Содержание к диссертации
Введение
2 Литературный обзор 17
2.1 Канцерогенез 17
2.1.1 Стадии развития канцерогенеза 17
2.1.2 Экзогенные канцерогенные факторы 18
2.2 Фукоиданы 25
2.2.1 Общие сведения 25
2.2.2 Характеристики структуры фукоиданов 25
2.2.2.1 Структурные группы фукоиданов 31
2.2.3 Фармакинетика, биодоступность и токсичность фукоиданов 41
2.2.4 Противоопухолевое действие фукоиданов
2.2.4.1 Антипролиферативное действие фукоиданов 44
2.2.4.2 Проапоптотическое действие фукоиданов
2.2.4.2.1 Определение понятия «апоптоз». Отличительные признаки апоптоза 51
2.2.4.2.2 Сигнальные пути при апоптозе 52
2.2.4.2.3 Митоген-активируемые протеинкиназные каскады 54
2.2.4.2.4 Индукция апоптоза фукоиданами
2.2.4.3 Антиметастатическое действие фукоиданов 60
2.2.4.4 Антиангиогенное действие фукоиданов 62
2.3 Катехины — полифенолы зеленого чая 65
2.3.1 Состав и структура катехинов. Эпигаллокатехин галлат 65
2.3.2 Фармакокинетика и биодоступность эпигаллокатехин галлата 67
2.3.3 Биологическая активность эпигаллокатехин галлата
2.3.3.1 Антиоксидантная активность эпигаллокатехин галлата 69
2.3.3.2 Регуляция клеточного цикла и индукция апоптоза эпигаллокатехин 71 галлатом
2.3.3.4 Блокада неоангиогенеза эпигаллокатехин галлатом 75
2.3.3.5 Рінгибирование металлопротеиназ эпигаллокатехин галлатом 77
2.3.3.6 Эпигаллокатехин галлат и циклооксигеназа-2 78
2.3.3.7 Фотозащитный эффект эпигаллокатехин галлата
2.4 Заключение 79
3 Обсуждение результатов 80
3.1 Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов, полисахаридгидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов 80
3.1.1 Фукоиданы бурых водорослей 80
3.1.1.1 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов mSaccharina cichorioides 89
3.1.1.2 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Saccharina japonica 90
3.1.1.3 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Undaria pinnatifida 91
3.1.1.4 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Costaria costata, Eisenia bicyclis и Ecklonia cava 92
3.1.1.5 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Fucus evanescens 93
3.1.1.6 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Sargassum sp., Dictyopteris polypodioides и Padina pavonica 95
3.1.1.7 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Sargassum horneri 96
3.1.1.8 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из Sargassum mcclurei 96
3.1.1.9 Содержание и анализ структуры фукоиданов в зависимости от порядка и места произрастания водорослей 99
3.1.2 Ламинараны бурых водорослей 101
3.1.2.1 Актуальность изучения ламинаранов, полисахаридгидролаз и их ингибиторов 101
3.1.2.2 Выделение ламинаранов из бурой водоросли Eisenia 103 bicyclis
3.1.2.3 Структура высокомолекулярного ламинарана из Eisenia 105 bicyclis
3.1.2.3.1 Исследование структуры ламинарана классическими химическими методами 105
3.1.2.3.2 Ферментативная трансформация ламинарана из Eisenia bicyclis 106
3.1.2.4 Противоопухолевая активность ламинарана из Eisenia bicyclis и 110
продуктов его ферментативного гидролиза
3.1.3 Биологическая активность фукоиданов из бурых
водорослей 111
3.1.3.1 Цитотоксическая активность фукоиданов 111
3.1.3.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток 113
3.1.3.3 Влияние фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток, вызванную действием эпидермального фактора роста 115
3.1.3.4 Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана
из бурой водоросли Saccharina cichorioides 117
3.1.3.5 Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток 120
3.1.3.6 Действие полисахаридов из бурых водорослей Fucus evanescens, Costaria costata и Alariafistulosa на активацию матриксных металлопротеиназ, индуцируемую УФ излучением 123
3.1.3.7 Действие фукоиданов бурых водорослей на элементы врожденного иммунитета 128
3.1.3.7.1 Действие фукоиданов бурых водорослей на созревание
дендритных клеток 128
3.1.3.7.2 Действие фукоиданов на толл рецепторы 133
3.2 Наземные растения как источник биологически активных полифенолов 139
3.2.1 Биологическая активность катехинов зеленого чая 139
3.2.1.1 Действие эпигаллокатехин галлата на пролиферацию клеток: взаимодействие с виментином и регулирование его функций 139
3.2.1.2 Действие эпигаллокатехин галлата на апоптоз опухолевых клеток: взаимодействие с белком, регулируемым глюкозой, и влияние на его функции 144
3.2.1.3 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток: взаимодействие с онкогеновыми тирозинкиназами и регулирование их функций
3.2.1.3.1 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую эпидермальным фактором роста 157
3.2.1.3.2 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток, индуцируемую инсулиноподобным фактором роста 1 162
3.2.2 Биологическая активность резвератрола 167
3.3 Синергическое действие резвератрола и фукоидана из бурой водоросли Saccharina cichorioides 172
3.4 Заключение 176
4 Экспериментальная часть 179
4.1 Приборы и материалы 179
4.1.1 Приборы 179
4.1.2 Материалы 180
4.2 Методы 184
4.2.1 Аналитические методы 184
4.2.2 Общие методы
4.2.2.1 Экстракция водорослей органическими растворителями 185
4.2.2.2 Экстракция водорослей сверхкритическим диоксидом углерода 185
4.2.2.3 Экстракция полисахаридов из бурых водорослей 185
4.2.2.4 Хроматография 186
4.2.2.5 ИК-спектроскопия 186
4.2.2.6 ЯМР спектроскопия 186
4.2.2.7 Хромато-масс-спектрометрия 186
4.2.2.8 МАЛДИ масс-спектрометрия 187
4.2.2.9 Кислотный гидролиз фукоиданов
4.2.2.10 Определение моносахаридного состава 187
4.2.2.11 Десульфатирование фукоиданов 188
4.2.2.12 Автогидролиз фукоиданов 188
4.2.2.13 Ферментативный гидролиз 188
4.2.2.14 Получение фукоидана в нерастворимой форме 188
4.2.2.15 Связывание фукоидана с эпидермальным фактором роста in vitro 189
4.2.2.16 Деградация по Смиту 189
4.2.2.17 Метилирование 189
4.2.2.18 Получение ацетатов полиолов 190
4.2.2.19 Получение продуктов исчерпывающего ферментативного гидролиза ламинарана 190
4.2.2.20 Частичный гидролиз альгинатов 190
4.2.2.21 Культивирование клеток 190
4.2.2.22 Трансфекция и культивирование стабильных клеточных линий 190
4.2.2.23 Определение цитотоксическои активности природных соединений... 191
4.2.2.24 Измерение клеточной пролиферации 191
4.2.2.25 Неопластическая трансформация клеток (метод мягкого агара) 191
4.2.2.26 Приготовление лизата клеток 192
4.2.2.27 Электрофорез в полиакриламидном геле 192
4.2.2.28 Перенос белков на мембрану (Вестерн-блот) 192
4.2.2.29 Аффинная хроматография 193
