Содержание к диссертации
Введение
1. Список условных обозначений 4
2. Введение 6
3. Обзор литературы 8
3.1. Структура рибосомного белка S4 9
3.2.1. Взаимодействие рибосомного белка S4 с 16S рРНК 15
3.2.2. Термодинамика связывания рибосомного белка S4 с 16S рРНК 18
3.2.3. Термодинамика бинарных комплексов BstS4-Bst16S рРНК 21
3.2.4. Изучение участка взаимодействия белка EcoS4 с Eco16S рРНК с помощью селекции 28
3.3.1. Регуляция трансляции оперонов рибосомных белков 35
3.3.2. Регуляция трансляции сс-оперона белком S4 36
4. Результаты и обсуждение 42
4.1.1. Клонирование и выделение рибосомного белка EcoS7 из Е. coli. 42
4.2.1. Определение активности белка EcoS7 при взаимодействии с фрагментом Eco16SpPHK 43
4.2.2. Оценка термодинамических параметров комплексообразования EcoS7 с Eco16SpPHK 49
4.2.3. Изучение взаимодействия белка TthS7 с фрагментом Eco16S рРНК 52
4.3.1. Делеционный анализ межцистронного фрагмента S12-S7 sfrмРНК Е. coli..55
4.3.2. Изучение взаимодействия белка TthS7 с делеционными фрагментами EcoStr мРНК 59
4.3.3. Сравнение свойств комплексов EcoS7 с Eco16S рРНК и с EcoStr мРНК 60
Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий
4АЛ. Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку EcoS7. 62
4.4.2. Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку TthS7. 63
4.5. Изучение структуры и температурных конформационных превращений белков EcoS7 и TthS7 методами дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и компьютерной молекулярной динамики (МД) 69
5. Экспериментальная часть 83
5.1. Использованные штаммы микроорганизмов и реактивы 83
5.2. Использованные методы 84
6. Выводы 97
7. Список литературы
- Термодинамика связывания рибосомного белка S4 с 16S рРНК
- Изучение участка взаимодействия белка EcoS4 с Eco16S рРНК с помощью селекции
- Оценка термодинамических параметров комплексообразования EcoS7 с Eco16SpPHK
- Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку TthS7.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Достигнутые в последнее время успехи в расшифровке структуры бактериальных рибосом, их субчастиц и функциональных комплексов с мРНК и тРНК методом рентгеноструктурного анализа (РСА) позволили перейти к детальному изучению механизмов функционирования этого сложнейшего РНП-комплекса, как на стадии сборки рибосом, так и в процессе трансляции. Обладая знаниями о тонкой структуре сложного супрамолекулярного комплекса и его компонентов, можно на новом уровне изучать его сборку, а также регуляцию этого процесса.
Сборка рибосомы - очень затратный для клетки процесс, как с точки зрения энергии, так и материалов". Биогенез бактериальных рибосом связан с синтезом и поэтапным взаимодействием рибосомных белков (р-белков) с рРНК. Его регуляция происходит на уровне координации синтеза р-белков и рРНК с помощью альтернативных высоко специфичных взаимодействий р-белков либо с рРНК, либо с собственной мРНК. Детальное изучение термодинамических факторов, направляющих этот процесс, в настоящий момент явно недооценивается, однако является существенным для понимания этого важного для клетки механизма. Феномен регуляции основан на способности р-белков, выполняющих регуляторную функцию, узнавать как рРНК, так и мРНК.
Настоящая работа посвящена изучению термодинамического аспекта РНК-белковых взаимодействий для одного из таких белков - р-белка S7 прокариот, связывающегося с 16S рРНК и инициирующего сборку основного З'-концевого домена и, следовательно, всей малой субчастицы бактериальной рибосомы.
