Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Цитолитические полипептиды актиний: структура, свойства, механизм действия 5
2.1. Кишечнополостные - богатый источник биологически активных полипептидов. Цитолизины актиний 5
2.2. Некоторые биологические аспекты в изучении цитолизинов актиний 8
2.3. Биохимические и функциональные характеристики цитолизинов актиний I-IV групп 10
2.3.1. Низкомолекулярные цитолизины актиний 10
2.3.2. Цитолизины актиний II группы. Актинопорины 12
2.3.2.1. Первичная структура актинопоринов 13
2.3.2.2. Пространственная структура актинопоринов 17
2.3.2.3. Взаимодействие актинопоринов с липидными мембранами 23
2.3.2.4. Молекулярный механизм порообразования 27
2.3.2.5. Фармакологические исследования актинопоринов 36
2.3.3. Цитолизины актиний III группы 39
2.3.4. Цитолизины актиний IV группы 40
2.4. Перспективы исследования цитолизинов актиний 41
3. Результаты и обсуждение 43
3.1. Выделение и некоторые физико-химические характеристики цитолизинов R. macrodactylus 44
3.2. Взаимодействие RTX-S II с липидами и бислойными липидными мембранами51
3.3. Установление первичной структуры актинопорина RTX-S II 55
3.3.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 55
3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участка гена, кодирующего зрелый актинопорин 56
3.4. Исследование конформационной стабильности и гемолитической активности актинопорина RTX-S II 60
3.4.1. Исследование пространственной организации актинопорина RTX-S II 60
3.4.2. Исследование конформационных изменений в структуре актинопорина при действии различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) 62
3.4.3. Исследование влияния различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) на гемолитическую активность RTX-S II 72
3.5. Влияние RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedius 76
3.6. Сравнительное изучение структуры комплексов актинопорина с G-актином и гельзолина с G-актином методами компьютерного моделирования 77
3.6.1. Построение модели пространственной структуры RTX-S II 78
3.6.2. Теоретическое предсказание структур комплексов актинопорин-актин в сравнении с комплексом актин-S 1 гельзолин 80
3.7. Исследование межмолекулярного взаимодействия RTX-S II и G-актина 83
4. Экспериментальная часть 90
4.1. Материалы 90
4.2. Методы 90
Выводы 102
- Некоторые биологические аспекты в изучении цитолизинов актиний
- Взаимодействие актинопоринов с липидными мембранами
- Перспективы исследования цитолизинов актиний
- Исследование конформационной стабильности и гемолитической активности актинопорина RTX-S II
Введение к работе
Поиск высокоспецифичных биологически активных соединений (потенциальных компонентов для создания фармакологических препаратов или биодобавок), исследование механизма их действия, изучение структурно-функциональных отношений, являются важнейшими задачами биоорганической химии. Особый интерес представляют цитолитические токсины белковой природы -уникальный по химической структуре и физиологическому действию класс биологически активных соединений, продуцируемых ядовитым аппаратом некоторых насекомых, рептилий, морских беспозвоночных, а также микроорганизмами.
Благодаря своему мембранотропному действию, цитолизины выступают в качестве цитоплазматических маркеров, являются незаменимым инструментом исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Знание первичной структуры и пространственной организации этих соединений позволяет делать выводы о центрах связывания с мембранными рецепторами и приводит к пониманию ряда процессов, происходящих на клеточном уровне. Несмотря на большой интерес к цитолитическим полипептидам различных микро- и макроорганизмов, структурная организация и механизм их действия остаются недостаточно изученными.
Бурное развитие как физических, биохимических, молекулярнобиологических методов исследования, так и методов компьютерного моделирования, позволяет в настоящее время успешно определять структуры первичных и вторичных метаболитов, изучать свойства и механизмы действия этих соединений in vitro, in vivo и in silica.
Настоящая работа представляет собой часть исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структурно-функциональных взаимодействий биологически активных полипептидов морских беспозвоночных. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств актинопорина, выделенного из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению его первичной структуры, исследованию его пространственной организации, а также изучению механизма действия этого полипептида.
5 2. Литературный обзор. Цитолитические полипептиды актиний: структура, свойства, механизм действия
Цитолитические полипептиды (цитотоксины, цитолизины, гемолизины) — это соединения, которые при взаимодействии с цито плазматической мембраной вызывают нарушение её структуры, приводящее к потере морфологической целостности клеток.
