Содержание к диссертации
Введение
2. Протеолитические ферменты и способы регуляции их активности 9
2.1. Классификация протеолитических ферментов 10
2.1.1. Сериновые протеиназы 11
2.1.2. Химотрипсинподобные протеиназы: характеристика и физиологическая активность 12
2.2. Способы регуляции активности протеолитических ферментов 16
2.2.1. Зимогены - неактивные предшественники протеиназ 17
2.2.2. Регуляция активности протеиназ с помощью ингибиторов 19
2.2.2.1. Классификация ингибиторов протеиназ по механизму действия 22
2.2.2.2. Общая характеристика ингибиторов сериновых протеиназ 24
2.2.2.3. Пространственные структуры ингибиторов сериновых протеиназ... 28
2.2.2.4. Доменные структуры ингибиторов сериновых протеиназ 30
2.2.2.5. Каноническая конформация связывающей петли 33
2.2.2.6. Семейство Кунитца 35
2.3. Ингибиторы протеиназ актиний 37
2.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы протеиназ актиний 38
2.3.2. Эквистатин - высокомолекулярный ингибитор протеиназ актинии Actinia equina 40
2.3.3. Биологическая роль и применение ингибиторов протеиназ актиний 41
3. Результаты и обсуждение 43
3.1. Выделение и некоторые физико-химические характеристики ингибиторов протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus 44
3.2 Установление аминокислотной последовательности ингибиторов протеиназ 51
3.2.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности ингибиторов Rmln I и Rmln II 51
3.2.2. Установление полной аминокислотной последовательности ингибитора InhVJ 52
3.3. Изучение пространственной организации ингибитора InhVJ 56
3.4. Определение констант ингибирования 60
3.5. Определение антигистаминной активности ингибиторов сериновых протеиназ Rmln I и Rmln II 60
3.6. Изучение взаимодействия ингибиторов с протеолитическими ферментами 63
3.6.1. Масс-спектрометрический анализ комплексов ингибиторов протеиназ Rmln I и Rmln II с трипсином и а-химотрипсином 63
3.6.2. Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа 64
3.7. Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ
и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым К+- каналом 67
3.7.1. Построение модели пространственной структуры ингибитора InhVJ 69
3.7.2. Теоретическое предсказание структуры комплексов ингибитора InhVJ с трипсином, а-химотрипсином и потенциал-зависимым К+-каналом 73
4. Экспериментальная часть 83
4.1. Материалы 83
4.2. Методы 84
Выводы 90
Список литературы 91
- Химотрипсинподобные протеиназы: характеристика и физиологическая активность
- Низкомолекулярные ингибиторы протеиназ актиний
- Установление аминокислотной последовательности ингибиторов протеиназ
- Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа
Введение к работе
Поиск биологически активных природных соединений, специфически взаимодействующих с протеолитическими ферментами и регулирующих их активность, изучение взаимосвязи между их структурой и функцией является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии, так как протеолитические ферменты и процессы протеолиза играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов. Известно, что одним из основных способов регуляции действия ферментов является ингибирование их активности. В связи с этим, исследование структурно-функциональных особенностей, специфичности и механизма действия ингибиторов протеиназ является фундаментальной задачей, выясняющей молекулярные основы белок-белковых взаимодействий. Решение этой задачи может служить основой для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов.
К настоящему времени накоплен огромный массив информации о структуре и функциональной активности ингибиторов сериновых протеиназ растительного и животного происхождения. В то же время ингибиторам протеиназ морских организмов, в частности, ядовитых кишечнополостных, актиний, посвящено несравнимо меньшее количество публикаций. Уже более двадцати лет известно, что в организме-продуценте ингибиторы протеиназ присутствуют совместно с нейро- и цитотоксинами, выполняющими алломональную роль, но до сих пор отсутствует убедительное объяснение этого феномена. Это требует расширения знаний как о структуре и механизме действия ингибиторов, так и об их экологической роли в морском биоценозе.
