Введение к работе
- Актуальность проблемы. В последние 10-15 лет значительно увеличилось число публикаций, связанных с изучением 1->3- и 1—>3;1->6-Р-0-глюкаіюи и ферментов, катализирующих их преобразование. 1->3;1->6-P-D-Duokooai;io- и полисахариды являются полнфункцпоналышми соединениями. Спектр выполняемых ими функций колеблется от резервных и структурных до функций клеточного "узнавания".
Наибольший интерес вызывают пммуномодулирующие свойства этих глюканов. Они запускают множество реакций защиты хозяина, например, штиопухолевую активность у животных, наработку защитных PR-белков и :воеобразных антибиотиков — фнтоалексинов у растений. Поэтому участие 1—>3;1—>6-р-0-глюканов в иммунитете как животных, так и растений изучается іаиболее интенсивно. Это связано прежде всего с перспективами создания сак нетоксичных иммуностимуляторов, так и экологически чистых средств іащнтьі растений, действие которых основано на стимуляции природных іеханизмов защиты. Так, 1->3;1->6-р-П-глюканы применяются в качестве [репаратов антиопухолевого и иммуностимулирующего действия в клиниках [понии (лентинан и шизофиллан из грибов) и США (частпчковый глюка и из рожжеп) .
В преобразованиях 1->3;1—>6-р-В-глюкапов принимают участие l->3-p-D-
моканазы — ламинариназы. Изучение механизмов ферментативного ката-
иза относится к центральным проблемам молекулярной биологии, глнкозиль-
ый же транспорт, в свою очередь, является важнейшей биохимической реак-
ией. В частности, ферментативная деградация полисахаридов — один из
іундаментальньїх молекулярно-биологическпх процессов (например, рагщеп-
зние крахмала, целлюлозы, ламннаранов). Катализирующие деградацию по-
исахаридов карбогидразы наиболее широко применяются в про-
ышленности. Среди карбопідраз 1->3-р-0-глюканазы занимают, как сейчас долне обосновано можно утверждать, особое место, отличаясь разпооб-їзием каталитического действия на субстраты, что объективно обусловлено чогообразием структур и физико-химических свойств их субстратов — -*3; 1-»6-р-0-глюканов. Поэтому, изучение механизма действия 1—>3-fJ-D-юканаз актуально как с теоретической, так и с практической точек зрения, го связано с созданием новых веществ, в т.ч. лекарств, новых технологий, а кже с новыми решениями проблем познания основ функционирования ;рмеитов.
Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение механизма действия и специфичности трех эндо-1->3-р-0-глюканаз из морских моллюсков (ЛШ, AIV из Spisula sachalincnsis и Ло из Chlamys albidus), а также синтез с помощью ферментов изученной специфичности биологически активных 1->3;1-»6-Р-0-глюканов из неактивных исходных полисахаридов.
Поскольку изучение распределения продуктов ферментативных реакций является в настоящее время основным, а часто и единственным источником информации об особенностях структуры и механизма действия карбогндраз, в задачи настоящего исследования входили разработка методов выделения, качественного и количественного анализа глюкоолиго- и полисахаридов и различных гликозидов, а также поиск и установление структуры ламипара-нов из различных видов бурых водорослей и природных ингибиторов ламинариназ.
Научная ценность. Впервые для 1—>3-р-И-тАіоканаз эндо-тпгщ действия проведено систематическое экспериментальное исследование совместного протекания реакций гидролиза и трансглпкозилировапия. Информация, полученная в результате этого исследования, практически отсутствует для эндо-глкжаназ, хотя она представляет как научный, так и практический интерес, и необходима для выяснения сложных аспектов взаимодействия карбогндраз с полисахаридами.
При взаимодействии 1—>3-р-0-глюкапаз из морских моллюсков с субст
ратами скорость процесса трансгликозилпрованпя в 20 тысяч раз превышает
скорость гидролиза в случае лучших акцепторов, что отличает изучаемые
ферменты от других групп карбогндраз. t
Исследована специфичность ферментов по отношению к структуре субстрата — донора гликозильных остатков. Установлено, что процесс гидролиза, катализируемый Ло и AIV, малочувствителен к изменениям в структуре доноров, в то время как эффективность процесса трансгликозилпрованпя с увеличением доли 1—>6-СБЯзанной глюкозы в 1—>3;1—>6-p-D-rAiOKanax уменьшается более, чем на порядок.
Получена информация об особенностях структуры акцепторов, которые имеют критическое значение для их специфического взаимодействия с эпдо-1—»3-Р-В-глюканазами и, соответственно, о структурах акцепторных участков активных центров ферментов. Показано, что акцепторный участок комплементарен остатку глюкозы и имеет гидрофобную область вблизи восстанавливающего конца молекулы.
