]. Спектроскопические [53, 55-56] и электронные [51, 52] свойства первичного донора в основном и окисленном состояниях сильно изменяются в реакционных центрах мутантных штаммов бактерий. Методами Раман-спектроскопии и динамической абсорбционной спектроскопии показано формирование состояния [Бхлф+ Бфео! в результате возбуждения первичного донора D в мутантных РЦ. В спектре кинетики поглощения появляется широкая, но хорошо разрешенная полоса между 600 и 700 нм, соответствующая тетрапиррольному аниону, которая не наблюдается в спектре димера Р природных РЦ. Этот факт наряду с данными о том, что Бфео восстанавливается легче, чем Бхлф (потенциалы восстановления 500 и 700 мВ в ДМФ, соответственно) [57], доказывает формирование состояния [Бхлф Бфео . Максимум полосы поглощения для аниона [Бхлфрі/Бфеорм-] находится при 655 нм, а для [Бхлфрм+БфеоР. — при 675 нм, т.е. происходит смещение полосы поглощения бактериофеофитина гетеродимера D относительно полосы поглощения аниона промежуточного Бфео при 665 нм, что отражает различное белковое окружение этих пигментов [53].
Проводилось исследование первичных фотохимических процессов в РЦ мутантных штаммов Rb.sphaeroides HL (М202), HL (L173) [53] и Rb.capsulatus HL{M200) [54]#. Во всех образцах наблюдалось уменьшение квантового выхода флуоресценции по сравнению с природными РЦ. Схема первичных фотохимических реакций в двух реакционных центрах из Rb.sphaeroides, содержащих Бхлф/Бфео гетеродимер, представлена на рисунке 5 и может быть сопоставлена с фотохимическими процессами в РЦ природного типа (рисунок 1).
Однако, как показали исследования, скорость электронного переноса от Р не настолько чувствительна к энергетике процесса. Например, замещение лейцина (находится в положении L214 в РЦ Rb.sphaeroides и L212 в РЦ Rb.capsulatus и Rps.viridis), находящегося вблизи атомов азота Бфеоь (рисунок 6), на гистидин приводило к встраиванию бактериохлорофилла (обозначаемого в литературе как (3) вместо бактериофеофитина [31, 59].
Авторы статьи [53] выдвинули другую гипотезу, согласно которой замедление процесса восстановления Бфеоь в мутантн ых реакционных центрах происходит вследствие уменьшения орбитального взаимодействия первичного электронного донора с Бфеоь и/или Бхлфь в гетеродимерах. Что касается увеличения скорости перехода первичною донора в основное состояние, то этот процесс является следствием увеличения электронной асимметрии промежуточного состояния [Бхлф+ Бфео в гетеродимере, в котором весь положительный заряд делокализован на Бхлф, в отличие от природных штаммов, где электронная плотность неспаренного электрона распределена на обеих Р_ и Рм половинах окисленного донора.
Несмотря на значительное уменьшение скорости первичного процесса переноса заряда, во всех мутантах сохранялась направленность переноса электрона вдоль области L При замещении остатков гистидина в РЦ Rb.sphaeroides на глицин, менее объемный по сравнению с лейцином [63], во всех трех мутантах HG(M202), HG{L173) и HG(M202)/HG(L173) собиралась нормальная пара первичного электронного донора, включающая два бактериохлорофилла. Окислительно-восстановительные потенциалы Р/Р\ измеренные для мутантных протеинов, незначительно изменяются (494, 511 и 495 мВ, для РЦ HG{M202), HG(L173) и HG(M202)/HG(L173), соответственно) по сравнению с величиной 505 мВ для первичного электронного донора в реакционных центрах природного типа. Скорость рекомбинации P "QA и ее температурная зависимость для измененных РЦ отличаются не более чем на 15% от соответствующих характеристик природных РЦ. Времена жизни медленной и быстрой компонент затухания флуоресценции Р для мутантных реакционных центров увеличиваются на 20-35% и 50-100%, соответственно, в то время как их относительные амплитуды не изменяются.