Актуальность поиска и установления структуры новых представителей ингибиторов протеиназ актиний связана с обнаружением у ряда представителей этой группы полипептидов новых биологических функций. Так установлено, что некоторые ингибиторы протеиназ актиний способны блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, взаимодействовать с ваниллоидным рецептором TRPV1, проявлять антигистаминную активность, что свидетельствует об их полифункциональности.
Выделение новых ингибиторов из актиний, изучение их структурной организации и механизма действия с помощью современных биохимических, биофизических, молекулярно-биологических, а также методов компьютерного моделирования, позволит понять причины их структурно-функционального многообразия.
Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств ингибиторов, выделенных из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению их аминокислотных последовательностей, исследованию пространственной организации, специфичности, а также изучению механизма действия и биологической активности этих полипептидов.
Химотрипсинподобные протеиназы: характеристика и физиологическая активность
Химотрипсин (КФ 3.4.21.1), трипсин (КФ 3.4.21.4) и эластаза (КФ 3.4.21.36) - типичные и хорошо изученные представители под-подкласса сериновых протеиназ. Эти ферменты синтезируются ацинарными клетками поджелудочной железы в виде неактивных предшественников и секретируются в кишечник, где превращаются в активные ферменты [22].
Механизм катализа сериновых протеиназ детально изучен с помощью метода рентгеноструктурного анализа на примере а-химотрипсина, который является представителем ферментов, осуществляющих активацию воды при участии имидазольной группы гистидина, сопряженной с карбоксильной группой аспарагиновой кислоты [23]. Известно, что в связывании а-химотрипсина с субстратом основную роль играет так называемая «каталитическая триада», состоящая из остатков гистидина (His57), аспарагиновой кислоты (Aspl02) и серина (Serl95). Эти аминокислотные остатки расположены в активном центре молекулы фермента таким образом, что между гидроксильной группой Serl95 и атомом азота (3) имидазольного кольца His57, а также между атомом азота (1) (His57) и атомом кислорода карбоксильной группы боковой цепи Asp 102 образуются водородные связи, и возникает система переноса заряда [24] .
Механизм катализа сериновой протеиназы а-химотрипсина. Так же было показано, что помимо этих аминокислотных остатков в реакционном центре протеиназы принимает участие амидная группа остатка Glyl93, которая совместно с амидной группой Serl95 образует так называемую оксианионную впадину (рис. 1) и дополнительно стабилизирует тетраэдрические интермедиа [23].
Согласно кристаллографическим исследованиям пространственные структуры химотрипсина, трипсина и эластазы близки (остаток Serl95 занимает одно и то же положение во всех трех протеиназах) [25]. Но несмотря на структурное сходство, они имеют различную субстратную специфичность. Так химотрипсин расщепляет пептидную связь, образованную карбоксильными группами гидрофобных аминокислотных остатков Phe, Тгр, Туг, трипсин -положительно заряженных аминокислотных остатков Arg, Lys, эластаза -нейтральных аминокислотных остатков Ala, Gly, Val. Химотрипсин, трипсин и эластаза являются основными компонентами секрета поджелудочной железы и участвуют в расщеплении белков в процессе пищеварения. Известны два патофизиологических состояния организма, в которые вовлечены эти ферменты. Первое, это пузырный фиброз, который сопровождается гиперсекрецией зимогенов протеиназ [26] с последующим недостаточным перевариванием пищи [27]. Второе заболевание - острый панкреатит, обусловленный внезапной активацией зимогенов в поджелудочной железе, что приводит к быстрому саморазрушению железы, распространению протеиназ в перитональном пространстве и крови и часто к неизбежному шоку [28].
Другие сериновые протеиназы, такие как тромбин (КФ 3.4.21.5), плазмин (КФ 3.4.21.7), факторы коагуляции VII - XII (КФ 3.4.21.21, 22, 6, 27, 38 соответственно) принимают участие в системе свертывания крови. При этом тромбин является ключевым ферментом этой системы. Он превращает фибриноген в фибрин и участвует в образовании кровяного сгустка, активируя факторы свертывания крови V, VIII, XI, XIII. Тромбин является регулятором гемостаза -двух равновесных процессов, обеспечивающих постоянство гемодинамических свойств крови [20, 29]. Кроме того он участвует в регуляции развития организма, сосудистого тонуса, ангиогенеза, процессов воспаления и репарации тканей при заживлении ран, а также атеро- и канцерогенеза. Гиперсекреция тромбина часто является причиной сердечнососудистых заболеваний [30], например, острого коронарного синдрома или острого инфаркта миокарда [31].