По механизму действия такие вещества принято делить на три группы. К первой относят соединения, обладающие детергентоподобным действием, приводящим к солюбилизации липидов или белков, входящих в состав мембраны. Вторую группу составляют белковые соединения, обладающие способностью расщеплять сложноэфирные связи в липидах, что приводит к нарушению структуры бислоя, увеличению клеточной проницаемости и лизису клетки. К ним относятся фосфолипазы Ai и А^, которые продуцируются различными микро- и макроорганизмами. Третья группа включает полипептиды, образующие ионопроницаемые для внутриклеточного и внеклеточного материала каналы (поры) при связывании со специфическими рецепторами на поверхности мембраны. В эту группу входят антибиотики, подобные грамицидину и аламецетииу, тиол-активируемые цитолизины бактерий, а также цитолитические поли пептиды морских червей и кишечнополостных [1].
Исследование структурной организации и механизма действия цитолизинов проводится как с помощью традиционных методов белковой химии, так и методов молекулярной биологии, с использованием оптических, морфологических, электрофизиологических и других физико-химических методов.
Некоторые биологические аспекты в изучении цитолизинов актиний
Показано, что один вид может продуцировать большое количество изотоксинов с молекулярной массой 20 кДа. Например, в A. equina обнаружено 5 изоформ эквинатоксина, и для каждой существует свой ген [32]. Более того, R. macrodactylus содержит цитолизины с молекулярной массой как 5-8, так и 20 кДа [18, 30]. В отличие от других кишечнополостных, точное место локализации цитолизинов в организме актиний пока не установлено, несмотря на существующее мнение, что они продуцируются и высвобождаются нематоцистами. В настоящее время лишь для нескольких токсинов показано, что они локализованы в нематоцистах [3, 23, 33]. Цитолитические полипептиды могут выделяться актиниями при механическом раздражении, в результате сжатия [19, 34], но ие ясно, высвобождаются они из нематоцист или из других органелл. Так, было показано, что гемолизин Phymactis clematis с молекулярной массой 20 кДа, названный колентеролизином, присутствует в гастроэнтеральной жидкости [25]. Авторами было показано, что гемолизины, обнаруженные в щупальцах и выделенные из экстрактов целых актиний, различны. Более того, Клаг и соавт. [35] обнаружили, что выделение нематоцист из щупалец A. equina, известного продуцента цитолизинов, непосредственно в суспензию эритроцитов не вызывало гемолиза, в отличие от нематоцист некоторых других видов полипов и медуз. Интересным является тот факт, что актиния Anemonia sulcata, принадлежащая к семейству Actiniidae, не продуцирует соединений с цитолитической активностью [36]. Таким образом, эти наблюдения показывают, что до сих пор не ясны биологические аспекты хранения и высвобождения цитолизинов актиний. Как известно, актинии питаются небольшими ракообразными, рыбами и планктоном. Однако некоторые разновидности рыб и ракообразных живут в симбиозе с актиниями [31]. Токсикологические исследования, проведенные с живыми актиниями, а также с использованием ракообразных и рыб показали, что уже при низкой концентрации в морской воде (0,5 мг/мл) цитолизины повреждают жабры, что является причиной гибели несимбиотических рыб. Для рыб-симбионтов установлено, что при длительном контакте с актиниями они приобретают устойчивость к действию цитолитических поли пептидов [37]. Обнаружено, что покрытые хитином жабры ракообразных устойчивы к действию цитолизинов при концентрациях до 100 мг/мл.
Однако, при введении непосредственно в гемополость, цитолитические полипептиды являются для них летальными [38]. Менарди и соавт. [39] в своей работе объясняют устойчивость актиний к собственным цитолизинам тем, что в мембранах клеток актиний сфингомиелин находится в измененной форме. Они показали, что в отличие от сфингомиелина, этот аналог не является акцептором для цитолизинов с молекулярной массой 20 кДа и это может быть основой самоустойчивости. 2.3. Биохимические и функциональные характеристики цитолизинов актиний I-1V групп 2.3.1. Низкомолекулярные цитолизины актиний Цитолитические полипептиды, выделенные из актиний R, macrodactylus [18], Tealia felina L. [40] и Condilactis aurantiaca [17], отнесены к I группе. Низкомолекулярные Radianthus-цитолизины Rml и Rmll и теалиатоксин из Т. felina L. - это высокоосновные полипептиды с молекулярной массой 5,1 кДа, 6,1 кДа и 7,8 кДа, соответственно. Отличительной чертой аминокислотного состава этих полипептидов является отсутствие остатков триптофана и метионина, наличие большого количества заряженных аминокислотных остатков и четырех остатков цистеина, что позволяет предположить наличие двух внутримолекулярных дисульфидных связей (таблица 2.3). Гемолитическая активность Rml и Rmll составляет 25 и 20 ГЕ/мг, соответственно, что на 3 порядка ниже активности цитолизинов актиний II группы [11]. При исследовании липидной специфичности этих цитолизинов было показано, что в отличие от высокомолекулярных цитолизинов актиний, прединкубация этих полипептидов с дисперсией экзогенного сфингомиелина или холестерина не уменьшает их гемолитическую активность, следовательно, они имеют отличный от других цитолизинов механизм мембранотропного действия. Элиот и соавт. [40] обнаружили, что теалиатоксин, помимо невысокой гемолитической, обладает также и антигистаминной активностью, наличие которой у цитолизинов актиний было выявлено впервые. Биоиспытания суммарного препарата Rml и Rmll, проведенные на мышах, также свидетельствуют о наличии антигистаминной активности у этих цитолизинов [18]. 2.3.2. Цитолизины актиний II группы. Актинопорины Сфингомиелинингибируемые цитолизины с молекулярной массой около 20 кДа — самая многочисленная группа цитолизинов, продуцируемых актиниями (табл. 2,2). В 1988 году Кем предложил называть эти цитолизины актинопоринами ввиду их способности образовывать поры в липидной мембране [41]. По систематической ШВМВ классификации они являются трансмембранными поли пептидами, принадлежащими к семейству пороформирующих эквинатоксинов 1.С38 [42].