Ген белка S7 входит в состав стрептомицинового (sti) оперона. sfr оперон Е. coli состоит из 4 генов: rpsL (р-белок S12), rpsG (р-белок S7, EcoS7), fus (фактор элонгации трансляции EF-G) и tufA (фактор элонгации трансляции EF-Tu). Контроль уровня экспрессии этих генов осуществляется на уровне трансляции. Выполняя регуляторную функцию, белок EcoS7 связывается с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует трансляцию str мРНК. Как по первичной, так и по предполагаемой вторичной структуре участки 16S рРНК и str мРНК, связывающиеся с EcoS7, отличаются. Именно способность белка EcoS7 образовывать высоко аффинные и специфичные комплексы с различными по структуре РНК делает возможным регуляцию биосинтеза белков str оперона. Решение этой задачи необходимо искать в-изучвмии-нв-только структурных,
РОС. НАЦИОНАЛЬНА* ,
но и термодинамических характеристик комплексов белка^цдиоТЕКА і
СП 09
Кроме того, установлена связь между функцией генов str оперона и возникновением у бактерий устойчивости к антибиотикам: мутации в гене rpsL вызывают устойчивость к стрептомицину, в гене tufA - к антибиотику кирромицину, а сам белок S7 принимает участие в связывании тетрациклина с бактериальной рибосомой. Так как стрептомицин и тетрациклин широко используются в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности, то исследование механизмов регуляции экспрессии этих генов является очень важной задачей и в прикладном аспекте. Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению структурно-термодинамического аспекта РНК-белковых взаимодействий р-белка S7 эубактерий. В ходе выполнения данной работы были поставлены и выполнены следующие задачи:
-
Клонирование и получение супер-продуцента Б. coli для белка EcoS7. Разработка метода выделения белка с высокой РНК-связывающей активностью.
-
Исследование термодинамических характеристик гомологичных бинарных комплексов EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК, а также их гетерологичных аналогов для белка S7 из Т. thermophilus (TthS7).
-
Делеционный анализ межцистронного фрагмента EcoStr мРНК - поиск минимального фрагмента РНК, необходимого для связывания с EcoS7. Сравнение полученных комплексов для EcoS7 и TthS7.
-
Исследование структурных аспектов узнавания белками EcoS7 и TthS7 межцистронного фрагмента EcoStr мРНК методами комбинаторной химии РНК (SELEX).
-
Изучение структуры и температурных конформационных превращений белка S7 in vitro и in silico.
Научная новизна и практическая значимость. Разработана эффективная
методика выделения белка из суперпродуцента Б. coli обладающего высокой РНК- \
связывающей активностью EcoS7. Определены термодинамические параметры взаимодействия белков EcoS7 и TthS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК. Делеционным анализом определен минимальный фрагмент EcoStr мРНК, способный взаимодействовать с белком EcoS7. Проведена корреляция с гетероличной системой для белка TthS7. Структура предполагаемого участка узнавания EcoStr мРНК исследована с помощью метода комбинаторной химии РНК (SELEX). На основе фрагмента EcoStr мРНК впервые получены аптамеры к белку TthS7, обладающие высокой аффинностью и специфичностью. Методами дифференциальной
сканирующей калориметрии и компьютерной молекулярной динамики исследованы белки EcoS7 и TthS7. Определены термодинамические характеристики обоих белков. Получены данные, подтверждающие предложенную ранее модель пространственной структуры белка EcoS7. Полученные данные позволяют сформулировать гипотезу о возможном механизме регуляции экспрессии s/лоперона других бактерий, в том числе важных с медицинской точки зрения.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях: «Динамика рибосомной структуры и функции», Квинстаун, Новая Зеландия (2002); XVI Международный симпозиум по биоэлектрохимии и биоэнергетике, Братислава, Словакия (2001); Международная конференция в честь А. Спирина «Биосинтез белка», Пущино, Россия (2001); «Современные направления в химии нуклеиновых кислот», Москва, Россия (2000); 5 Международная конференция "Биогенез рибосом и функция ядрышка", Гранлибакен, США (2000); а также на отечественных конференциях: III съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия (2002), Первая российская электронная конференция по биоинформатике «RECOB-2000», Москва, Россия (2000). Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа
изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы:
введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы
и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован рисунками и
таблицами. Библиографический указатель включает в себя цитированных работ.