4.2.2.30 Подготовка проб и двумерный электрофорез 194
4.2.2.31 Анализ гелей 194
4.2.2.32 Идентификация белков с помощью МАЛДИ ТОФ масс-спектрометрии 194
4.2.2.33 Метод проточной цитометрии 195
4.2.2.34 Люциферазный метод. Определение активности c-Fos, c-Jun и АР-1... 195
4.2.2.35 Определение активности ММР-1 196
4.2.2.36 Определение активности киназ 196
4.2.2.37 Определение активности GRP78 197
4.2.2.38 Конверсия GRP78 197
4.2.2.39 Иммунопреципитация 197
4.2.2.40 Экспрессия и выделение рекомбинантных белков 197
4.2.2.41 GST-BHMeHTHH/GRP78/Fyn/ IGFR аффинное связывание и определение константы диссоциации 198
4.2.2.42 Статистическая обработка данных
5 Выводы 200
6 Список литературы
- Экзогенные канцерогенные факторы
- Сигнальные пути при апоптозе
- Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов mSaccharina cichorioides
- Трансфекция и культивирование стабильных клеточных линий
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение природных соединений - важная научная область, лежащая на стыке химии, биологии и медицины. Она включает работы по поиску, выделению, установлению строения, изучению химических превращений и биологических функций природных веществ. Эти исследования играют важную роль в углублении химических и биологических знаний, создают научную основу для разработки новых лекарств и биологически активных добавок к пище.
Исследования механизмов действия веществ привели к открытию новых свойств природных соединений, входящих в состав пищевого рациона человека. Были обнаружены противоопухолевые свойства полифенола из зелёного чая эпигаллокатехин галлата. Присутствием резвератрола в красном вине был объяснён так называемый "французский парадокс" - тот факт, что сердечно-сосудистые заболевания относительно редко встречаются у жителей юга Франции, регулярно употребляющих красное вино (при местной диете богатой насыщенными жирами). Бурые водоросли, широко используемые в пищу в странах Юго-Восточной Азии, стали объектом повышенного интереса в связи с обнаружением у сульфатированных полисахаридов водорослей - фукоиданов - целого спектра биологических активностей, в том числе и противоопухолевой. Необходимо отметить, что фукоиданы часто образуют прочные комплексы с полифенолами, одним из которых является эпигаллокатехин галлат -известный полифенол зеленого чая. Актуальным представляется изучение механизмов действия фукоиданов различной структуры и полифенолов в процессах регуляции развития опухолей.
Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности людей. Несмотря на усилия ученых и врачей во всем мире, это заболевание уносит огромное число человеческих жизней и занимает второе место по смертности после сердечно-сосудистой патологии. Основными методами лечения онкологических заболеваний являются хирургический, лучевая и химиотерапия. Однако хирургическое вмешательство не всегда дает желаемый результат вследствие распространения опухолевых клеток за пределы первичного очага и развития метастазов, а при лучевой терапии происходит повреждение пограничных здоровых тканей.
Поиск новых противоопухолевых средств ведут во многих направлениях - среди антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков, гормонов. Препараты растительного происхождения составляют около 1 % от общего числа исследуемых противоопухолевых средств. Изучение противоопухолевой профилактической и терапевтической активностей природных соединений проводят научные коллективы разных стран. В Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук ведутся работы в области химии, биохимии, биотехнологии и молекулярной клеточной биологии природных соединений из наземных и морских организмов. Комплексное изучение новых природных соединений позволяет обнаружить вещества, обладающие противоопухолевыми свойствами, определить их оптимальные действующие концентрации и перспективные комбинации.
Таким образом, актуальным направлением профилактики и лечения онкологических заболеваний является поиск природных соединений, повышающих устойчивость организма к развитию опухолей, и снижающих возможность рецидива опухоли после проведенной лучевой или химиотерапии; а также исследование
механизмов их действия. Эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия.
Цель работы - определение структуры природных соединений, обладающих противоопухолевым действием, изучение их влияния на регулирование процессов клеточной трансформации, пролиферации и апоптоза для установления взаимосвязи между структурой и функцией.
В задачи исследования входили:
-
поиск биологически активных полисахаридов в бурых водорослях, произрастающих в морях Дальнего Востока России, Японии и Республики Корея (Японское и Охотское моря), Социалистической Республики Вьетнам (Южно-Китайское море) и Ливанской республики (Средиземное море);
-
сравнительное изучение полисахаридных композиций бурых водорослей разных регионов;
-
установление структуры выделенных полисахаридов с использованием химических, ферментативных и спектральных методов, систематизация по структурным типам;
-
определение взаимосвязи между структурой и функцией полисахаридов с применением химических и ферментативных методов их модификации;
-
изучение молекулярных механизмов биологического действия фукоиданов разных структурных типов и полифенолов растительного происхождения (катехинов зеленого чая, резвератрола);
-
определение возможностей комбинации веществ с различными механизмами действия для лечения онкологических заболеваний;
-
определение закономерностей, позволяющих прогнозировать свойства новых веществ;
-
выбор перспективных природных соединений для создания на их основе оригинальных отечественных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Содержание и структура водорастворимых полисахаридов бурых водорослей зависят от видовой принадлежности, среды обитания и стадии развития водоросли.
-
Фукоиданы бурых водорослей относятся к разным структурным группам, различающимся моносахаридным составом, типом связи между моносахаридными остатками в цепи полисахарида, степенью сульфатирования и ацетилирования, местоположением заместителей.
3. Фукоиданы бурых водорослей обладают канцерпревентивным и
противоопухолевым действием. Избирательность биологического действия связана со
структурными характеристиками фукоиданов.
-
Противоопухолевое действие ламинаранов бурых водорослей зависит от молекулярной массы и степени разветвления полисахарида.