Актинопорины являются однодоменными, не содержащими цистеин полипептидами с изоэлектрической точкой выше 9. Механизм их действия связан с образованием в липидной мембране катионселективных пор диаметром до 2 нм, состоящих из трех - четырех молекул полипептида [10, 11, 43, 44]. Проводимость каналов, формируемых актинопоринами в модельных липидных мембранах, составляет от 100 до 225 пСм в 0,1 М КС1 [11]. На рисунке 2.1 приведены частичные и полные аминокислотные последовательности актинопоринов, установленные методами структурной белковой химии, а также выведенные на основании полученных кДНК последовательностей. Зрелые актинопорины, состоящие из 175 - 179 аминокислотных остатков, формируют уникальное белковое семейство, не имеющее гомологии с другими известными белками. Идентичность аминокислотных остатков изотоксинов, выделенных из одного вида актиний, составляет более 80%, а с учетом консервативных замен - до 95%. Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей актинопоринов обнаружена также внутри семейств Actiniidae и Stichodactylidae. У актинопоринов, принадлежащих к различным семействам, степень идентичности составляет более 60%. Так, идентичность аминокислотных остатков EqtII со Stnl и Magn составляет около 64%, а с учетом консервативных замен - более 80%. Первичная структура актинопоринов имеет ряд характерных особенностей. У всех полипептидов имеется последовательность на N-концевом участке молекулы (17-26 АК остатки для EqtII и 14-23 АК остатки для Stnll, рис. 2.1), находящаяся в форме а-спирали. Это было предсказано для большинства актинопоринов расчетными методами [17] и доказано реитгеноструктурным анализом EqtII и Stnll [47, 48]. Аналогичные N-концевые а-спиральные участки последовательностей имеют мелиттин (цитолизин из яда пчелы) и бактериальный пептид SV5 (Paramyxovirus, PDB 1SVF), обладающие гемолитической активностью [46]. Во всех известных последовательностях актинопоринов имеется последовательность, содержащая остатки аргинина, глицина и аспарагиновой кислоты, так называемый RGD-мотив (144-146 АК остатки для EqtII) и высоко консервативный участок, содержащий остатки триптофана (112-WYSNWW-117 АК для EqtII). Интересно отметить, что подобный участок, обогащенный остатками триптофана, обнаружен в аминокислотной последовательности перфинголизина О (458-ECTGLAWEWWRDV-470), холестерин-зависимого цитолизина из грамположительной бактерии Clostridium perfringens [49].