Термодинамика связывания рибосомного белка S4 с 16S рРНК
В 2000 году методом РСА была определена кристаллическая структура 30S субчастицы рибосомы Т. thermophilus [18,42] (Рис. 4). Это позволило рассмотреть структуру участка связывания белка S4 более подробно. N-, и С-концы белка Чі} проникают вглубь структуры 16S рРНК, образуя важные контакты сразу с несколькими элементами структуры РНК. Основные аминокислоты концов белка взаимодействуют с сахарофосфатным скелетом рРНК [18].
Как было предположено по результатам «фут-принт» экспериментов, район связывания белка S4 с 16S рРНК оказался действительно ограничен соединением пяти спиральных участков - НЗ, Н4, Н16, Н17, Н18. В основном, белок контактирует с сахарофосфатным скелетом 16S рРНК, и только семь гетероциклических оснований связаны с белком водородными связями. Наиболее консервативными являются контакты белка S4 с двумя комплементарными парами оснований из разных спиралей: C436-G406 (Н17-Н16) с His123 и U437-А496 (Н17-Н18) с Gln119. Пять спиральных участков расположены довольно близко друг к другу, хотя и образуют очень мало контактов, которые могли бы поддерживать правильную пространственную структуру района в отсутствии белка S4. Скорее всего, в свободной 16S рРНК узел пяти спиралей практически не структурирован, а связывание с белком S4 приводит к структурной перестройке и 16S рРНК принимает конформацию, которую можно наблюдать в структуре 30S субчастицы рибосомы.
Для понимания, как связывание белка S4 влияет на сборку 5 -концевого v домена 16S рРНК и дальнейшую сборку малой субчастицы рибосомы, исключительно важно знать не только структурные, но и термодинамические характеристики бинарного взаимодействия S4-16S рРНК.
Изучение термодинамики комплекса белка S4 с 16S рРНК началось с попытки выделить минимальный структурный элемент 16S рРНК, необходимый для связывания. В 1989 Вартикар и Драпер [43] провели делеционный анализ 16S рРНК. Взаимодействие 16S рРНК с белком S4 оценивали двумя методами: седиментацией в градиенте концентрации растворов сахарозы и сорбцией на нитроцеллюлозных фильтрах. Делеционные фрагменты 16S рРНК и относительные константы связывания комплексов представлены в Таблице 1.
Кажущиеся константы ассоциации (кКд) определяли титрованием [ Р]-меченой 16S рРНК избытком белка EcoS4 в экспериментах на нитроцеллюлозных фильтрах или седиментацией [3Н]-меченого белка EcoS4c избытком 16S рРНК в градиенте концентраций раствора сахарозы. Полученные кКд делили на кКА для фрагмента 16S рРНК 1-559, 14,4 мкМ 1, (кажущаяся константа диссоциации кКд
Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий 69,4 нМ), которую определяли на нитроцеллюлозных фильтрах, или для фрагмента 1-1509, 71 мкМ"1, определенную методом седиментации. При расчете принималось, что взаимодействие РНК-белок стехиометрично.
Подготовка компонентов к комплексообразованию проводили следующим образом. РНК ренатурировали в буфере ТМК (ЗО мМ Трис-НСІ (рН = 7,6), 20 мМ MgS04, 350 мМ KCI, 10 мМ р-меркаптоэтанол) при 40С в течение 20 минут. Белок S4, выделенный из рибосом Е. coli, разбавляли в 20 раз буфером ТК (то же, что и ТМК, кроме 20 мМ МдСЬ) и инкубировали 30 минут при 37С. Связывание проводили во льду (0С).
Следует отметить, что комплексы с протяженными молекулами РНК (порядка 900-1500 нуклеотидов) плохо сорбируются на нитроцеллюлозе, что сказывается на определяемых значениях аффинности и констант, как видно из Таблицы 1 (связывание с фрагментами 16S рРНК 1-1509, 1-927).