-
Эпигаллокатехин галлат (EGCG) - катехин зеленого чая, влияет на пролиферацию, трансформацию и индукцию апоптоза раковых клеток. Механизм его действия обусловлен взаимодействием с белками, участвующими в передаче внутриклеточных сигналов.
6. Резвератрол - флавоноид красного вина, участвует в процессах пролиферации
раковых клеток. Фукоидан из бурой водоросли Saccharina (=Laminaria) cichorioides
обладает способностью усиливать апоптотическое действие резвератрола.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Выполнено сравнительное изучение состава полисахаридов 13 видов бурых водорослей. Выделены и охарактеризованы 32 фракции фукоиданов и 2 фракции ламинаранов из бурых водорослей, произрастающих в морях различных регионов. Их структурные характеристики были установлены физико-химическими и ферментативными методами. Впервые выделен высокомолекулярный разветвленный ламинаран, установлены структурные характеристики полисахарида, определяющие его противоопухолевое действие. Проведена систематизация структурных типов исследованных фукоиданов. Обнаружен новый структурный тип фукоидана.
Впервые проведено комплексное исследование противоопухолевой активности и механизма действия фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens, Saccharina cichohoides, Saccharina japonica, Undaria pinnatifida, Sargassum mcclurei, относящихся к разным структурным группам.
Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурой. Показано, что наличие 1 —>3-связанных сульфатированных остатков а-/_-фукозы необходимо для ингибирования как трансформации нормальных клеток, индуцированной эпидермальным фактором роста (EGF), так и роста колоний раковых клеток кишечника человека. Сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1—>3- и 1—>4-связанных остатков а-/_-фукозы, ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека. Для ингибирования роста колоний опухолевых клеток молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества сульфатированных и частично ацетилированных остатков галактозы и фукозы, соединенных 1—>3- и/или 1—>4-0-гликозидными связями.
Получены новые сведения, касающиеся механизмов биологического действия водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и полифенолов растительного происхождения.
Впервые показано, что взаимодействия эпигаллокатехин галлата (EGCG, катехина зеленого чая) с белком цитоскелета - виментином; белком, регулируемым глюкозой (GRP78); а также трансмембранной (IGF-1R) и цитоплазматической (Fyn) тирозинкиназами являются важными для регулирования процессов пролиферации и трансформации клеток, а также преодоления резистентности опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Установлено, что галлатная группа является определяющей в проявлении катехинами биологической активности.
Впервые выявлен синергизм при совместном действии резвератрола и фукоидана из S. cichohoides: убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность резвератрола в присутствии фукоидана может быть значительно увеличена.
Показана высокая перспективность использования полисахаридов бурых водорослей, полифенолов растительного происхождения, а также сочетания этих веществ как основы для получения агентов с широким спектром биологической активности.
По результатам данной работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых препаратов профилактической и терапевтической направленности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены автором лично в виде устных и стендовых сообщений на различных Международных конференциях.
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликованы 49 работ, в том числе 35 научных статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ (из них 21 в зарубежных и 14 статей в российских журналах), и 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав: обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, а также выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 478 источников, в том числе 414 на английском языке. Работа изложена на 253 страницах машинописного текста, содержит 71 рисунок и 16 таблиц.
Автор благодарна научному консультанту, профессору Звягинцевой Т.Н. за позитивную критику и справедливые замечания в ходе выполнения работы. Также благодарит всех сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, а именно: к.х.н. Вищук О.С, к.х.н. Меньшову Р.В., к.б.н. Кусайкина М.И., к.х.н. Сову В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., к.х.н. Имбс Т.И., к.х.н. Захаренко A.M., м.н.с. Песенцеву М.С, м.н.с. Сильченко А.С, д.х.н. Бакунину И.Ю., д.х.н. Елякову Л.А., к.б.н. Дубровскую Ю.В., н.с. Киселеву М.И., вед. инж. Исакову Т.В. и лаб. Ляхову З.П. за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения и обсуждения работы. Автор благодарна также к.х.н. Исакову В.В., к.х.н. Анастюку С.Д. и к.ф.-м.н. Глазунову В.П. за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.х.н. Зыковой Т.А., проф. Zigang D., проф. Bode A.M., проф. Zhu F., проф. Choi B.Y., проф. Choi H.S., проф. Kang B.S., проф. Cho Y.Y. (Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, MN, США) - за помощь в работе и проведении отдельных экспериментов по изучению биологической активности; к.х.н. Иванчиной Н.В. - за помощь в ходе оформления диссертации; к.б.н. Горшковой И.А., к.б.н. Бердышеву Е.В. - за комментарии к работе и моральную поддержку. Отдельную благодарность хочется выразить сотрудникам отдела научной информации ТИБОХ ДВО РАН Бабко В.А., Зиновой СМ. и Чувилиной О.Е. за квалифицированную помощь при работе с периодическими изданиями.
Обозначения. АР-1 - ядерный транскрипционный фактор; АТР - аденозинтрифосфат; Cdc2 - ген клеточного цикла 2; c-foc - транскрипционный фактор; c-Jun - белок семейства транскрипционного фактора Jun; СОХ-2 - циклооксигеназа 2; ЕС - эпикатехин; ECG -эпикатехин галлат; EGC - эпигаллокатехин; EGCG - эпигаллокатехин галлат; EGF -эпидермальный фактор роста; EGFR - рецептор эпидермального фактора роста; ERKs -киназы, регулирующие внеклеточные сигналы; Fyn - белок Src-семейства тирозинкиназ; GRP78 - белок, регулируемый глюкозой; IC5o - концентрация вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50 %; IGF-1 инсулиноподобный фактор роста 1; IGF-1R - рецептор инсулиноподобного фактора роста 1; JNKs - Jun N-концевые киназы; Kd - константа диссоциации; МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы; MMPs - матриксные металлопротеиназы; MTS - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2-Н-тетразол; р38 - белок семейства MAP киназ; р53 - белок-супрессор опухолей; PGE2 - простагландин Е2; РКА -протеинкиназа A; RSV - резвератрол; STAT-1 - белок семейства транскрипционных факторов; ТРА - 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат; УФ - ультрафиолетовый.