Исследуемые эндо-1-»3-р-0-глюканазы специфичны к гидролизу р-1->3-глюкозидной связи. В процессе трансглпкозилировапия ЛІУ катализирует синтез только Р-1->3-глюкозидной связи, в то время как Ло отличается гораздо
меньшей специфичностью и способна, помимо р-1—>3-глюкозндпой СВЯЗИ, катализировать синтез (3-1->4- и р-1—>6-глюкозидных связей. Благодаря этому, именно под действием Ло образуется из исходного ламннарана новый 1—>3;1—>6-р-0-глюкан большей молекулярной массы с высоким содержанием 1-»6-связей, названный трансламом.
Изучение специфичности и механизма действия эндо-1—>3-(3-0-глюкапаз Ло, ЛГУ и Л III из близкородственных источников позволило сделать вывод, что среди них ЛГУ является високоспецпфичпым ферментом как в реакциях гидролиза, так и трансгликозилнрованпя. Поэтому для структурных исследований углеводов можно рекомендовать только ЛІУ.
Среди исследованных ламинаранов обнаружены ламннараны необычного строения, источниками которых являются как дальневосточные, так и тропические виды водорослей.
В губках семейства Halichondriidac обнаружены природные ингибиторы эндо-1->3-Р-0-глюканаз — халистанол и сокотрастерин сульфаты. Выявлены другие потенциальные источники ингибиторов.
Практическая ценность работы.
1. Впервые из биологически неактивного ламннарана был осуществлен
ферментативный синтез нового 1->3;1->6-р-Г>глюкана — транслама, обладаю
щего эффективным иммуномодулирующпм, антибактериальным и радпопро-
текторным действием. В литературе отсутствуют сообщения, свидетельствую
щие о ферментативном синтезе биологически активного полисахарида из
неактивного исходного под действием карбогпдраз эндо-тппа действия.
2. В настоящее время практически закончена стадия доклинических
испытаний транслама как препарата для лечения острой лучевой болезни. От
зарубежных аналогов транслам отличается прекрасной-растворимостью, отсу
тствием токсичности, пир огенности и нежелательных эффектов, связанных с
нерастворимостью этих глюканов. В России препараты, подобные трансламу,
отсутствуют.
-
Предложен технологически значимый метод получения транслама, в основе которого лежит его сорбция на гидрофобном сорбенте.
-
Предложены ферментативные методы получения различных рядов p-D-глюкоолигосахаридов, а также Np- и метплглпкозндов. Выход целевых продуктов составляет от 5 до 40%..
-
Разработаны методы выделения p-D-глюканов из водорослей, олпго- и полисахаридов из продуктов ферментативной трансформации 1—>3;1—>6-()-D-глюканов. Один из предложенных нами методов выделения полисахаридов с помощью гидрофобного сорбента представляет собой одностадийный процесс, позволяющий проводить извлечение углеводов из очень разбавленных по
основному веществу растворов и экстрактов. Метод является технологичным и может быть применен на предприятиях, ведущих переработку бурых водорослей, для выделения из отваров водорослей таких ценных полисахаридов, как ламинаран и фукоидан.
6. Найдены источники 1—>3; 1—>(3-р-0-глюканов различной структуры. Результаты изучения распространения ламинаранов в бурых водорослях представляют интерес для ресурсоведения.
Апробация работы и публикации. Основное содержание работы изложено в 20 статьях в центральных и международных изданиях. По результатам работы получено 8 авторских свидетельств.
Материалы диссертации докладывались на Международном симпоузиме стран СЭВ "Химия углеводов и их производных" (Москва, 1983 г.), на Всесоюзном симпоузиме "Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты" (Москва, 1984 г.), на XII и XIV Менделевских съездах (Баку, 1981 г., Ташкент, 1989 г.), на Специальном симпоузиме и 16-й Конференции ФЕБО (Греция, 1982 г., Москва, 1984 г.), на III, IV п V Всесоюзных биохимических съездах (Рига, 1974 г., Ленинград, 1980 г., Киев, 1986 г.), на III Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных продуктов (София, 1985 г.), на Дунайском симпоузиме по хроматографии (Ялта, 1985 г.), на XIII Международном конгрессе по биохимии (Амстердам, 1985), на XIII Международном симпоузиме по углеводам (Нью-Йорк, 1986 г.], на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987 г.), на VI Всесоюзном симпоузиме "Инженерная энзимологня" (Вильнюс, 1988 г.), на VII Симпоузиме ФРГ-СССР по химии пептидов п белком (Дплижап, 1989), на IV Всесоюзной конференции "Химия, фармакология и механизмы действия противолучевых средств" (Москва, 1990 г.), на IV Советско-шведском симпоузиме по углеводам (Лунд, 1990 г.).
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, литературного
обзора, содержащего сведения о механизмах действия карбогндраз,
структурах и биологической функции 1—>3;1->6-(3-0-глюканов, четырех глав с
изложением собственных результатов, экспериментальной части и выводов.
Диссертация содержит стр., 36 таблиц, 24 рис., 12 схем и список