Электростатические взаимодействия белка с пигментами
Изменения в окислительно-восстановительном потенциале Р/Р+ первичного электронного донора могут происходить не только в результате участия его карбонильных групп в водородных связях с аминокислотными остатками белка. Замещения аминокислот, которые не приводят к формированию водородной связи, так же могут изменять физико-химические свойства первичного электронного донора [58, 81]. В таблице 8 приведены данные, полученные при замене аминокислотных остатков близких к Р: Phe L167, Leu М156 и Leu М196 .
Самое большое изменение окислительно-восстановительного потенциала наблюдается при замещении на гистидин, в то время как замена на другие аминокислоты приводит к увеличению ОВП в пределах 30 мВ. Данные Раман спектроскопии показывают, что введенные аминокислотные остатки не участвуют в формировании водородной связи с карбонилами бактериохлорофиллов первичного электронного донора, но воздействуют на распределение положительного заряда на окисленном димере Р+ . Отношение между «+» и окислительно-восстановительным потенциалом зависит от положения измененного аминокислотного остатка.
В работе [81] проводилось исследование скорости тушения флуоресценции Р и рекомбинации зарядов в реакционных центрах мутантных HF(L168) и FL(L167) и природного штаммов Rb.sphaeroides (таблица 9). В обоих случаях FL{L167) и HF(L168) наблюдается сдвиг Qy полосы Р на 15нм в коротковолновую область спектра, что соответствует увеличению разницы в энергиях между Р и Р состояниями на 25 мэВ и, соответственно, движущей силы процесса ФПЭ, В FL(L167) РЦ это компенсируется поднятием ОВП Р/Р+ на 25 мВ, поэтому следовало ожидать что скорость разделения зарядов в этом РЦ не изменится. Однако, несмотря на то, что величина движущей силы процесса переноса электрона такая же, как в РЦ природного штамма, наблюдается увеличение времени тушения флуоресценции Р до 5 пс, по сравнению с почти не изменяющейся скоростью этого процесса в HF(L168) РЦ.
В данном случае влияние оказывают специфические взаимодействия между аминокислотными остатками белка и бактериохлорофиллами димера Р: более общие эффекты, такие как местная диэлектрическая константа, определяемая белковым окружением бактериохлорофиллов. Окисленное состояние первичного электронного донора может стабилизироваться за счет электростатических взаимодействий между Р и окружающими аминокислотными остатками. Например, в FL(L167) РЦ ароматическая аминокислота фенилаланин, способная участвовать в стабилизации окисленного димера бактериохлорофиллов Р заменена на алифатический, гидрофобный остаток лейцин, что приводит к повышению свободной энергии состояния с разделением зарядов P+QA на величину пропорциональную увеличению потенциала окисления Р (25 мВ).
Такую же роль, возможно, выполняет остаток фенилаланина, обнаруженный рядом с Бфеоі. [60, 86, 87]. Phe в положении 121 белковой субъединицы L находится на достаточном расстоянии от бактериофеофитина, чтобы участвовать в п-л взаимодействиях с его кольцом V .
При замещении остатка фенилаланина L121 на алифатическую аминокислоту лейцин, происходило ускорение переноса электрона от Бфеоі. к хинону. Вероятно, ароматическое кольцо Phe оказывает дестабилизирующее влияние на отрицательно заряженный бактериофеофитин, замена которого на алифатический остаток приводит к повышению свободной энергии состояния Р+Бфеоі." , увеличивая таким образом движущую силу процесса переноса электрона на QA [86]. Проводились исследования [60, 87], в которых вводили полярную аспарагиновую кислоту вместо ароматического остатка фенилаланина L121. Присутствие Asp вызывало ускорение процесса переноса электрона от промежуточного акцептора на хинон, но при этом замедлялся процесс восстановления Бфеоь а квантовый выход формирования состояния с разделением зарядов P+QA уменьшался до 80% по сравнению со 100% выходом в реакционных центрах природного и FL(L167) штаммов. В этом случае изменение кинетики первичного процесса также обусловлено дестабилизацией резонансных форм восстановленного Бфеоь" за счет присутствия рядом с его кето-группой при Сэ атоме заряженного остатка аспарагиновой кислоты. Как предполагают, аминокислота находится в депротонированной форме и отрицательно заряжена.