Экзогенные канцерогенные факторы
Исследования в области эпидемиологии рака показали, что причиной 90-95 % 30 являются канцерогенные факторы окружающей среды и образа жизни или экзогенные канцерогенные факторы. Среди них курение — причина 30 % всех ЗО, особенности питания -35 %, инфекционные агенты - 10 %, профессиональные канцерогены - 4-5 %, ионизирующее излучение - 4-5 %, ультрафиолетовое излучение - 2-3 %, потребление алкогольных напитков - 2-3 %, загрязнение атмосферного воздуха - 1-2 %, репродуктивные факторы - 4-5 %, низкая физическая активность - 4-5 % [7].
Курение является непосредственной причиной развития рака полости рта и глотки, пищевода, гортани, легкого, поджелудочной железы, почечных лоханок, мочевого пузыря, а возможно, и желудка, и относится к первой группе факторов, канцерогенность которых доказана [8]. В состав табачного дыма входит несколько десятков канцерогенных веществ, в том числе летучие нитрозосоединения, специфические нитрозоамины и многие другие, каждое из которых отнесено МАИР к группе канцерогенных (группа 1) или вероятно канцерогенных (группа 2а) веществ [9, 10].
Процент всех случаев рака, этиологически связанных с курением, различен для разнообразных форм злокачественных образований. Например, непосредственной причиной 90-95 % рака легкого у мужчин является курение [11]. На основании эпидемиологических исследований, проведенных за последние 10-15 лет, можно сделать заключение, что пассивное курение также является канцерогенным для человека. Агентство по защите окружающей среды США пришло к заключению, что пассивное курение является причиной 3000 случаев рака легкого в год. Снижение частоты курения среди населения некоторых развитых стран, например Великобритании и США, привело к уменьшению заболеваемости и смертности от рака легкого и других форм рака, этиологически связанных с курением.
Потребление алкогольных напитков. В экспериментальных исследованиях этанол, как таковой, не является канцерогеном. Однако он играет роль промотора канцерогенеза. Подобный эффект спирта можно объяснить его способностью повышать проницаемость клеточных мембран. Потребление алкогольных напитков является канцерогенным для человека, этот фактор отнесен к группе 1 доказанных канцерогенов. Чрезмерное потребление крепких спиртных напитков повышает риск развития рака полости рта, глотки, гортани, пищевода, печени, поджелудочной железы и желудка. Показано, что алкоголь повышает и риск развития рака молочной железы (http://cancerscreen.narod.ru/mc02.htm). Также отмечен синергизм между канцерогенным эффектом потребления крепких спиртных напитков и курением: относительный риск рака кардиального отдела желудка у мужчин, которые потребляли водку и курили, равен 5.5, что значительно выше относительного риска, связанного с потреблением водки среди некурящих мужчин, который был равен 3.3 [7].
Питание играет важную роль в этиологии злокачественных опухолей. По крайней мере, одна треть всех 30 связана с питанием, в частности доказано, что ожирение является доминирующим фактором риска для рака эндометрия. Экспериментальные исследования показали, что ограничение потребления калорий, а также насыщенных жиров животного происхождения ингибирует процесс канцерогенеза, индуцированный канцерогенными химическими веществами. Механизм ингибирования опухолевого роста, связанный с ограничением потребляемых калорий, можно объяснить снижением пролиферации клеток и стимулированием апоптоза, усилением репарации ДНК, снижением образования свободных радикалов и соответственно повреждения ими клеток [7]. Гипотезу о защитной роли клетчатки сформулировал английский врач Беркитт. Он отметил, что заболеваемость раком толстой кишки в Африке низка, а потребление продуктов питания с высоким содержанием клетчатки высоко. Предполагается, что у людей, потребляющих много клетчатки, увеличена масса стула, что ведет к снижению в толстой кишке концентрации канцерогенных веществ. Большинство аналитических эпидемиологических исследований подтвердили гипотезу о протективном эффекте клетчатки, однако выяснилось, что защитным эффектом обладает клетчатка, источником которой являются овощи и фрукты, а не крупы и хлеб. Поэтому возникло мнение [7], что этот протективный эффект может быть также результатом влияния витаминов, индолов, ингибиторов протеаз и других компонентов фруктов и овощей, а не клетчатки.
Доказано влияние потребления овощей и фруктов против развития злокачественных опухолей у человека: выраженным защитным эффектом обладают лук и чеснок; овощи и фрукты содержат активные вещества, которые в экспериментах на лабораторных животных ингибируют развитие опухолей. К ним относятся витамины С, Е, бета-каротин, селен, обладающие антиоксидантными свойствами, витамин А, фолиевая кислота, а также флавоноиды, индолы и т.д. [7]. В настоящее время недостаточно знаний для того, чтобы точно указать все компоненты питания, снижающие риск развития рака. Однако нет сомнений, что увеличение в рационе питания овощей, зелени и фруктов и уменьшение потребления калорийньк продуктов приведет к снижению заболеваемости злокачественными опухолями.
Профессиональные факторы. Эпидемиологические исследования показали, что несколько десятков веществ, применяемых в промышленности, повышают риск развития 30 у человека, и на этом основании они были отнесены МАИР к группе 1, т.е. к факторам, канцерогенность которых для человека доказана. В таком случае производственный процесс классифицируют как канцерогенный, занятость в таких производственных процессах приводит к повышению риска ЗО. Например, канцерогенность резиновой промышленности, скорее всего, связана с использованием 2-нафтиламина, развитие злокачественных образований под действием которого для человека доказана. Литейщики подвержены воздействию паров хрома, никеля, формальдегида, а также кремниевой пыли. Повышенный риск рака легкого у рабочих, добывающих руду и, в частности радиоактивную руду, связан с воздействием повышенных концентраций радона в шахтах. Кроме того, шахтеры подвержены воздействию таких факторов, как кремниевая пыль и мышьяк. Канцерогенные профессиональные факторы редко представлены в виде одного определенного вещества. Чаще это сложные смеси, не все составные части которых известны. Долю случаев рака, причинно связанных с профессиональным воздействием, оценить трудно, но по имеющимся данным, она составляет 4-5 % всех 30 [12]. Этот процент может быть выше в регионах с развитой промышленностью и слабым гигиеническим надзором. ЗО профессионального происхождения, особенно когда причина установлена, поддаются профилактике с помощью соответствующих технологических мероприятий и мер защиты.
Инфекционные агенты. В этиологии ЗО важную роль играют инфекционные агенты. На основании оценки данных, полученных в результате экспериментальных, молекулярно-биологических и эпидемиологических исследований, МАИР классифицировало как канцерогенные для человека (группа 1): вирусы гепатита В и С, вирус папилломы человека 16 и 18 типов, вирус Т-клеточного лейкоза взрослых, вирус Эпштейна-Барра, вирус иммунодефицита человека, Helicobacter pylori, а также паразиты Schistosoma haematobium и Opistorchis viverrini.