Взаимодействие актинопоринов с липидными мембранами
В 1976 г. Берхеймер и Эвигад [16] впервые показали, что сфингомиелин является специфическим мембранным акцептором для актинопорина из Stoichactis helianthus, однако, позже было показано, что эти цитолизины обладают аффинностью к целому ряду липидов, формирующих моно- и бислойные мембраны [67-69]. Установлено, что цитолитическая активность актинопоринов ингибируется дисперсией экзогенного сфингомиелина, а также сывороткой крови, содержащей липопротеины [70-72]. При исследовании механизма действия актинопоринов на модельные мембраны различного липидного состава было показано, что они обладают поверхностно-активными свойствами. Так, цитолизин C-III из S. helianthus вызывает увеличение поверхностного натяжения в системе воздух/вода или гептан/вода. Этот эффект увеличивался в монослоях, содержащих сфингомиелин (СМ) и дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) [73]. Более детальное изучение поведения EqtII в СМ, фосфатидилхолиновых (ФХ), ФХ/СМ монослоях показало, что при благоприятных условиях, т.е. когда поверхностное натяжение ниже критического, сродство EqtII к СМ значительно больше, чем к ФХ и ФХ/СМ [69]. Во всех экспериментах по изучению проницаемости липосом и проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ), сформированных из липидов с различным содержанием СМ, специфическое взаимодействие актинопорина со СМ проявлялось в значительно большей степени, однако, точная роль СМ в модельных системах все еще неясна [67, 74-78]. Существуют различные точки зрения относительно роли липидов в процессе связывания актинопоринов с мембраной. Согласно экспериментальным данным, полярные липидные группировки способны модулировать пороформирующую активность, но при этом они не участвуют в связывании актинопоринов с мембраной. Так, фосфоаналог сфингомиелина не является акцептором для актинопорина [39]. EqtII взаимодействует с липосомами, содержащими ФХ, без внедрения в бислой, тогда как взаимодействие со СМ-содержащими липосомами необратимо, при этом происходит встраивание полипептида в мембрану [69]. Константы связывания Eqt II с моноламиллярными липосомами, содержащими СМ, СМ/ФХ и пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ), составляют 1,42х105, 0,51х105 и 0,094х105 М"\ соответственно [79]. Необратимое связывание Eqt II со СМ/ФХ (1:1) и обратимое связывание с чистыми ФХ-содержащими мультиламилярными липосомами характеризуется константами, равными 2,07хЮ5-7,24хЮ5 и 8,74х104 Ы \ соответственно [69]. Показано, что EqtII более эффеЕстивно связывается с анионным фосфатидилглицерином (ФГ), чем с амфотерным ионом ФХ.
При встраивании полипептида в липидный ФГ-бислой наблюдается фазовый переход липидов от гелеобразного до жидкокристаллического состояния [80]. Это согласуется с предыдущими экспериментальными данными, показывающими, что организация липидов с непредельной жирной кислотой [75], или свободных непредельных жирных кислот, а также спиртов в мембранах такова, что способствует проницаемости ФХ/СМ липосом при действии на них EqtII [81]. Предполагается, что связывание EqtII с липидным матриксом зависит также от размера и кривизны липосом. Обнаружено, что моноламиллярные липосомы (SUV), модифицированные EqtII, имеют более низкую проницаемость по сравнению с мультиламиллярными липосомами (LUV) того же липидного состава [43]. Более того, ряд анионных липидов: фосфатидная кислота (ФК) кардиолипин (КЛ) фосфатидилинозитол (ФИ) - фосфатидилсерии (ФС) - ФГ, а также положительно заряженный стеариламин (СА) и амфотерный фосфатидилэтаноламин (ФЭ) при совместном присутствии с ФХ и СМ значительно увеличивают скорость и степень проницаемости LUV при действии StnL Алварсз и соавт. [82] предположили, что такое увеличение пороформируюшей активности (промоторный эффект) является следствием увеличения отрицательного заряда бислоя при введении дополнительных липидов. Установлено, что мембраны, состоящие из бинарных или тройных смесей липидов и содержащие СМ, наиболее чувствительны к актинопоринам [68, 69, 76, 82]. При добавлении холестерина (30 %) к ФХ мембранная проницаемость, вызываемая Eqt П, заметно увеличивается, но только при низкой температуре [69]. Связывание актинопоринов с липидами обусловлено как электростатическими, так и гидрофобными взаимодействиями. Следует отметить, что совместное присутствие липидов в бислое влияет на активность актинопоринов. Такие факторы, как природа жирнокислотного радикала и толщина мембраны [75, 78, 81], гель-кристаллический фазовый переход липидов [80], наличие липидных микродоменов [68] и отрицательный заряд мембран [82] способны модулировать процессы порообразования. Очевидно, что проницаемость липидного бислоя не зависит от химической природы одного особого вида липидов. Таким образом, мембранная поверхностная микрогетерогенность, вызываемая липидным фазовым переходом, или смешением двух полярных липидов, или добавлением холестерина к полярному липиду, может быть одной из причин наблюдаемых эффектов, что непосредственно подтверждено экспериментальными данными для Stnll [68]. Структура поры, формируемой Stnll в ФХ монослое, исследована методом электронной микроскопии с разрешением 15 А [61]. Показано, что пора сформирована четырьмя молекулами актинопорина. В этом тетрамере наблюдается две различные ориентации мономеров - параллельно плоскости мембраны и под углом 60. Адсорбируемый мембраной мономер напоминает по форме перчатку с двумя большими и одним маленьким выступами. Наиболее протяженный участок мономера Stnll составляет около 51 А, что значительно длиннее молекулы EqtII.