Аналогичное воздействие на первичную фотохимию оказывало введение в РЦ Rb.capsulatus вместо глицина М201 (в РЦ ЙЬ. sphaeroides М203) остатка аспарагиновой кислоты [42, 60, 62, 80] (рисунок 6). Атомы кислорода ее боковой цепи оказываются на расстоянии 3-5 А от карбонильных групп кольца V Бхлфц. Присутствие остатка аспарагиновой кислоты вызывает увеличение времени жизни возбужденного состояния первичного донора Р почти в три раза. Это объясняется увеличением свободной энергии состояния Р+ Бхлфі. . Если бы формировалась водородная связь между карбонилом кольца V Бхлфц и аминокислотой, потенциал восстановления Бхлф!_ уменьшался и, следовательно, уменьшалась энергия промежуточного состояния Р+ Бхлфь—. Однако ведение Asp вызывает увеличение частоты колебания карбонила при С9 атоме на 7 см 1, что опровергает предположение о формировании водородной связи между боковой цепью аминокислоты и кето-группой пигмента [63, 88].
Тирозин L162 локализован между первичным донором Р и цитохромом Сг (рисунок 14) и участвует в процессе восстановления окисленного первичного донора Р вторичным донором — цитохромом (цит.) Сг [89]. Это мультифазный процесс, состоящий из трехфаз: быстрой, медленной и очень медленной, соответствующих трем различным состояниям взаимодействия первичного электронного донора и цитохрома [89-91].
Для исследования роли тирозина L162 в восстановлении окисленного первичного донора было сконструировано пять мутантов Rb. sphaeroides, в которых аминокислота заменялась на фенилаланин, серии, лейцин, метионин и глицин. Исследование кинетики восстановления фотоокисленной специальной пары физиологическим донором цит. Сг проводилось на интактных растущих клетках. Измерение показало, что во всех мутантах отсутствовала быстрая фаза и общая кинетика восстановления окисленного электронного донора Р+ была значительно медленнее [89]. Скорость электронного переноса от цит. С2 к димеру Р+ , контролируется расстоянием между ними и разницей их свободных энергий. Увеличение окислительно-восстановительного потенциала Р/Р+" приводит к большей величине свободной энергии (AG) реакции восстановления Р\ Однако, для того, чтобы происходило значительное изменение в скорости переноса электрона к окисленному первичному донору, потенциал должен измениться не менее чем на 500 мВ [92], поэтому исследователи [89, 90] пришли к выводу, что тирозин в этой позиции влияет на равновесие процессов связывания и переориентации между цитохромом Сг и первичным электронным донором, контролируемых электростатическими взаимодействиями между ними. Замена Туг на алифатическую или менее полярную (как фенилаланин) аминокислоту нарушает равновесие, что приводит к более слабому взаимодействию пигментов и, следовательно, замедлению процесса восстановления окисленного первичного электронного донора цитохромом Сг Другая пара аминокислотных остатков, участвующих в переносе электрона от фотовозбужденного первичного электронного донора Р к хинонам, — Туг (М210) и Phe (L181) —обнаружена в Ftps, viridis, Rb. capsulatus (Tyr(M208) в этих штаммах), Rb. sphaeroides и Rhodospirillum rubrum [39, 93, 94]. Данные аминокислотные остатки расположены близко как к Р, а так и к мономерному Бхлф и Бфео на активной и, соответственно, неактивной в электронном переносе областях и, следовательно, могут быть вовлечены в электростатические взаимодействия с пигментами (рисунок 1). Таким образом, аминокислоты находятся в ключевой позиции в РЦ, чтобы оказывать влияние на свойства тетрапиррольных пигментов. Удаление Туг (М210) в Rb. sphaeroides приводит к сдвигу максимума поглощения мономерного Бхлф (при 800нм) на 2-3 нм в длинноволновую область спектра [40].