Вирусы гепатита В и С (ВГВ и ВГС). Результаты более десятка проспективных когортных исследований показали, что хроническая инфицированность ВГВ и ВГС повышает риск развития гепатоцеллюлярного рака. Исследования методом «случай -контроль» также выявили связь между серологическим тестом инфицированности ВГВ и риском рака печени. Вирус папилломы человека (ВПЧ). Доказательства роли ВПЧ в этиологии рака шейки матки получены в проспективных эпидемиологических исследованиях и исследованиях методом «случай - контроль». Дескриптивные эпидемиологические исследования выявили корреляцию между заболеваемостью раком шейки матки и частотой инфицированности ВПЧ: в подавляющем большинстве случаев рака шейки матки обнаруживаются ВПЧ 16 и 18 типов; при инвазивном раке ВПЧ выявляется более чем в 90 % случаев. Таким образом, методом первичной профилактики рака шейки матки является вакцинация против ВПЧ.
Вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ). Им инфицированы более 90 % всего взрослого населения. Поэтому обнаружение антител к ВЭБ в крови или в опухоли является недостаточным для доказательства роли этого вируса в этиологии опухоли. В сероэпидемиологических исследованиях обычно проводятся сравнения титров антител к тем или иным антигенам ВЭБ. Первой злокачественной опухолью, для которой была доказана этиологическая роль ВЭБ, была лимфома Беркитта. С ВЭБ ассоциированы почти 100 % случаев этого заболевания в эндемических районах Африки. В то же время в неэндемических регионах частота случаев, ассоциированных с ВЭБ, намного ниже. ВЭБ этиологически связан также с неходжкинскими лимфомами, лимфомой Ходжкина (лимфогранулематозом), раком носоглотки. ВЭБ с различной частотой обнаруживается в лимфоэпителиальных опухолях и в первую очередь в лимфомах желудка. ВЭБ также выявлен в аденокарциномах желудка. Во всех случаях ВЭБ в опухолях моноклонален, то есть вирус присутствовал в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка до размножения опухолевого клона.
Распространенность вируса Т-клеточпого лейкоза взрослых (HTLV1) среди населения значительно ниже, чем других онкогенных вирусов и варьирует от 0.2-2 % в регионах с низкой инфицированностью до 3-15 % - с высокой. Роль вируса в этиологии Т-клеточного лейкоза взрослых подтверждена в аналитических эпидемиологических исследованиях. В когортных исследованиях показано, что среди мужчин — носителей вируса - смертность от Т-клеточного лейкоза взрослых равна 68, а среди женщин — 36 на 100 тыс. населения [7].
Сигнальные пути при апоптозе
Исследования фукоиданов показали, что бурые водоросли синтезируют чрезвычайно разнообразные по характеристикам структуры наборы этих сульфатированных полисахаридов [18, 19]. Фукоиданы можно разделить на гомо- и гетерополисахариды. Сравнительно гомогенные фукоиданы содержат фукозу в качестве основного моносахаридного остатка, тогда как другие моносахариды либо отсутствуют, либо находятся в минорных количествах. Среди фукоиданов - гомополисахаридов в настоящее время обнаружены две структурные группы. Фукоиданы первой группы содержат главную цепь из 1— 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы (табл. 2.2). К этой группе относится слабо разветвленный фукоидан регулярного строения из бурой водоросли Chorda filum [71], содержащий практически только фукозу, сульфатные и ацетатные группы. Его структура представляет собой гексасахаридные повторяющиеся звенья, в которых на пять 1- 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы главной цепи приходится один незамещенный остаток a-L-фукопиранозы в качестве бокового ответвления по положению 2. Сульфатные группы в нативном полисахариде занимают, главным образом, положения 4 и в меньшей степени положения 2, некоторые 1— 3-связанные остатки a-L-фукопиранозы частично ацетилированы по гидроксилу в положении 2. Фукоиданы аналогичного строения, содержащие практически только фукозу и сульфатные группы, были выделены из бурых водорослей Saccharina cichorioides и S. latissima. Показано, что практически все остатки фукозы в фукоидане из S. cichorioides сульфатированы по положениям 2 и 4 [78, 88, 89]. Фукоидан из Analipus japonicus [43] содержит главную цепь из 1—»3-связанных остатков фукозы, но более разветвлен. В среднем, в нем имеются три ответвления в виде единичных остатков a-L-фукопиранозы в положении 4 и одно такое ответвление в положении 2 на каждые десять остатков главной цепи. Сульфатные группы в этом полисахариде занимают положения 2 (преимущественно) и 4. Большинство терминальных невосстанавливающих остатков фукозы сульфатировано по положениям 2 и 4, тогда как ацетаты локализованы главным образом в положении 4.
Вторая структурная группа гомогенных по моносахаридному составу фукоиданов включает полисахариды, главная цепь которых состоит из чередующихся 1- 3- и 1— 4-связанных остатков a-L-фукопиранозы (табл. 2.2). К ней относятся фукоиданы из Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus [47] и Pelvetia canaliculata [90], для которых была предложена регулярная структура из повторяющихся дисахаридных звеньев, сульфатированных по положению 2 и в меньшей степени по положению 3. Из F. evanescens выделена фракция фукоидана с такой же углеводной цепью, сульфатированная по положению 2 и редко по положению 4, с ацетатными группами, присоединенными к некоторым свободным гидроксилам [50]. По другим данным, в соответствии с результатами метилирования, в фукоидане из F. evanescens содержание 1— 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы превышает содержание 1—»4-связанных в 3,5 раза [91]. Из Fucus distichus была выделена фракция фукоидана, где 1—»4-связанные остатки фукозы сульфатированы по положению 2, а 1—»3-связанные остатки по положениям 2 и 4. Согласно данным химического анализа фукоидана, регулярная структура полимера может быть в незначительной степени замаскирована частичным ацетилированием и неполным сульфатированием отдельных повторяющихся звеньев [49].