Предполагается, что Stnll, адсорбируясь на мембране, делится на две половины относительно самой длинной оси в молекуле. Интересно, что в растворе Stall существует преимущественно в виде тетрамеров [83], тогда как EqtII, в основном, в виде димеров [46]. Пока не совсем ясно, необходима ли тетрамеризация молекул Stnll в растворе для связывания с мембраной или она играет важную роль в процессе порообразования [61]. Фундаментальная задача, связанная с выяснением механизма взаимодействия любых пороформирующих токсинов с мембранами, - это установление и идентификация структурных доменов белков, непосредственно вовлеченных в связывание с компонентами мембраны [49]. При сокристаллизации Stnll с ФХ (разрешение 2,4 А) было выявлено наличие центра связывания, характерное для всех представителей семейства актинопоринов [48]. Было показано, что в структуре Stnll имеется впадина размером 9x11x13 А, что способствует проникновению и связыванию молекулы ФХ (рис. 2.7). Центр связывания частично гидрофилен вследствие близкого расположения фенольных гидроксильных групп аминокислотных остатков Туг-131, Туг-135 и Туг-136 и гидроксильных групп остатков Ser-52 и Ser-103 соседних участков цепи. В то же время близкое расположение гидрофобных радикалов остатков Val-85 и Pro-105 соседних участков цепи, а также ароматических колец радикалов остатков Туг-111 и Туг-135 обусловливает частичную гидрофобность центра связывания. Следует отметить, что все аминокислотные остатки, входящие в состав центра связывания Stall с ФХ, Показано, что в активном центре положительный заряд холиновой группировки стабилизируется тг-катионными взаимодействиями между электронно-избыточными системами ароматических колец радикалов аминокислотных остатков Туг-111 и Туг-135. Фосфатная группа ФХ взаимодействует с фенольными гидроксигруппами радикалов остатков Туг-111 и Туг-136 и, вероятно, такой комплекс стабилизируется за счет положительного заряда остатка Arg-51 соседнего участка цепи (рис. 2.7А). При сравнении структур свободного Stnll и комплекса StnII/ФХ обнаружены некоторые существенные конформационные изменения в структуре петли между рб и р7-стрендами. Такие структурные перестройки боковых цепей способствуют связыванию с ФХ (рис. 2.7Б). Ранее для актинопоринов Stnl и Stnll с помощью ИК спектроскопии было установлено, что в процессе связывания с липидной мембраной происходят конформационные изменения во вторичной структуре полипептидов: незначительное увеличение содержания р-складчатой структуры ( от 45-50% до 56-58%) и а-спирали (от 12-15% до 18-20%), уменьшение содержания неупорядоченной структуры (от 19-22% до 9-10%) и р-изгибов (от 18-20% до 15%) [59].
Перспективы исследования цитолизинов актиний
Накопленные за три последних десятилетия данные о биологически активных соединениях актиний показывают, что актинии продуцируют, по крайней мере, четыре различных класса цитолизинов. Необходимость поиска и дальнейшие исследования цитолизинов с молекулярной массой 5-8 и 80 кДа очевидны, так как их биохимических свойства, структурная организация и механизм действия практически не изучены. Дальнейшие исследования актиний могут привести к пополнению уже известных групп цитолизинов или даже к открытию новых типов. Так, Гафуров и соавт. [134] обнаружили, что щелочная ДНК-аза, выделенная из R. macrodactylus, проявляет гемолитическую активность. Актинопорины, составляющие самую многочисленную группу цитолизинов актиний, оказались чрезвычайно эффективными порообразующими токсинами по сравнению с другими представителями этого класса, выделенными из различных организмов [135, 136]. Их пороформирующая активность хорошо изучена на биологических и искусственных липидных мембранах. Предполагается, что цитолизины актиний, кроме того, что они являются эффективным оружием в процессе добывания пищи (умерщвление добычи), могут также являться репеллентами против хищников, как показано для некоторых других порообразующих токсинов [11, 37].