Синтез модельных триадных систем
Анализ литературных данных показывает, что большинство искусственных систем типа донор-акцептор (Д-А), моделирующих процессы фотоиндуцированного переноса электрона, основаны на использовании в качестве доноров электрона тетрапиррольных соединений (порфирины, хлорины, фталоцианины) и акцепторов электрона хиноновой природы [8, 10, 101, 102, 113, 114, 118-125]. Выбор хинона в качестве электронного акцептора обусловлен его принципиальной ролью в цепи разделения зарядов в реакционных центрах in vivo. Константы скорости переноса электрона, полученные для моделей, содержащих тетрапиррольный хромофор и хинон, наиболее близки значениям, найденным для природных реакционных центров. Однако диады порфирин-хинон имеют серьезный недостаток, состоящий в протекании быстрой реакции рекомбинации зарядов с образованием основного состояния.
В фотосинтетических реакционных центрах высокоэффективное разделение зарядов достигается за счет многоступенчатого фотоиндуцируемого переноса электрона (ФПЭ) через ряд донорных и акцепторных фрагментов. Поэтому введение дополнительного донора в систему Д-А позволяет увеличить время жизни состояния с разделенными зарядами за счет протекания переноса электрона от вторичного донора на окисленный порфириновый фрагмент, в результате чего положительный заряд перемещается на большее расстояние от хинонового анион-радикала. При создании систем, способных к переносу электронов и энергии, в качестве вторичных доноров электронов использовались каротиноиды, ароматические и алифатические амины [115, 116, 126-128], Поскольку фотоактивные пигменты природных фотосинтетических систем включены в белковую матрицу, отдельные аминокислотные остатки которой принимают участие в определении направленности и эффективности ФПЭ, введение в модельную систему донор-акцептор остатка ароматической аминокислоты позволит исследовать влияние аминокислот на скорость и эффективность электронного переноса. С этой целью были синтезированы триадные системы, включающие дейтеропорфирин IX, хинон и ароматическую аминокислоту.
В качестве акцептора электрона был выбран 2-(2-гидроксизтил)тио-3-метил-1,4-нафтохинон. Было показано [129], что нафтохинон, содержащий атом серы, обладает высокой электроноакцепторной активностью, которая характеризуется полярографическим потенциалом полуволны восстановления исходного нафтохинона Ei/2=-0.74 эВ. Кроме того, серосодержащие производные способны формировать стабильные монослои на поверхности металлических электродов за счет хемосорбции, что позволяет получать электроды с направленными электро- или фотоэлектрокаталитическими свойствами [130].
Синтез триады XVI (схема 4) проводили последовательным присоединением к дейтеропофирину IX (II) сначала донорного, а затем акцепторного фрагмента [1311. Для введения остатка фенилаланина СООН-группу порфирина активировали пивалоилхлоридом, применение которого позволяет повысить выход монопроизводного XIV [132]. В ходе реакции образовывались моно- (XIV) и дипроизводное III, которые были разделены препаративной ТСХ на силикагеле. Выходы продуктов XIV и III составили 24 и 27% соответственно. Последующая конденсация аминокислотного производного дейтеропорфирина XIV, активированного ВосгО, с 2-(2-гидроксиэтил)тио-3-метил-1,4-нафтохиноном привела к триаде XVI (выход 15%). смешанных ангидридов [119], используя для активации СООН группы пивалоилхлорид. В ходе синтеза соединение XV образовывалось в виде смеси изомеров по 13- и 17-положениям порфиринового макроцикла. Проведенные исследования соединения XV с помощью спектроскопии ЯМР Н показали сдвиг протонов хиноновои части на 0.6-1.0 м.д. в область сильного поля, что свидетельствует о взаимодействии порфиринового и хинонового фрагментов [113, 119]. Затем соединение XV вводили в конденсацию с метиловыми эфирами ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана, — активируя свободную карбоксильную группу порфирина системой ВосгО-пиридин. Соединения XVI, XVII, XVIHa после хроматографической очистки были выделены с выходом 53, 38 и 31%, соответственно.