Таким образом, было показано, что фрагмент 16S рРНК, необходимый для узнавания белка S4, ограничен нуклеотидами 39 и 500. Фрагменты, меньше этого района, имели сродство к белку на порядок ниже.
Таким образом, для взаимодействия с белком S4 требуется необычно большой район 16S рРНК, содержащий узел из пяти спиралей. Хотя удаление некоторых шпилечных структур внутри этого домена не сказывается на связывании, некоторые точечные делеции и замены нуклеотидов существенно ухудшали связывание с белком [44].
Интересной особенностью комплексов белка S4 является независимость кКд ОТ концентрации KCI вплоть до 600 мМ, но кКд резко снижается при повышении концентрации K2SO4 [43]. Такая же зависимость наблюдается и для комплекса с фрагментом а-мРНК [45]. Физического объяснения участию хлорид-аниона в образовании комплекса S4-16S рРНК не найдено.
Изучение участка взаимодействия белка EcoS4 с Eco16S рРНК с помощью селекции
Использование сайт-направленного мутагенеза для изучения минимального фрагмента 16S рРНК, необходимого для узнавания белком S4, хотя и возможно, но является крайне кропотливым подходом. Принципиально иной путь для поиска участков узнавания на РНК представляет так называемый комбинаторный подход - «эволюция in vitro». Если рандомизировать последовательность нуклеотидов в РНК и провести селекцию на связывание с белком, то, сравнение с исходной, природной структурой РНК позволит понять, какие элементы структуры РНК являются важными для взаимодействия с белком.
В качестве исходной РНК используется комбинаторная библиотека молекул, которая копируется с матрицы ДНК. Библиотека ДНК создается рандомизацией определенного района: либо непосредственно в процессе химического синтеза с использованием на каждом шаге всех четырех синтонов, вместо одного, либо с введением случайных мутаций при ошибках полимеразного копирования.
Библиотеку мутантов 5 -концевого фрагмента 16S рРНК (нуклеотиды 26-556, см. Рис. 3) получали методом ПЦР по методике Леунга и кол. [58] с помощью Taq ДНК-полимеразы и в присутствии ионов Мп2+. Праимеры содержали промотор РНК-полимеразы фага Т7 и участки узнавания эндонуклеаз рестрикции. Степень рандомизации в первой библиотеке составила 0,58%, а после второго мутагенеза
Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 э/бактерий с помощью ПЦР - 1,37%, причем мутации были равномерно распределены по всей последовательности нуклеотидов 16S рРНК. Среднее количество мутаций в библиотеке РНК было около 7 на 531 нуклеотид. Однако, этого оказалось достаточно, чтобы связывание упало на порядок. То есть структура не менее 90% молекул РНК изменилась, и они стали взаимодействовать с белком намного слабее. Интересно, что очень низкий уровень мутаций существенно сказался на связывании белка S4, что говорит о необходимости для узнавания всего 5 -концевого домена. Большинство рибосомных белков узнает, в общем, не более 30 нуклеотидов [34,35].
С библиотекой 16S рРНК было проведено 5 циклов селекции. Затем фракцию РНК после 5 цикла снова рандомизировали с помощью ПЦР и провели еще 14 циклов селекции. Соотношение РНК : белок составляло 10-15 : 1. Исходная константа ассоциации библиотеки была порядка 3 мкМ 1, а к 14-ому циклу она выросла до 5 мкМ 1 (Рис. 9).
Увеличение константы ассоциации оказалось достаточно скромным, но тот факт, что мутации в отобранных последовательностях носили упорядоченный характер, свидетельствует в пользу сильного селективного давления со стороны белка S4. Количество мутаций оказалось существенно выше, чем ожидалось. По всей видимости, благодаря многократному повторению ПЦР произошло накопление мутаций, наиболее выгодных для связывания с белком.
Отобранные молекулы РНК можно подразделить на три категории по содержанию мутаций: 0-10%, 11-14%, 29-34% мутаций на молекулу. В сильно измененных фрагментах (29-34%) мутации были сосредоточены в районах нуклеотидов 70-98, 121-288 и 407-499, а в слабо мутированных фрагментах 16S рРНК - четко выраженных мутированных районов практически не было: изменения равномерно распределялись по всей молекуле РНК. На Рисунке 10 ИсслеАОвание термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий приведена гистограмма распределения мутаций для 53 отобранных последовательностей.