В фукоидане из Fucus serratus, содержащем фукозу, сульфаты и ацетаты в мольном отношении 1:1:0.1, была найдена подобная главная цепь, но молекулы оказались разветвленными: примерно половина 1—»3-связанных остатков главной цепи были замещена по 4 положению остатками фукотриозы. Полисахарид сульфатирован, главным образом, по положению 2 и в меньшей степени по положению 4, хотя 3,4-дигликозилированные и некоторые терминальные остатки фукозы не имеют сульфатных групп. Ацетаты найдены при С4 1—»3-связанных остатков и при СЗ 1—»4-связанных остатков фукозы в соотношении приблизительно 7:3 [52]. Главная цепь, содержащая 1— 3- и 1— 4-связи между остатками a-L-фукопиранозы, была обнаружена также в фукоидане из Stoechospertum marginatum, но доказательства строгого чередования этих двух типов связей не приведены [39].
Большое количество фукоиданов являются гетерогенными по моносахаридному составу и содержат, помимо фукозы, значительное количество других моносахаридных остатков. В этой обширной структурной группе, прежде всего, привлекают внимание полисахариды, содержащие фукозу и галактозу в сравнимых количествах, так называемые галактофуканы (табл. 2.2). Впервые достоверные сведения о наличии связи между остатками галактозы и фукозы были получены в работе по структуре галактофукансульфата из Ecklonia киготе. После деполимеризации фукоидана авторы выделили нескольких олигосахаридов, содержащих оба моносахаридных остатка [92]. Впоследствии подобные олигосахариды были обнаружены методом масс-спектрометрии в продуктах деградации фукоиданов из Saccharina gurjanovae и Undaria pinnatifida [68, 79]. Набор полученных олигосахаридов, помимо смешанных олигосахаридов, содержал фуко- и галактоолигосахариды. Этот факт позволил предположить, что исходные фукоиданы обладают блочным строением. Выделенные галактофуканы отличаются по расположению сульфатных групп. Фукоидан из S. gurjanovae сульфатирован по положению 4, а также 2 и/или 3 остатков фукозы и галактозы. Фукоидан из U. pinnatifida преимущественно сульфатирован по положению 2 остатков фукозы и галактозы, незначительное количество сульфатов находилось в положении 4 остатков a-L-фукопиранозы, а также в положениях 3 и/или б остатков p-ZJ-галактопиранозы.
Галактофукансульфаты, экстрагированные из U. pinnatifida, изучали несколько научных групп. Так, в одном из исследований было показано, что фукоидан из U. pinnatifida представляет собой частично ацетилированный высокосульфатированный галактофукан, основная цепь которого состоит из 1—»3- и/или 1—»3;1— 4-связанных остатков a-L-фукопиранозы. Сульфатные группы находились преимущественно в положении 2 и, в меньшей степени, положении 4 остатков фукозы и галактозы [66].
В работе других авторов [69] по данным метилирования было установлено, что фукоидан из U. pinnatifida содержит 1—»3-связанные остатки фукозы наряду с 1— 3-, 1— 4- и 1—»6-связанными остатками галактозы. Сульфатные группы расположены в положении 2 остатков a-L-фукопиранозы, а также в положениях 3 и/или 6 остатков p-D-галактопиранозы.
Известно, что характеристики структуры фукоиданов могут варьировать в зависимости от сезона и места сбора водоросли, ее репродуктивного статуса, а также способа выделения сульфатированных полисахаридов [93]. Структуры многих галактофуканов, изученных, главным образом, методом метилирования, установлены только частично. Так, было показано, что фукоиданы, выделенные из бурой водоросли Saccharina longicruris, содержат 4-сульфатированные 1— 3-связанные остатки фукопиранозы наряду с 3-сульфатированными 1— 6-связанными остатками галактопиранозы [85]. 2,3-Дисульфатированные остатки 1— 4-связанной a-L-фукозы были идентифицированы в качестве главных элементов структуры фукоидана из S. cichorioides. Большой набор метилированных производных галактозы был найден в продуктах метилирования этого полисахарида, но не было получено данных о взаимном расположении остатков [77].
В работе [81] охарактеризована структура галактофукана из бурой водоросли Saccharina japonica. Главная цепь выделенного полисахарида построена преимущественно из 1— 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы (75 %), и, в меньшей степени, 1— 4-связанных остатков a-L-фукопиранозы (25 %). Ответвления от основной цепи по положению 2 представляют собой единичные остатки фукозы (65 % от всех ответвлений), а по положению 4 - остатки 1—»6-связашюй галактобиозы (35 %). В среднем на каждые четыре мономера главной цепи приходится одно ответвление. Сульфатные группы занимают положения 2 и/или 4 a-L-фукопиранозы и 3 и/или 4 p-D-галактопиранозы.
По данным другого исследования фукоидан, выделенный из S. japonica, представляет собой частично ацетилированный и сульфатированный галактофукан, основная цепь которого состоит из 1— 3-связанных остатков a-L-фукозы. Ответвления от основной цепи содержат остатки как фукозы, так и галактозы. Сульфаты преимущественно находятся в положении 4 и, в меньшей степени, в положении 2 фукопиранозных остатков [66].
Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов mSaccharina cichorioides
Инвазия и метастазирование - главные проявления злокачественных новообразований. Они являются основными причинами гибели больных раком. Ежедневно миллионы опухолевых клеток попадают в лимфу и кровоток, но лишь немногие из них способны вызвать метастазы. Процесс метастазирования зависит от свойств первичной опухоли, клеточный состав которой неоднороден по генетическим и фенотипическим признакам и от реактивности организма - носителя опухоли. Способность злокачественной опухоли к метастазированию основана на инфильтрирующем росте с инвазией в лимфатические и кровеносные сосуды, слабой связи между опухолевыми клетками, а также на благоприятной биохимической ситуации в тканях для приживления ракового эмбола. Каскад метастазирования включает в себя четыре стадии: - отделение опухолевых клеток от основного опухолевого узла и внедрение в экстрацеллюлярный матрикс; инвазия ткани; - проникновение опухолевых клеток в просвет сосудов и агрегация с другими метастазирующими опухолевыми клетками; перенос опухолевых клеток по лимфатическим и кровеносным сосудам (раковая эмболия); - фиксация опухолевых клеток на интиме сосудов капиллярного типа с образованием тромба; - переход из кровеносных и лимфатических сосудов в прилегающую ткань; приживление и размножение клеток (экстраваскулярная пролиферация), индукция ангиогенеза; формирование метастаза (вторичного опухолевого узла).