Структура полученных триад XVI-XVIII подтверждена данными электронной, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
Данные ИК-спектров триад указывают на образование амидной связи между порфирином и аминокислотой и сложноэфирной связи между порфирином и хиноном. В ИК-спектре монопроизводного (XIV) наблюдалось сильное поглощение в области 1608 см-1, перекрывавшее область валентных колебаний карбонильной группы амидной связи. Эта полоса, вероятно, соответствует ионизированной в результате взаимодействие с атомами азота порфиринового кольца форме карбоксильной группы [131,133].
Известно, что на эффективность процесса разделения зарядов существенным образом влияет не только величина окислительно-восстановительного потенциала, но и взаимная ориентация донора и акцептора, а также расстояние между ними. В связи с этим представляется важным изучение пространственной организации молекул синтезированных триад. Данные спектроскопии ЯМР не только подтверждают структуру полученных соединений, но и позволяют сделать предварительные выводы о взаимном расположении трех хромофоров, входящих в состав молекул.
В спектрах ЯМР 1Н триад XVI и XVII наблюдаются сдвиги (-0,5 м.д.) сигналов протонов хиноновои части молекул и ароматических протонов остатков фенилаланина и тирозина в область сильного поля по сравнению со спектрами соединений, не связанных с порфириновым макроциклом. Как и в случае диад III, IV, VII и VIII, это обусловлено приближением остатков аминокислот и хинона к центру плоскости порфирина на расстояние, достаточное для действия магнитного поля кольцевого тока, возникающего в тетрапиррольном хромофоре при помещении образца во внешнее магнитное поле [134].
Исследование фотохимических свойств синтезированных соединений
Для исследования фотохимических свойств синтезированных соединений были проанализированы их спектры поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресценции, а также измерены времена жизни возбужденных состояний методом импульсной флуориметрии.
Спектры эмиссии флуоресценции синтезированных соединений были измерены при облучении их растворов в хлороформе в область полосы Соре дейтеропорфирина (ХВОзб - 400 нм)\ Были определены относительные квантовые выходы флуоресценции диад и триад, содержащих остатки фенилаланина, тирозина и триптофана. При этом квантовый выход флуоресценции диметилового эфира дейтеропорфирина IX (I) принимали равным единице. В диадах Ill-Va, Vll-IXa и XIII, содержащих один или два
Работа проведена при участии сотрудников группы проф. Пащенко В.З. на кафедре Биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. аминокислотных остатка, параметры флуоресценции порфириновой субъединицы (квантовый выход и длительность флуоресценции) практически совпадают с характеристиками индивидуального порфирина I.
Особый интерес в ряду ароматических аминокислот представляет триптофан: он наиболее активно участвует в разнообразных фотофизических и фотохимических реакциях и его вклад в спектры люминесценции белков является доминирующим. Кроме того, триптофан обладает наиболее интенсивным поглощением среди ароматических аминокислот [135J. Высокая интенсивность поглощения и флуоресценции триптофана облегчает измерение спектральных параметров модельных систем в УФ области спектра. Поэтому в ходе работы более детально были изучены пути, .механизмы и скорости релаксационных процессов в соединениях, содержащих ковалентно присоединенный к порфирину остаток триптофана. Известно [135], что добавление различных тушителей приводит к снижению интенсивности флуоресценции ароматических аминокислот в составе белков. Поскольку электронное возбужденное состояние Тгр лежит выше St-состояния порфирина (рисунок 22), может происходить перенос энергии от аминокислоты к дейтеропорфирину при облучении в ее полосу поглощения.
Для того чтобы выяснить, какой вклад в эмиссию акцептора (Dp IX) вносят составляющие систему хромофоры, были получены спектры возбуждения флуоресценции диад Va и 1Ха (рисунок 23). Этот метод является общим для оценки эффективности энергетического переноса. Спектры возбуждения флуоресценции диад были измерены в тетрагидрофуране путем сканирования возбуждения от 250 до 600 нм с фиксированной эмиссией при 610 нм. Совпадение спектров возбуждения флуоресценции и поглощения диад Va и 1Ха подтверждает, что между дейтеропорфирином и триптофаном осуществляется эффективное энергетическое взаимодействие в возбужденном состоянии .