Анализ первичных структур отобранных последовательностей выявил интересные особенности. Район 52-58/354-359 практически не содержал мутаций (Рис. 10). Важность этого района для узнавания белком S4 также подтверждается высокой филогенетической консервативностью. Большинство известных рРНК содержат идентичные шпильки 52-58/354-359 и выпетливающийся нуклеотид А55 (Рис. 3, 5) [59]. Кроме того, «фут-принт» эксперименты показали повышенную реакционную способность нуклеотидов G362, А363 и А364 в присутствии белка S4 [1]. Это означает, что данный район изменяет свою конформацию при связывании с белком. Возможно, что конформационная перестройка этого района определяет сборку 5 -концевого домена 16S рРНК.
Наибольшее количество интересных мутаций было обнаружено в сильно измененных вариантах РНК. В шпильке НЮ выпетливание GA и примыкающие к нему пары G-C заменились на четыре пары G-U (Рис. 11 А). Шпилька увеличилась на одну пару, а вершина шпильки полностью изменилась - с GGAA на UUCG. Обе шпильки обладают стабильной структурой, которая поддерживается неканоническими водородными связями [60]. В этом положении UUCG присутствует у 40% бактерий, a GCAA-y 11% бактерий [61]. Также появились две вставки. Первая - появление дополнительного пуринового нуклеотида в позиции 129/130 (Рис. 3): А- в 25 из 30 вариантов, G - в 3 из 30.
Оценка термодинамических параметров комплексообразования EcoS7 с Eco16SpPHK
При конструировании супер-продуцентов белка S7 требуется учитывать трудности клонирования и экспрессии регуляторных белков, которые могут быть очень токсичными для клетки.
Сравнение первичных структур белков S7 из различных клеток выявило гетерогенность N-концевых аминокислотных последовательностей, поэтому для экспрессии была выбрана конструкция с шестью остатками His на N-конце белка. Супер-продуцент Е. coli для EcoS7 получали на основе системы вектор-хозяин Штудира. Различные природные штаммы Е. coli содержат два варианта EcoS7 -короткий и длинный, которые отличаются дополнительной последовательностью из 24 аминокислот на С-конце. Длинный вариант гена белка, содержащего оба природных терминирующих триплета, был клонирован в вектор рЕТ28Ь+, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка с 6His на N-конце, которые отделены от аутентичной последовательности EcoS7 субстратным участком для тромбина.
Лизис клеток проводили в растворе 8 М гидрохлорида гуанидина, что обеспечивало полное растворение телец включения. Для аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе белок сорбировали на колонке, затем промывали раствором 20 мМ имидазола. После элюции градиентом концентрации имидазола (50-500 мМ) белок переводили диализом в раствор 6 М мочевины в буфере Rec-4 (20 мМ Трис-НСІ (рН=7,6), 4 мМ MgCfe, 400 мМ NH4CI, 0,5 мМ 0-меркаптоэтанол). Ренатурацию белка проводили по методике Ниерхауса [30] с Исслелование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий помощью 3-5 диализов по 1 часу против буфера Rec-4. Выход белка составлял порядка 30-40 мг на 1 литр культуры.
Связывание с участком основного З -концевого домена 16S рРНК происходит на начальном этапе сборки малой субчастицы рибосомы. Таким образом, наиболее корректно охарактеризовать функциональную активность EcoS7 можно по взаимодействию с этим фрагментом (фрагмент Eco16S рРНК: нуклеотиды 926-986/1219-1393 16S рРНК [49,50,83]).