Опухолевые клетки могут усиливать или ослаблять контакты со своим микроокружением, что зависит от их способности экспрессировать молекулы адгезии на своей мембране, на клетках эндотелия сосудов и на экстрацеллюлярном матриксе, с которыми они при своем передвижении вступают в контакт. Из молекул адгезии особенно важными в этом плане являются интегрины — молекулы межклеточной адгезии, которые присутствуют на поверхности различных клеток, в том числе и лейкоцитов. Они участвуют в адгезии лейкоцитов к внеклеточному матриксу и эндотелию. Утрата некоторых интегринов (при раке молочной железы, предстательной железы, толстой кишки) или их избыток (при меланоме, плоскоклеточном раке полости рта, носоглотки, гортани) сопряжены с высокой степенью злокачественности опухоли. Связывание интегринов с лигандами и сближение клеток необходимы для перестройки базальной мембраны, происходящей при ангиогенезе. Взаимодействие интегринов с белками внеклеточного матрикса в некоторых случаях препятствует апоптозу. Информация, которую интегрины передают от внеклеточного матрикса внутрь клетки, в одних случаях стимулирует адгезию и миграцию опухолевых клеток, в других - приводит к их гибели. Иными словами, интегрины играют роль своеобразного «переключателя», определяющего дальнейшую судьбу опухолевой клетки.
После прикрепления опухолевых клеток к экстрацеллюлярному внеклеточному матриксу они начинают секретировать плазмин, расщепляющий фибрин, и протеолитические ферменты (сериновые и цистеиновые протеазы и металлопротеиназы, в том числе коллагеназу IV типа). Этим обеспечивается инвазия опухолевых клеток в ткани. В процессах деградации экстрацеллюлярного внеклеточного матрикса участвует также катепсин D. Мишенями для катепсина D служат различные субстраты, включая фибронектин, ламинин и белковую компоненту протеогликанов. Таким образом, процесс становления злокачественной опухоли включает в себя одновременное сосуществование нескольких феноменов: инвазия тканей и метастазирование происходят параллельно увеличению массы опухоли за счет ее роста. Такая опухолевая экспансия сопровождается разрушением тканей, окружающих злокачественную опухоль, и созданием сети сосудов. Лечение метастазирующих опухолей - одна из наиболее сложных задач онкологии.
Поиск веществ, способных воздействовать на различные компоненты процесса метастазирования является актуальным. В ряде работ еще в 80-х годах XX века показано антиметастатическое действие сульфатированных полисахаридов. Так, в работе [193] приведены данные о подавлении фукоиданом легочных метастазов после внутривенных инъекций клеток аденокарциномы 13762 МАТ молочной железы крыс. В условиях in vivo фукоидан при неоднократном введении ингибировал фиксацию метастатических клеток саркомы L-1 в легких мышей BALB/c [194]. Фукоиданы, выделенные из Laminaria saccharina, L. digitata, Fucus serratus, F. distichus и F. vesiculosus, подавляли адгезию клеток карциномы молочной железы MDA-MB-231 к тромбоцитам [115]. В модельных экспериментах фукоидан, меченый тритием, связывался с фибронектином и блокировал адгезию клеток аденокарциномы молочной железы линии MDA-MB-231 к этому белку.
Фибронектин является белком зрелой соединительной ткани с выраженными адгезивными свойствами, который синтезируется практически всеми видами клеток за исключением некоторых видов нервных клеток. Он присутствует в организме в виде двух форм: нерастворимая форма существует на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе; растворимая - в крови. Обе формы вовлекаются в разнообразные процессы: способствуют адгезии и распространению эпителиальных и мезенхимальных клеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эмбриональных и опухолевых клеток, активно участвуют в воспалительных и репаративных процессах. Показано, что фукоиданы из Ascophyllum nodosum и Spatoglossum schroederi с высокой аффинностью связываются с фибронектином и ингибируют адгезию клеток к экстрацеллюлярному матриксу [37, 151, 195]. Антиметастатический эффект фукоиданов обусловлен ингибированием гепарин- и клеточно-связывающего доменов белка, реорганизацией альфа 5 субъединицы интегрина, а также подавлением экспрессии винкулина [151, 195]. Важно отметить, что десульфатированный фукоидан не обладал способностью связываться с фибронектином и, как следствие, утрачивал способность ингибировать адгезию клеток яичников китайского хомячка СНО-К1 [195].
Фукоидан из Laminaria japonica со средней молекулярной массой 75 кДа в дозе 100 мг/кг снижал массу первичной опухоли карциномы легких Льюис и уменьшал количество и суммарную площадь метастатических очагов на 34 и 45.2 % соответственно [196]. С практической точки зрения важной представляется способность фукоиданов из Laminaria cichorioides и Fucus evanescens [197] потенцировать антиметастатическое действие циклофосфана на развитие аденокарциномы Эрлиха у беспородных мышей-самок и карциномы легких Льюис (АЛЛ) у мышей-самок линии C576BL/6. При сочетанном введении иммунодепрессанта и фукоидана в дозе 50 мг/кг количество метастазов было почти в два раза меньше, а их площадь в 2.5 раза меньше, чем при введении только цитостатика. Таким образом, на модели перевиваемой аденокарциномы легких Льюис мышей было показано, что фукоидан обладает самостоятельной противоопухолевой и умеренной антиметастатической активностями, а также способностью к потенцированию антиметастатической, но не противоопухолевой активности цитостатического препарата циклофосфана.
Трансфекция и культивирование стабильных клеточных линий
В ИК спектре FeF2 (аналогично спектрам фукоиданов из 5. cichorioides, S. japonica и U. pinnatifida) наблюдалось поглощение при 1230-1256 см"1 и полоса поглощения при 829 см 1, которые свидетельствовали о наличии сульфатных групп при С2 остатка фукозы в полисахариде (рис. АЛ Б, Приложение А).
В 13С ЯМР спектре фукана FeF2 наблюдали характерные сигналы для С1 (99.9 м.д.) и С6 (около 16.6 м.д.) a-L-фукопиранозы, а также сигналы, указывающие на присутствие ацетатных групп (21.7 м.д., СНз; 175.9 м.д., С=0) в полисахариде (рис. Б.1 Б, Приложение Б). Показано, что фукоидан из F. evanescens содержал помимо фукозы минорные компоненты -ксилозу, маннозу и галактозу. Положение минорных компонентов в структуре фукоидана не было установлено. Полученные данные согласуются с литературными [50].