Сериновые протеиназы, С1г, С Is, СЗ/С5 конвертазы классического и альтернативного путей активации, MASP-2, факторы I, D, (КФ 3.4.21.41, 42, 43, 47, 104, 45 и 46 соответственно) являются главными компонентами системы комплемента [21]. Система комплемента - одна из каскадных протеолитических систем, обнаруженных в плазме крови позвоночных, которая обеспечивает защиту организма от вторжения патогенов. Эти протеиназы существуют в форме зимогенов, последовательно активирующих друг друга [32]. Они значительно отличаются от других сериновых протеиназ, обладают узкой субстратной специфичностью (расщепляют один или два природных субстрата), имеют мультидоменную структуру и образуют с другими сериновыми протеазами и белками надмолекулярные комплексы. Известно, что запуск системы комплемента осуществляется тремя способами (рис. 2). Классический путь связан с иммунным ответом, который активизируется посредством образования иммунных комплексов. Развитие по лектиновому и альтернативному пути начинается непосредственно в присутствии патогенов. Активация системы приводит в конечном итоге к образованию ферментных комплексов, называемых СЗ конвертазами и атакующих мембрану, их агрегации и, непосредственно, клеточному лизису [33].
Гиперактивность компонентов системы комплемента может также привести к ряду заболеваний. Так сериновые протеиназы, участвующие в процессе воспаления, могут вызвать разрушение тканей, а длительное нарушение их активности приводит к возникновению хронического воспаления, которое негативно влияет на состояние, как отдельных систем, так и организма вцелом [34, 35].
Таким образом, участие различных сериновых протеиназ в вышеописанных физиологических процессах требует детального изучения возможных способов регуляции их активности.
Низкомолекулярные ингибиторы протеиназ актиний
Начало изучению ингибиторов протеиназ актиний положено исследованиями немецких ученых Фрица и Вандерера, которые выделили из актинии Anemonia sulcata десять полипептидов, обладающих ингибирующим действием по отношению к сериновым протеиназам: трипсину, химотрипсину, эластазе, плазмину и калликреину [126, 127]. Позже ингибиторы были обнаружены и в других видах актиний. Так, по четыре ингибитора сериновых протеиназ было выделено из водных экстрактов актиний Rhodactis rhodostoma, Radianthus koseirensis [128] и Actinia equina [129]. По два ингибитора протеиназ было обнаружено в актиниях Stoichactis sp. [130], Anthopleura off. xanthogrammica [131] и Stichodactyla helianthus [132, 133]. Десять ингибиторов сериновых протеиназ было выделено из этанольных экстрактов актинии Radianthus macrodactylus при очистке нейротоксипов [134]. Большинство исследованных ингибиторов относится к семейству Кунитца, однако из A. sulcata был также выделен ингибитор эластазы семейства Казала [135].
Все низкомолекулярные ингибиторы семейства Кунитца обладают рядом общих физико-химических свойств. Молекулярная масса этих полипептидов составляет 6000-7000 Да. В организме животных ингибиторы протеиназ существуют в виде изоформ с близким аминокислотным составом и незначительными различиями в содержании основных аминокислот. Как правило, они содержат шесть остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи в молекуле, и не содержат остатков триптофана и метионина.
Несмотря на то, что из актиний было выделено большое количество ингибиторов, первичная структура была установлена только для некоторых из них [131, 132, 136-138]. Пространственная структура определена методом ЯМР-спектроскопии лишь для ингибитора SHPI из актинии S. helianthus [139]. Как видно из рисунка 12 гомология между аминокислотными последовательностями ингибиторов протеиназ из разных видов актиний достигает 79%.