Несмотря на имеющиеся обширные экспериментальные данные, молекулярный механизм взаимодействия актинопоринов с клеточной мембраной все еще не ясен. Вероятно, существуют специфические рецепторы или какие-либо другие механизмы, играющие дополнительную роль в процессах связывания с липидами и порообразования. Например, эритроциты и сердечные клетки очень чувствительны к EqtII даже в пикомолярных концентрациях [43], в то время как константы связывания, рассчитанные для процесса взаимодействия актинопорина с липидами модельных мембран, очень низкие. Это подразумевает, что в биологических мембранах, процессы связывания и/или порообразования могут индуцироваться дополнительным механизмом. Интригует невыясненная до последнего времени функциональная роль RGD-мотива, имеющегося во всех известных аминокислотных последовательностях не только актинопоринов, но и других пороформирующих полипептидов.
Структурно-функциональные исследования цитолизинов являются мощной предпосылкой для создания более эффективных рекомбинантных иммуио- и митотоксинов, специфически действующих на внутриклеточные мембраны опухолевых клеток или паразитов [122,123, 124, 137, 138], Первые работы по исследованию цитолитических токсинов актиний были посвящены, в основном, выделению и определению физико-химических и/или биохимических характеристик этих соединений [12-15]. В настоящее время все большее внимание привлекают структурно-функциональные исследования цитолизинов актиний, особенно актинопоринов. Благодаря своему порообразующему действию они обладают противоопухолевой, кардиостимулирующей, дерматонекротической, антимикробной, антипаразитарной активностями и, следовательно, представляют интерес как потенциальные фармакологические средства. Изучение взаимосвязи структуры и функции актинопоринов необходимо, в первую очередь, для более глубокого понимания механизма их действия. Результаты исследований, направленных на изучение взаимодействия этих полипептидов с мембранными рецепторами, позволят объяснить проявляемые ими фармакологические эффекты. Проведенный ранее скрининг актиний Карибского моря (10 видов) и некоторых районов Индийского океана: рифов Сейшельских и Мальдивских островов, Танзании и Мадагаскара (35 образцов) выявил наиболее перспективные для исследования виды. Высокая мембранолитическая активность была обнаружена в водных экстрактах тропических актиний R. macrodactylus и 5". helianthus [139]. Поскольку цитолизины S. helianthus успешно изучаются несколькими зарубежными научными коллективами [48], в качестве источника цитолитических полипептидов был выбран вид R. macrodactylus. Ранее из этого вида было выделено и охарактеризовано три актинопорина RTX-A, RTX-S и RTX-G [30] и два низкомолекулярных цитолизина Rml и Rmll [18]. Для RTX-A была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность (28 аминокислотных остатков) и исследовано его мембранотропное действие на биологические и модельные мембраны [44, 72, 99, 100]. В настоящей работе мы продолжаем структурно-функциональные исследования актинопоринов R. macrodactylus -перспективных биологически активных соединений, которые находят широкое применение при изучении механизмов функционирования клеток как in vivo, так и in vitro.
Обычно для выделения цитолизинов из актиний используют схемы, включающие осаждение активных полипептидов ацетоном или сульфатом аммония с последующей хроматографией на биогелях и ионообменных смолах. В индивидуальном состоянии полипептиды, как правило, получают с помощью изоэлектрофокусирования и/или ионообменной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [10]. Схема выделения цитолизинов из актинии R. macrodactylus включала несколько стадий: осаждение полипептидов, обладающих гемолитической активностью, из водных экстрактов ацетоном (80%), гель-фильтрационную хроматографию на колонке с Акрилексом П-4, ионообменную хроматографию и рехроматографию на колонке с КМ-32 целлюлозой, обессоливание на колонке с Акрилексом П-4, катионообменную высокоэффективную хроматографию (ВЭЖХ) и ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой сорбента (табл. 3.1). На каждой стадии выделения цитолизинов определялась удельная гемолитическая активность. В результате ацетонового осаждения нами была получена белковая фракция, водный раствор которой был использован для дальнейшего хроматографического разделения. С помощью гель-фильтрационной хроматографии этой фракции на колонке с Акрилексом П-4 были выделены три фракции (пики I, II и III, рис. 3.1.1), проявляющие гемолитическую активность. Фракция, соответствующая пику II, обладающая наибольшей гемолитической активностью, была собрана и лиофилизирована. По данным электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-электрофорез) она содержала, главным образом, полипептиды с молекулярной массой около 20 кДа. Далее полученный препарат был растворен в рабочем буферном растворе (0,01 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0) и хроматографирован на колонке с КМ-32 целлюлозой. В результате ионообменной хроматографии были получены пять фракций, обладающих гемолитической активностью (рис. 3.1.2). Фракции, соответствующие пикам 1 и 3, обладали высокой гемолитической активностью, содержали, преимущественно, полипептиды с молекулярной массой 20 кДа и представляли интерес для дальнейшего исследования. Фракции, соответствующие пикам 2, 4 и 5, в данной работе не исследовались. После обессоливания и рехроматографии фракции, соответствующие пикам 1 и 3, лиофилизировали и хроматографировали на колонке Ultropac TSK CM-3SW. В результате ионообменной ВЭЖХ фракции, соответствующей пику 1 (рис. 3.1.3), был получен в гомогенном состоянии (по данным ДСН-электрофореза, N-концевого аминокислотного анализа и капиллярного электрофореза) цитолизин с N-концевой аминокислотой аланином и молекулярной массой 20 кДа. Аминокислотный состав полученного полипептида полностью совпадал с аминокислотным составом выделенного ранее из этой актинии актинопорнна RTX-A. Поскольку физико-химические свойства RTX-A и механизм его действия на биологические и модельные мембраны достаточно хорошо изучены, дальнейшее исследование этого полипептида в данной работе не проводилось.
