Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирионная и реплицирующаяся РНК пикорнавирусов ковалентно связана с небольшим вирусным белком ВПг (вирусный «протеин», связанный с геномом). Однако, пикорнавирусная РНК, выделенная из полисом, свободна от белка ВПг. Фермент, гидролизующий связь между белком ВПг и пикорнавирусной РНК , был обнаружен в клетках HeLa, а затем и в других эукариотических клетках. При этом активность фермента, названного 'расщепляющим', была обнаружена как в инфицированных, так и неинфицированных клетках.
Фермент катализирует гидролиз фосфодиэфирной межполимерной связи, образованной остатком тирозина белка ВПг и остатком 5'-концевой уридиловой кислоты вирусной РНК. Считается, что фермент проявляет уникальную специфичность именно к межполимерной фосфодиэфирной связи.
Было установлено, что целостность ВПг в комплексе ВПг-РНК не является существенной для катализа, в то время как протяженная олиго- или полирибонуклеотидная часть является необходимой.
Клеточные мишени этой необычной фосфодиэстеразы неизвестны. Так же неизвестна роль фермента в клетке и в пикорнавирусной инфекции. Вместе с тем, логично предположить, что эндогенные субстраты фермента должны быть структурно подобны ковалентным комплексам вирусного происхождения. Таким образом, исследование субстратной специфичности фермента - задача, решение которой необходимо для поиска клеточных субстратов и понимания его роли в пикорнавирусной инфекции.
Цель работы. Целью данной работы были - получение и характеристика высокоэффективного субстрата и высокоочищенного препарата 'расщепляющего' фермента из клеток асцитной карциномы мьгшей Кребс II, изучение субстратных свойств комплексов, производных соединения ВПг-РНК вируса энцефаломиокардита (ВЭМК), а именно, определение минимального размера нуклеиновой части субстрата.
Научная новизна и практическая значимость, В результате исследования установлена способность 'расщепляющего' фермента из клеток асцитной карциномы Кребс II катализировать гидролиз ковалентной связи между пептидами, производными
белка ВПг вируса энцефаломиокардита, и короткими олигонуклеотидами, производными вирусной РНК.
Минимальным фрагментом нуклеиновой части комплексов, сохраняющим их субстратные свойства, является 5',3'-уридиндифосфат. Увеличение нуклеиновой части комплекса до размера олигонуклеотида ведет к резкому росту эффективности ферментативной реакции. Комплексы пептидов и 5'-концевого тринуклеотида вирусной РНК расщепляются ферментом с той же эффективностью, что и комплексы, содержащие полноразмерную РНК. В то же время комплекс тринуклеотида и белка ВПг ферментом не расщепляется. На основании этого сделан вывод, что ВПг блокирует нуклеиновую часть комплекса, препятствуя связыванию фермента с субстратом.
Показано, что фермент специфически гидролизует исключительно «узловую» фосфодиэфирную связь в комплексах пептидов и тринуклеотида, образованную остатком тирозина и 5'-концевой уридиловой кислотой.
Выполненное исследование дает основание предположить, что хорошим синтетическим субстратом, способным заменить сложный природный субстрат, будет фосфодиэфир тирозина и pUpUpG. Оценивая полученные результаты, можно, во-первых, сделать предположение о новых клеточных мишенях "расщепляющего" фермента. Возможно, это необычные клеточные соединения пептидов и нуклеотидов или же пептидов и олиго(поли)нуклеотидов.
Во-вторых, можно предположить, что 'расщепляющий' фермент принимает участие в инициации деградации пикорнавирусной РНК.
Публикации и апробация работы. Материалы работы были представлены на II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), 10 международном форуме "Xth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, EUROPIC98" (Йена, Германия, 1998), Школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Москва, 2000).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на Дб страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, вьшоды и список цитированной литературы. Материал иллюстрирован _Z_f рисунками и "3_ таблицами. Библиографический указатель включает \ Чоцитированных работ.