Консенсус указан под последовательностями. Серым цветом отмечены идентичные участки последовательностей. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW [141]. В основном ингибиторы, выделенные из актиний взаимодействуют с сериновыми протеиназами. Исключением являются ингибиторы из актинии S. helianthus, способные ингибировать сериновые, цистеиновые и аспарагиновые протеиназы [132, 133]. В 1995 году из актинии A. sulcata были обнаружены три новых полипептида, названные каликлидинами, структурно гомологичные как дендротоксину (DTXb классический лиганд К+-каналов), так и БПТИ [140]. Молекулы каликлидинов, подобно «классическим» ингибиторам сериновых протеиназ, содержат в своем составе 58-59 аминокислотных остатков, из них шесть остатков цистеина образуют три внутримолекулярные дисульфидные связи. Показано, что эти полипептиды проявляют уникальное свойство блокировать связывание дендротоксина с потенциал-чувствительными К+-каналами и ингибировать трипсин. Процент гомологии каликлидинов с БПТИ и дендротоксином составляет 40%, а с низкомолекулярным ингибитором протеиназ Jn-IV из актинии R. macrodactylus - 57%. (рис. 13).
Таким образом, каликлидины являются представителями бифункциональных ингибиторов протеиназ, которые впервые выделены из морских организмов. Недавно из актинии Stichodactyla haddoni японскими учеными был выделен ингибитор протеиназ SHTX III семейства Кунитца, который также блокирует К+-каналы [142].
В 1997 году впервые обнаружено, что актиния A. equina наряду с низкомолекулярными ингибиторами [129] протеиназ продуцирует высокомолекулярный ингибитор цистеиновых протеиназ, эквистатин [145]. Его молекулярная масса составляет 14129 Да. Полипептидная цепь эквистатина состоит из 128 аминокислотных остатков.
Характерной особенностью его аминокислотного состава является наличие одиннадцати аминокислотных остатков цистеина. Было показано, что эквистатин состоит из двух доменов а и Ь, идентичность которых составляет 48%. Недавно был выделен предшественник эквистатина с молекулярной массой 22000 Да [146]. Установлено, что кодируемая кДНК аминокислотная последовательность эквистатина состоит из 199 аминокислотных остатков и имеет 20 остатков цистеина. Показано, что этот полипептид существует в виде трех доменов по структуре подобных тироглобулину первого типа. Первый N-концевой домен действует как ингибитор цистеиновых протеиназ (К; для папаина 0,57±0,04 нМ), второй домен действует как ингибитор карбоксильных протеиназ (К; для катепсина D 0,3±0,15 нМ), функция третьего домена к настоящему времени не установлена [1]. На основании анализа аминокислотной последовательности эквистатин был отнесен к тиропинам (тироглобулинподобные ингибиторы), суперсемейству цистеиновых протеиназ 131 [1]. Константы ингибирования эквистатина по отношению к катепсину L, папаину и катепсину В составляют 0,051±0,004 нМ, 0,57±0,04 нМ и 1,4±0,2 нМ, соответственно.
Установлен высокий процент (40%) идентичности аминокислотных последовательностей трёх доменов эквистатина с доменами предшественника саксифилина, ингибитора протеиназ из лягушки Rana catesbiana, предшественника тироглобулина, ответственного за депонирование и синтез гормонов щитовидной железы человека, и ингибитора цистеиновых протеиназ из икры кеты Oncorhynchus keta .
Установление аминокислотной последовательности ингибиторов протеиназ
Для определения N-концевой аминокислотной последовательности ингибиторов Rmln I и Rmln II было проведено восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом и алкилирование образовавшихся сульфгидрильных групп 4-винилпиридином [155]. Модифицированные ингибиторы были выделены из реакционной смеси с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosil Ci8. Аминокислотная последовательность (по 15 аминокислот) была установлена методом Эдмана на автоматическом аминокислотном секвенаторе.