Для более детального структурного анализа фукана FeF2, полисахарид деполимеризовали методом автогидролиза и полученные олигосахариды анализировали с помощью МАЛДИ ВП и ИЭР масс-спектрометрии [296, 307]. Смесь состояла из моносульфатировашюй фукозы и набора фукоолигосахаридов с четной степенью полимеризации (п = 2-6), с числом сульфатных групп до 5. Обнаружены олигосахариды в минорных количествах, содержащие наряду с фукозой остатки гексозы (в данном случае -галактозы, исходя из моносахаридного состава смеси) (рис. В.1 Б, Приложение В). Исследование олигосахаридов, полученных после сольволитического десульфатирования фукоидана из Fucus evanescens, позволило авторам установить структуру минорных фрагментов фукоидана. Анализ масс-спектров олигосахаридов, полученных из фукоидана FeF2, дал следующий состав смеси: [- 3)-a-L-Fucp-2-SC 3"-(l- ]n, п = 1-4; p-0-Galp-2-S03 -(l-»4)-p-D-Ga!/ ; a-Fucp-2-S03"-(l- 4)-a-L-Fucp-2-S03"; a-L-Fucp-(l- 3)-GlcA; a-L-Fucp-(l- 4)-a-L-Fucp-(l- 3)-GlcA; a-L-Fucp-(l- 3)-a-L-Fucp-(l- 4)-GlcA [296, 307]. С помощью ИЭР масс-спектрометрии в FeF2 был установлен тип связи между остатками Fuc и Gal; обнаружены остатки глюкуроновой кислоты и определен тип ее связей с остатками фукопиранозы [296,307].
Фракция фукоидана с такой же углеводной цепью, но с другим расположением сульфатных групп была выделена из Fucus evanescens [50]. Строение этого полисахарида было установлено после интерпретации ID и 2D спектров 1Н- и 13С-ЯМР продуктов его десульфатирования, дезацетилирования и метилирования. Показано, что главным структурным элементом молекул полисахарида является повторяющаяся последовательность [— 3)-a-L-Fucp-(l— 4)-a-L-Fucp-(l—»]„. Полисахарид сульфатирован главным образом по С2 и в меньшей степени по С4. Ацетильные группы занимают свободные положения при С4.
Следует отметить, что Кусайкин М. и др. выделили фракцию полисахарида из F. evanescens, в котором по данным метилирования содержание 1—»3-связанных остатков a-L 95 фукопиранозы превышало содержание 1— 4-связанных в 3,5 раза [91]. Для структурных исследований авторы [91] использовали один и тот же образец водоросли. Структурные различия фукоиданов можно связать со способом выделения полисахаридов. В нашем случае мы выделили высокосульфатированный фукоидан со структурой, аналогичной структуре фукоидана, описанной в работах [308].
Основная часть полисахаридов D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. представлена альгинатами (табл. 3.2). Содержание в них водорастворимых полисахаридов, представленных практически только одними фукоиданами (ламинараны отсутствовали), было невелико. Суммарные выходы фукоиданов для водорослей D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp. составляли 0.3, 0.2 и 1.2 % соответственно от веса обезжиренной водоросли (рис. 3.2 3, И, К, табл. 3.2). Фукоиданы, выделенные нами из D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp., оказались сульфатированными гетерополисахаридами. Фракции фукоиданов, полученные после анионообменной хроматографии водорастворимых полисахаридов, содержали фукозу, галактозу, маннозу, ксилозу, рамнозу и глюкозу. Основным моносахаридным остатком практически всех фукоиданов являлась фукоза, исключение составлял высокосульфатированный гетерогенный полисахарид PpF3 с высоким содержанием галактозы. Гетерогенная структура фукоиданов, выделенных из D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp., подтверждалась данными С ЯМР спектроскопии. Как и у многих других фукоиданов из бурых водорослей, 13С ЯМР спектры полученных нами фукоиданов являлись сложными и малоинформативными для анализа структуры. Тем не менее, в них можно было выделить группы сигналов в аномерной области (96-104 м.д.), а также типичные для а-/ фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных полей (16.5-16.9 м.д.). Сигналы 21.5-22.0 м.д. (СН3) и 175.3-176.1 м.д. (С=0) в 13С ЯМР спектрах фракций DpF3, DpF4, PpFl, PpF2, PpF3, SF1 и SF4 свидетельствовали о наличии ацетатных групп.
Из водорослей Средиземного моря нами были выделены как низко-, так и высокосульфатированные фукоиданы. Наименьшая степень сульфатирования (4.4-6.2 %) наблюдалась у фракций DpFl, PpFl и SF1, элюированных раствором NaCl невысокой концентрации (0.1-0.9 М). Наиболее высокосульфатированными были фракции DpF4, PpF3 и SF4 (13.4-28.8 %). Полифенолы отсутствовали во фракциях фукоиданов, выделенных из D. polipodioides, содержание их в фукоиданах из P. pavonica не превышало 1.5 %, а в Sargassum sp. - 7.6 %. Белки отсутствовали во всех фракциях фукоиданов.
Согласно литературным данным, фукоидан, выделенный из бурой водоросли P. pavonica (Средиземное море, Арабская Республика Египет), является сульфатированным гетерогенным полисахаридом, содержащим фукозу, галактозу, ксилозу, маннозу, глюкозу и глюкуроновую кислоту [34]. Фукоиданы бурых водорослей рода Sargassum в большинстве своем представляют собой сульфатированные гетерополисахариды [51, 57]. Результаты, полученные в настоящей работе, хорошо согласуются с литературными данными.
Бурая водоросль S. hornery относится к семейству Sargassaceae порядка Fucales (табл. 3.1). Фукоидан ShFl, выделенный из S. horneri, представлял собой сульфатированньтй фукан, содержащий следовые количества галактозы и рамнозы, фукоидан ShF3 — сульфатированньтй рамнофукан (рис. 3.2 Л, табл. 3.2). Степень сульфатирования ShFl и ShF3 составляла 14.9 и 16.9 % соответственно. В С ЯМР спектрах фукоиданов ShFl и ShF3 присутствовали интенсивные сигналы в аномерной области, характерные для 1— 3-связанных остатков фукозы (100.0—100.3 м.д.), и сигналы меньшей интенсивности, соответствующие остаткам 1— 4-связанной фукозы (98.9-99.7 м.д.). Вызывает интерес отсутствие сульфатных групп во фракции ShF2, элюируемой соответственно между фракциями ShFl и ShF3. Фукоидан ShF2 состоял в основном из фукозы и небольшого количества рамнозы (табл. 3.2). 13С ЯМР спектр ShF2 содержал сигналы 99.1 и 94.8 м.д. приблизительно равной интенсивности, характерные для 1— 3- и 1—И-связанных несульфатированных остатков фукозы [294]. Отсутствие сульфатных групп у фукоидана ShF2 подтверждено данными химического анализа. Причины сорбции его на анионообменной смоле не установлены.