Присоединение к порфирину акцептора — 2-(2-гидроксиэтил)тио-3-метил-1,4-нафтохинона (соединение XV) - приводит к уменьшению квантового выхода флуоресценции и сопровождается сокращением длительности жизни Si-состояния порфирина. Это обусловлено известным явлением переноса электрона от порфиринового макроцикла к хинону [103, 118, 121]. Время дезактивации Si-состояния дейтеропорфирина в диаде XV и триаде XVIlia характерно для модельных систем, в которых компоненты связаны друг с другом либо за счет нековалентных взаимодействий, либо соединены гибким спейсером, в результате чего перенос электрона от донора к акцептору осуществляется через пространство [101,103,118,121],
Наблюдаемое уменьшение квантового выхода флуоресценции порфирина в составе триады XVIlia по сравнению с диметиловым эфиром дейтеропорфирина IX (I) свидетельствует о том, что в этом соединении также происходит внутримолекулярный перенос электрона от порфирина на хинон. Биэкспоненциальный характер затухания флуоресценции порфирина и слабое влияние полярности растворителя на значение квантового выхода можно объяснить конформационной динамикой молекулы XVIlia, обусловленной гибкостью ковалентного -СНг-СН2-СОО- спейсера. За счет этого в растворе реализуется несколько типов конформаций с варьируемыми расстояниями между взаимодействующими хромофорами от 7 до 18 Ат, что согласуется с данными спектроскопии ЯМР.
Аналогичные результаты были получены при исследовании фотохимических свойств триад XVI и XVII, содержащих Рпе и Туг. Введение остатка аминокислоты приводило к увеличению квантового выхода эмиссии флуоресценции дейтеропорфирина в триадах относительно диады порфирин-хинон XV (таблица 14), а также увеличению времени жизни синглетного возбужденного состояния порфирина.
Это может быть следствием изменения взаимной ориентации плоскостей порфирина и хинона при введении в триаду аминокислотного остатка. Известно, что вероятность переноса электрона пропорциональна квадрату косинуса угла между л орбиталями донора и акцептора электронов. Увеличение угла на 15-20" относительно наиболее выгодного расположения хромофоров приводит к уменьшению скорости переноса электрона в 1.5-2 раза и, соответственно, увеличению квантового выхода флуоресценции донора электронов-дейтеропорфирина. Помимо ориентационного фактора,, присутствие в окружении порфирина остатка ароматической кислоты приводит к изменению его окислительно-восстановительного потенциала и, таким образом, к изменению разности свободной энергии AG реакции разделения зарядов. Изменение AG может привести к уменьшению скорости разделения зарядов и к увеличению скорости рекомбинации ион-радикальной пары, что приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции. Также может изменяться энергия реорганизации среды для этой реакции, что также приводит к уменьшению скорости разделения зарядов и, соответственно, к увеличению квантового выхода флуоресценции.
Присутствие остатка ароматической аминокислоты в окрестности молекулы порфирина может изменять также внутримолекулярные константы дезактивации Si-состояния порфирина: константу скорости флуоресценции, константу тепловой конверсии и константу интеркомбинационной конверсии, оказывая влияние на силу осцилляторов перехода. В частности, может увеличиться вероятность перехода порфирина из Si в основное состояние за счет флуоресценции. Таким образом, увеличение квантового выхода флуоресценции порфирина в триадах, по сравнению с диадой порфирин-хинон XV, может являться результатом изменения внутри- и межмолекулярных констант дезактивации возбужденного состояния порфириновой части молекулы, либо следствием одновременного влияния обоих этих факторов, вызванного взаимодействием между аминокислотной, порфириновой и хиноновой компонентами триады вследствие гибкости связывающего их ковалентного спейсера.