При сравнении полученных фрагментов Rmln I и Rmln II с N-концевой последовательностью Jn-IV [137] (рис. 21), выделенного из этой же актинии, была обнаружена высокая степень их гомологии (до 93%). Очевидно, что эти полипептиды являются изоформами. Гомология фрагментов аминокислотных последовательностей Rmln I и Rmln II с последовательностями ингибиторов других видов актиний составляет от 40 до 60%.
Для восстановления и защиты сульфгидрильных групп InhVJ был обработан дитиотреитолом и 4-винилпиридином [155]. В результате разделения реакционной смеси с помощью ВЭЖХ были получены четыре фракции с молекулярными массами 6537, 6639, 6647 и 6736 Да, что свидетельствовало о восстановлении дисульфидных связей на 67, 83, 90 и 100% соответственно. Фракция, соответствующая восстановлению всех дисульфидных связей была использована для трипсинолиза.
Для получения отдельных фрагментов алкилированный InhVJ, содержащий согласно данным аминокислотного анализа по три остатка лизина и аргинина, был расщеплен трипсином. Масс-спектрометрический анализ реакционной смеси выявил наличие фрагментов с молекулярными массами: 571, 637, 951, 1093, 1314, 2265 и 2818 Да. В результате разделения продуктов гидролиза с помощью обращенно-фазовой хроматографии было выделено 7 триптических пептидов (Т1-7) (рис. 22).
Для каждого пептида были установлены молекулярные массы (MALDI TOF MS) и аминокислотные последовательности методом Эдмана на автоматическом аминокислотном секвенаторе (табл. 7). Определение молекулярных масс пептидов и их секвенирование проводилось совместно с сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН м.н.с. Анастюком С.Д. и м.н.с. Черниковым О.В.
В результате секвенирования было обнаружено у InhVJ всего два остатка Lys, а не три, как определено методом аминокислотного анализа. Образование пептидов Т-4 и Т-5 связано, вероятно, с наличием незначительной примеси химотрипсина в препарате трипсина, использованном для реакции. Очевидно, это привело к расщеплению одной связи в молекуле ингибитора между остатками Phe и Не и образованию дополнительных пептидов, что позволило получить перекрывающиеся последовательности пептидов Т4, Т5 и Т7. На основании сравнения последовательностей триптических пептидов с известной последовательностью ингибитора Jn-IV была выведена полная аминокислотная последовательность InhVJ (рис. 23). Таким образом, молекула ингибитора состоит из 56 аминокислотных остатков, а его точная молекулярная масса равна 6106 Да, что хорошо согласуется с данными масс-спектрометрического анализа.
На рисунке 23 приведены полные аминокислотные последовательности ингибиторов протеиназ из различных источников. Так при сравнении аминокислотных последовательностей InhVJ и Jn-IV выявлен высокий процент их гомологии (91%), причем наибольшая идентичность наблюдается в N-концевом фрагменте молекулы полипептида, в то время как в С-концевом фрагменте обнаружены замены пяти аминокислотных остатков. Степень гомологии InhVJ с последовательностями ингибиторов из других видов актиний составляет от 54 до 86% (табл. 8). Следует отметить, что ингибиторы протеиназ из актиний, принадлежащих к одному семейству, имеют более высокую степень гомологии, чем ингибиторы из актиний разных семейств. Так гомология ингибиторов из актиний R. macrodactylus и S. helianthus, представителей семейства Stichodactylidae, составляет 80-90%, а ингибиторов актиний A. off. xanthogrammica и A. sulcata, семейства Actiniidae, 67%. Также обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, продуцируемых такими эволюционно далекими типами организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся (VBPI I) и млекопитающие (С. BPI, БПТИ). Степень идентичности последовательностей полипептидов составляет от 37 до 50%. По-видимому, в процессе эволюции структурные участки, отвечающие за ингибирующую активность данного класса соединений, практически не претерпели каких-либо существенных изменений.