Исследование конформационной стабильности и гемолитической активности актинопорина RTX-S II
Выяснение функциональных механизмов биологически активных поли пептидов невозможно без знаний о пространственной организации этих соединений. Для установления пространственной структуры полипептидов обычно используют физико-химические методы; УФ-, ИК- и КД-спектроскопию, собственную белковую флуоресценцию, а в последнее время - ЯМР и рентгеноструктурный анализ [47,48, 84]. Исследование конформационной стабильности RTX-S II в водном растворе и влияние на нее различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы) позволит сделать вывод о роли конформационных переходов в структуре актинопорина и их влиянии на его гемолитическую активность. 3.4.1. Исследование пространственной организации актинопорина RTX-S II Пространственная организация RTX-S II в водном растворе была исследована с помощью УФ- и КД-спектроскопии и собственной белковой флуоресценции. УФ-спектр RTX-S II в ближней УФ-области (230-350 нм) является типичным спектром белка с максимумом при 275 нм и впадиной около 250 нм (рис.3.4Л). Наличие отчетливо выраженного перегиба в области 290 нм указывает на высокое содержание остатков триптофана в аминокислотном составе актинопорина. 1% Значения Л]см. определенные из УФ-спектров поглощения растворов RTX-S II в 0.01 М натрий-фосфатном буфере. рН 7.2. и в 6 М гуанидингидрохлориде, рН 4,0, при длине волны 275 им с учетом вклада светорассеяния (3-5% в максимуме поглощения), равны соответственно 15.5 и 16,3. Соответствующие молярные коэффициенты поглощения равны 29890 и 31430 М"1 -см 1. Число остатков тирозина и триптофана, оцененное по 2-оП производной УФ-спектра поглощения [145]. составляет 11 и 3. соответственно. Рассчитанный по этим данным молярный коэффициент экстиикции хорошо согласуется с измеренным по УФ-спектру раствора RTX-S П. Спектр КД RTX-S II в ближней УФ-области (230-310 нм). области поглощения ароматических хромофоров и лнсульфидных связей (рис. 3.4.2,а), имеет положительные полосы при 284 и 290 нм, относящиеся к остаткам тирозина и/или триптофана. Наличие достаточно выраженной тонкой структуры спектра КД RTX-S II в ближней УФ-области свидетельствует о существенной асимметрии окружения боковых групп остатков ароматических аминокислот, то есть об их жесткой фиксации и о высокоорганизованной третичной структуре исследуемого полипептида. Спектр КД RTX-S II в далекой УФ-области (190-240 нм), области поглощения пептидных связей (рис. 3.4,2, б), характеризуется минимумом при 217 нм и максимумом при 198 нм, кривая пересекает нулевую линию дважды, при 195 и 203 нм. Расчет элементов вторичной структуры RTX-S II по программе Провенчера [146] дает следующее содержание канонических структур: 5% а-спирали, 48% антипараллельных складчатых р-слоев, 26% р-изгибов и 22% неупорядоченной структуры.
