Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени установлено, что цепь
полиубиквитина служит сигналом для селективного обнаружения внутри клетки
аномальных, поврежденных, денатурированных и некоторых короткоживущнх
регуляторних белков, которые в результате обнаружения расщепляются в
специализированных катаболических комплексах - протеосомах. Звенья в сигнальной
цепи образованы убиквитином, небольшим (8500 Да), состоящим из 76
аминокислотных остатков, исключительно консервативным белком,
распространенным повсеместно среди эукариотов и архебзктерий. Хорошо
охарактеризована наиболее часто встречающаяся форма полиубиквитина, в которой
молекулы убиквитина связаны изопептидными связями между е-аминогруппой лизина
{Lys 48) каждого из предшествующих мономеров с С - концевым карбоксилом глицина
(Gly 76) следующего мономера (Gregori et al.. (1990), J. Biol. Chem. 265,8354-8357:
Hershko, A. and Ciechanover, A. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61,761-807). Относительная
доступность С - концевого глицина (Gly76) во многом определяет химические
свойства убиквитина при формировании и разрыве пептидных связен. Так, концевая
карбоксигруппа глицина {Gly 76) убиквитина, в результате сложной
последовательности реакции, может образовывать ковалентную связь с боковой г-амнногруппой лизина на поверхности белка, являющегося "мишенью" протеалитической системы, затем к первой молекуле убиквитина присоединяется другой мономер, и, таким образом, происходит образование соединенных изопептидной связью олигомерных сигнальных цепей полиубиквитина.
В последние годы были проведены интенсивные исследования процессов образования полиубиквитина, выявлена его роль в селективном клеточном протеолнзе, необходимом для поддержания строго определенных внутриклеточных концентраций большого числа регуляторних белков (Ciechanover, A. and Schwartz, A. L. (1994) FASEB. J. 8,182-191). Также было показано, что помимо того, что убиквитин входит в состав сигнальных цепей, он может находиться в клетке в виде предшественников, различных полимерных форм первичных продуктов экспрессии генов убиквитина (Jonnalagadda et al., (1987), J. Biol. Chem., 262. 17750-17756: Ozkaynak el al, (1987) EMBO J. 6,1429-1439), а также в свободном состоянии в форме мономера.
Однако, дальнейшая судьба самой сигнальной метки, после осуществления ею своей функции, оставалась во многом неясна. Современная модель предполагает
расщепление полиубиквитина до мономеров в результате следующих событий: меченые полиубиквитином белки доставляются к местам клеточного протеолиза, расщепляются протеосомой, и соединенные изопептидной связью цепи полиубиквитина освобождаются от небольшого остаточного пептида. Предполагается, что данный процесс катализируется высокоспецифической изопептидазой, ассоциированной с протеосомой. Модель также предполагает диссоциацию свободной цепи полиубиквитина и субъединицы 5S, входящей в состав протеосомы 26S. Однако известно, что полиубиквитин, накапливаясь в сравнительно высоких концентрациях, вследствии сродства к протеосоме может существенно замедлять или подавлять процесс диссоциации и .следовательно, протеолиз (Deveraux et at.. (1994) J. Biol. Chem. 269,7059-7061). Таким образом, в нормально функционирующей клетке в свободном состоянии может находится одновременно лишь ограниченное число свободных цепей полиубиквитина. Возникает необходимость в существовании специального способа выведения из системы избытка свободного полиубиквитина. Решать эту задачу посредством полного расщепления цепей полиубиквитина до аминокислот, в общем случае для клетки, по-видимому, нецелесообразно, так как эти цепи являются резервом весьма ценного убиквитина, зрелая мономерная форма которого при определенных внутриклеточных концентрациях стимулирует протеолиз или необходима клетке для осуществления иных регуляторних функций. Данный путь трудно осуществим и вследствие особенной устойчивости к денатурации и протеолизу самого убиквитина.
Эта проблема легко решается, если допустить существование в клетке
высокоспецифической изопептидазы, получившей название изопептидазы Т. И
действительно, в белковых фракциях , частично очищенных из эритроцитов человека с
использованием метода избирательного связывания некоторых белков с
иммобилизованным лигандом - убиквитином, была обнаружена подобная
ферментативная активность, гидролизирующая изопептидные связи в
полиубиквитине (Chen and Pickan, (1990). J. Biol. Chem. 265,21835-21842; Hadari et at., (1992), J. Biol. Chem. 267, 719-727). Систематическое исследование подобной ферментативной активности и было основной целью данной работы.
В настоящей работе охарактеризованы структура, специфичность, и механизм действия фермента, который осуществляет избирательное расщепление до мономеров сигнальной молекулы полиубиквитина и, таким образом, результаты данного исследования в значительной степени заполняют пробел в понимании способа выведения из клетки избытка свободных цепей полиубиквитина.
Цель работы. В настоящей работе ставились следующие задачи: 1) выделение белка, ассоциируемого с активностью изопептидазы Т, 2) определение первичной структуры изопептидазы Т, 3) проведение сравнительного анализа аминокислотных последовательностей изопептидазы Т и других известных специфических протеаз убиквитина, 4) получение активной рекомбинантнон изопептидазы Т в клетках Е. coii., в количествах достаточных для дальнейшей характеризации фермента, 5) детальное изучение субстратной специфичности и механизма действия изопептидазы Т.
Няучняя новизна и практическая ценность работы. В работах ряда исследовательских групп даны описания выделения из эритроцитов или ретикулоцитов частично очищенных (методом аффинного связывания с иммобилизованном убиквитином) фракций белка, способного расщеплять изопептидные связи полиубиквитина (Chen and Pickart. (1990), J. Biol. Chem. 265,21835-21842; Hadari el al, (1992), J. Biol. Chem. 267, 719-727)). Однако, первичная структура белка, ассоциируемого с подобной гидролитической активностью не была определена. Также не были раскрыты многие детали субстратной специфичности и механизма действия подобной изопептидазы полиубиквитина. В настоящей работе впервые определена аминокислотная последовательность белка, соответствующего специфической активности изопептидазы полиубиквитина; проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей изопептидазы Т и других специфических протеаз убиквитина, приведший к идентификации большого числа несомненно структурно родственных изопептидазе Т кодирующих последовательностей, многие из которых отнесены к классу специфических протеаз убиквитина впервые и представляют несомненный самостоятельный интерес; впервые получен каталитически активный рекомбинантный фермент изопептидазы Т человека при ее экспрессии в клетках Б. coii.; проведено детальное изучение субстратной специфичности и механизма действия изопептидазы Т.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции Федерации американских обществ экспериментальной биологии, в Вашингтоне ОК, США, в июне 1996 г., и на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ им. MB. Ломоносова 14 ноября І996 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /_tL3. страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы (91 ссылка). Диссертация иллюстрирована 22 рисунками.