Строение реактивных центров (Рз-Рг-Рі-Р ї-Р г-Р з) большинства ингибиторов протеиназ актиний схоже со строением реактивного центра бычьего панкреатического ингибитора трипсина (БПТИ), представителя ингибиторов семейства Кунитца: в положении Pi располагаются функционально важные для активности положительно заряженные остатки Lys/Arg (рис. 4). Таким образом, полипептиды из актиний A. sulcata, S. helianthus и A. off. xanthogrammica, подобно БПТИ являются специфичными по отношению к трипсину. Однако в положении Pj полипептидов InhVJ и Jn-IV из актинии R. macrodactylus располагается гидрофобный остаток Thr. Вероятно, сродство этих ингибиторов к химотрипсин-подобным протеиназам будет меньше по сравнению с БПТИ и ингибиторами из других актиний.
Согласно полученным физико-химическим данным, полипептиды Rmin I, Rmin II и InhVJ можно отнести к семейству Кунитца. Ингибиторы этого семейства характеризуются не только наличием гомологичных аминокислотных последовательностей, но и идентичным расположением остатков цистеина и, очевидно, расположением дисульфидных связей. Вероятно, представители этого семейства полипептидов ведут свое начало от общего гена-предшественника.
Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа
Для определения KD используют различные методы, среди которых биосенсорный анализ с использованием эффекта поверхностного плазмонного резонанса (SPR) занимает лидирующее положение, так как позволяет определять как кинетические, так и термодинамические характеристики межмолекулярных взаимодействий [170-173]. Величина константы ингибирования (К;) или константы диссоциации комплекса ингибитор-фермент (KD) имеет большое значение при выборе ингибиторов ферментов в качестве потенциальных кандидатов для создания лекарственных препаратов.
Исследование ферментативной специфичности ингибитора InhVJ [174] было проведено совместно с сотрудниками ИБМХ РАМН им. акад. В.Н. Ореховича к.х.н. Гнеденко О.В., к.х.н. Мольнаром А.А.и д.б.н. Ивановым А.С. (г. Москва). InhVJ был иммобилизован на карбоксиметилдекстрановой подложке стандартного оптического чипа СМ5 (рис. 28). Количество иммобилизованного белка составило 460 RU (0,46 нг/мм2).
При пропускании через измерительную кювету ферментов (трипсин, а-химотрипсин, плазмин, тромбин, калликреин, папаин и пепсин) в концентрациях от 10 до 400 нМ наблюдалось взаимодействие InhVJ только с трипсином (Тр) и а-химотрипсином (ХТр) (рис. 29). Таким образом, данный ингибитор является специфичным по отношению к двум сериновым протеиназам - к трипсину и а-химотрипсину, и не взаимодействует с остальными, перечисленными выше, протеиназами.
Температурная зависимость взаимодействия InhVJim с Тр и ХТр была исследована в диапазоне температур от 10 до 30 С и в интервале концентраций от 10 до 400 нМ. Расчет изменения энергии Гиббса (AG) для реакций комплексообразования был выполнен по уравнению, AG = -RT 1пКл Температурная зависимость AG реакции комплексообразования InhVJ,m с Тр и ХТр удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка. Изменения энтальпии (АН) и энтропии (AS) были определены из уравнения (AG = АН - Т AS) и составили для пары InhVJjm/Tp 44,15 ккал/моль и 165,6 кал/(моль-К), для пары InhVJim/XTp - 77,29 ккал/моль и 276,3 кал/(моль-К) соответственно.
Таким образом, полученные с помощью метода биосенсорного анализа данные свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия ингибитора InhVJ с двумя протеиназами - трипсином и а-химотрипсином, что отличает данный ингибитор от других представителей семейства Кунитца. Специфичность исследуемого ингибитора также значительно отличается от специфичности ингибитора SHPF-1 из S. helianthus. Последний» ингибирует не только сериновые протеиназы, трипсин (К, 1,1-Ю"10 М), плазмин (К, 2,7-10"9 М), химотрипсин (К, 2,3-10 9 М) и калликреин (К, 8,5-Ю 8 М), но и цистеиновые протеиназы, бромелаин, папаин, а также аспарагиновые протеиназы, пепсин (К, 2,5-10" М) и протеиназу из Mucor miehei [132].