Таким образом, характерным признаком структурной организации RTX-S II является преобладание р-структуры, что было также установлено для актинопоринов из других видов актиний. Так, исследования вторичной структуры методами КД и ИК спектроскопии показали, что Stnl и Stnll (актинопорины S. helianthus) содержат 44 -50% Р-складчатых структур, 18 - 20% р-изгибов, 12 - 15% а-спирали и 19 - 22% неупорядоченной структуры [59]. Эти результаты, а также результаты, полученные нами для RTX-S II, хорошо согласуются с данными рентгеноструктурного анализа для Eqtll: 47,5% Р-складчатых структур, 9,5% а-спирали и 47,5% неупорядоченной структуры и Р-изгибов [47]. 3.4.2. Исследование конформационных изменений в структуре актинопорина при действии различных факторов (температуры, рН среды, ионной силы раствора) В работах, посвященных исследованию конформационной стабильности актинопоринов, показано, что вторичная структура актинопоринов достаточно устойчива в широком интервале температур и рН среды. Так, при рН ниже 1,1 и выше 10,0 или увеличении температуры до 70С Eqtll и Stnll находятся в устойчивом жидко-глобулярном состоянии [60, 147, 148, 149]. Согласно спектрам КД, оно характеризуется слегка большим содержанием а-спирали. Подобное конформационное состояние с практически неизменной вторичной структурой и видимыми изменениями в третичной структуре обнаружено при связывании Eqtll с липосомами, содержащими диолеилпальмитоилглицерин (ДОПГ), и нагревании липопротеинового комплекса до 60С [80]. При исследовании влияния температуры на конформационное состояние RTX-S II было показано, что при увеличении температуры от 25 до 40С эллиптичность полос в спектре КД актинопорина в области поглощения ароматических аминокислотных остатков понижается на 5-7% (рис. 3.4.2, а). Повышение температуры раствора RTX-S II до 50С приводит к резкому уменьшению эллиптичности полос в спектре КД в области 250-270 нм.
Очевидно, в области температур 40-50С происходит конформационный переход в третичной структуре актинопорина. Дальнейшее нагревание раствора (до 60С) не приводит к значительным изменениям спектра КД RTX-S II. Вероятно, молекула актинопорина находится в частично денатурированном, но стабильном состоянии. Охлаждение раствора RTX-S II, прогретого 10 минут при 60С, до 25С и выдерживание его в течение двух суток при этой температуре приводит к частичному восстановлению эллиптичности полос в спектре КД (25-30% от исходной). Наряду с «плавлением» третичной структуры актинопорина RTX-S II при повышении температуры происходит разрушение его вторичной структуры, о чем свидетельствуют спектры КД в области поглощения пептидных связей (рис. 3.4.2, б): при 50С наблюдается незначительное уменьшение эллиптичности отрицательной и положительной полос в спектре. Повышение температуры раствора всего на 5С приводит к резким изменениям в спектре КД: наблюдается 60%-ное уменьшение эллиптичности положительной и отрицательной полос, со сдвигом (по длине волны) максимума, минимума и точки пересечения нулевой линии (рис. 3.4.2, б). Нагревание раствора актинопорина до 60С приводит к еще большему уменьшению эллиптичности отрицательной полосы и исчезновению максимума в положительной области спектра. На основании зависимости эллиптичности при 222 нм, являющейся мерой упорядоченности вторичной структуры белка [150], от температуры (рис. 3.4.2, в) определена точка конформационного перехода во вторичной структуре RTX-S II. Как видно из рисунка эллиптичность актинопорина не зависит от температуры в пределах 20 - 45С, а затем в узком интервале температур резко уменьшается. Середина этого перехода находится при 53С. До этой температуры конформационные изменения, происходящие как в третичной, так и во вторичной структуре, являются полностью обратимыми. Следует отметить, что после точки конформационного перехода изменения в третичной структуре являются частично обратимыми, в то время как во вторичной структуре они полностью необратимы. Спектры КД актинопорина RTX-S II, измеренные в диапазоне температур от 25 до 60С (рис. 3.4.2, а), не имеют изоднхроичной точки (пересечение всех кривых в одной точке при определенной длине волны [151]). Это обстоятельство позволяет предположить, что денатурация актинопорина не является одностадийным процессом (присутствие только нативного и денатурированного состояний), а происходит через образование промежуточного продукта - интермедиата. Наряду с изучением конформационной термостабильности RTX-S II проведено исследование влияния рН на пространственную структуру актинопорина. Из спектров КД растворов RTX-S II (рис. 3.4.3, а) видно, что третичная структура исследуемого актинопорина чрезвычайно устойчива к действию рН как в кислой, так и в щелочной областях. При титровании раствора RTX-S II в кислую область спектр КД в ближней УФ-области сохраняет свою форму и эллиптичность полос. При рН 2,2 приблизительно на 10% уменьшается эллиптичность полос при 284 и 290 им, но при этом спектр сохраняет свою тонкую структуру. При титровании в щелочную область спектр КД актинопорина не меняется до рН 10,6, за исключением области 240-260 нм, В этом интервале длин волн появляется широкая положительная полоса, которая характерна для ионизированных остатков тирозина. При рН 12,6 образуется полоса высокой эллиптичности при 242 нм (рис. 3.4.3, а), что свидетельствует о полной ионизации остатков тирозина в молекуле RTX-S II [152].