Для выяснения, молекулярных основ- взаимодействия ингибиторов с ферментами и выяснения природы их специфичности необходимо знание пространственной организации молекул ингибиторов. В настоящее время для получения пространственных структур биополимеров широко применяются методы сравнительного моделирования.
Изучение механизмов действия белков,является одной из важнейших задач биоорганической химии. Для ее решения знание аминокислотной последовательности является недостаточным условием, необходима информация о пространственном строении белка. Несмотря на то, что на сегодняшний день пространственные структуры получены для 50735 белков [175], количество белков с установленными аминокислотными последовательностями огромно и постоянно пополняется. В основном пространственные структуры получены с помощью методов рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии. Анализ большого количества данных, полученных с помощью эмпирических методов, позволил разработать ряд теоретических методов предсказания пространственной структуры макромолекул, одним из которых является метод сравнительного моделирования [176]. Этот метод позволяет получить пространственную структуру исследуемого белка на основании сравнения его аминокислотной последовательности со структурой гомологичного белка, имеющего экспериментально установленную третичную структуру.
Метод сравнительного моделирования включает 4 этапа. В базах данных с помощью специальных программ на первом этапе осуществляется поиск прототипа - белка с установленной пространственной структурой, имеющего наибольшую гомологию с последовательностью исследуемого белка. На втором этапе проводят сравнение исследуемой последовательности с последовательностью выбранного прототипа [177] и подготовку к построению модели. Качественную теоретическую модель можно получить, когда гомология последовательностей белков составляет 40% и выше. Третий этап заключается в построении теоретической модели. На заключительном, четвертом этапе проводят проверку качества модели. Критерием ее качества является величина среднеквадратичного отклонения («root mean square deviation», rmsd) Са-атомов модели от Са-атомов прототипа. Модели высокой точности можно использовать для связывания с небольшими лигандами и изучения белок-белкового взаимодействия.
В настоящее время сравнительное моделирование является методом, который может предсказывать пространственную структуру белка с точностью, сравнимой с точностью экспериментально установленных структур [178]. Этот метод позволяет описать структуру белков и их функциональные особенности. С применением методов молекулярной динамики к полученной модели можно получить картину конформационных изменений, вызванных тем или иным воздействием. Молекулярное моделирование в совокупности с методами молекулярной динамики является мощным исследовательским подходом, обеспечивающим понимание многих аспектов физики и химии белковых молекул. Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым калиевым каналом проводилось совместно с научным сотрудником ТИБОХ ДВО РАН к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н. В- настоящее время известна единственная пространственная структура ингибитора протеиназ из актинии S. helianthus - SHPI-1 (код PDB 1SHP), установленная методом Н-ЯМР-спектроскопии [179]. Сравнение аминокислотных последовательностей InhVJ и SHPI-1, проведенное с помощью программы CLUSTALW [141] (рис.31), выявило высокую степень их гомологии - 86%, что позволило использовать структуру этого ингибитора в качестве прототипа. Теоретическая модель ингибитора протеиназ InhVJ была построена с помощью сервера SWISS-MODEL [180-182] (рис. 31). После минимизации энергии с помощыо программы МОЕ с использованием потенциала сил OPLS-AA [111, 183] энергия молекулы составила -1987 кДж/моль.
Для анализа качества модели с помощью программы МОЕ проведена суперпозиция Са- атомов модели и прототипа и рассчитана величина параметра rmsd. Величина параметра rmsd для 55 Са- атомов InhVJ и SHPI-1 составила 0,14 А. Таким образом, получена теоретическая модель ингибитора высокой точности [184].
Содержание элементов вторичной структуры в полученной модели определяли с помощью программы Molmol [185]. Структура InhVJ подобно структуре БПТИ содержит две а-спирали, расположенные на N- и С-концах молекулы, два антипараллельных р-стренда и две большие петли (неупорядоченная структура) (рис. 32). Показано, что данные по содержанию элементов вторичной структуры, полученные с применением компьютерных расчетов, согласуются с экспериментальными данными, полученными с помощыо методов оптической спектроскопии (табл. 13).