Для этого была разработана методика комплексообразования для белка EcoS7. Подобраны концентрации ионов магния и одновалентных катионов, которые обеспечивали высокую степень комплексообразования. На Рисунке 17 приведена зависимость степени связывания от концентрации ионов Мд2+. Постоянное количество РНК титровали возрастающим количеством белка. Степень комплексообразования определяли по количеству радиоактивного комплекса, сорбированного на нитроцеллюлозных мембранах. По результатам строили изотерму связывания (Рис. 18). Кажущиеся константы диссоциации (кКд) комплекса рассчитывали в координатах Скэтчарда.
Как белок EcoS7, так и фрагмент Eco16S рРНК, представляют собой конформационно лабильные макромолекулы. Это выражается в том, что не все молекулы белка могут образовывать комплекс с РНК, и наоборот. Во втором случае это видно из того, что максимальное количество комплекса на плато изотермы связывания никогда не достигает 100%: его реальное значение и есть является наиболее удобной количественной характеристикой РНК белкового комплекса и позволяет сравнивать стабильность данного комплекса с другими. Для полученных нами различных препаратов белка EcoS7 значения кКд находились в диапазоне от 10,4 до 25,7 нМ.
В литературе для белка EcoS7 описаны комплексы с Eco16S рРНК, имеющие кКд порядка 150 нМ [82]. Этот факт позволяет утверджать, что разработанная методика выделения обеспечивает самую высокую на сегодняшний день активность белка EcoS7. Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий
При обратном титровании постоянного количества белка возрастающим количеством РНК максимальное количество комплекса отражает долю активных молекул EcoS7, которая составила порядка 60 % (Рис. 19А). Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий
Другим методом определения кКд, а также доли активных молекул РНК и белка, является конкурентное связывание (Рис. 19Б). Суть метода заключается в титровании постоянного количества белка и [32Р]-меченой РНК возрастающим количеством «холодной», немеченой, РНК. Преобразование Скэтчарда позволяет определить долю активного белка.
Для описания бинарного взаимодействия белка и РНК используют математическую модель, разработанную для лиганд-рецепторных комплексов [84]. В общем виде константа диссоциации бинарного комплекса определяется следующей зависимостью; где [Р] - равновесная концентрация белка, [R] - равновесная концентрация РНК, [PR] - равновесная концентрация комплекса, [Р]о и [R]o - исходные концентрации белка и РНК, соответственно. Раскрывая скобки, получаем квадратное уравнение относительно [PR], только одно решение которого удовлетворяет уравнению реакции. Таким образом получаем следующую зависимость концентрации комплекса от концентрации белка:
Поскольку значения кКд выражаются через концентрацию белка, а доля активного белка в различных препаратах отличается (Рис. 18), то более корректно было бы использовать приведенные значения кКд. Это существенно облегчило бы Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий сопоставление результатов, полученных различными авторами для разных препаратов белка.
Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку TthS7.
Механизм регуляции биосинтеза белка предполагает взаимодействие рибосомного белка с двумя различными РНК - рибосомной и матричной. Существуют несколько механизмов дискриминации РНК. Первый путь -аффинность белка к рРНК выше, чем к мРНК, и, т.о., только при недостатке рРНК белок связывается с мРНК, блокируя собственный синтез. Второй способ основан на том, что при наличии обеих РНК белок связывается преимущественно с рРНК за счет высокой кооперативности сборки целой субчастицы. В данном случае не требуется существенных различий в кКд комплексов с различными РНК. Полученные нами результаты говорят в пользу второго механизма. кКд комплексов белка EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК имеют достаточно близкие значения: 14 ± 3 и 50 ± 7 нМ, соответственно. Схожие данные были получены в работе Робера и др. [82]: кКд комплексов EcoS7 с Eco16S рРНК,
и EcoStr мРНК составили 150 нМ. Однако сделанное в этой работе предположение о том, что белок узнает в обеих РНК фрагменты с идентичной первичной структурой (Рис. 26), представляется спорным. Не смотря на сохранение данных фрагментов во всех делеционных фрагментах, включая МРНК74 и мРНКбЗ, их наличие не обеспечивало связывания с белком. Как белок EcoS7, так и его «природный мутант» TthS7 требуют для узнавания протяженную структуру мРНК длиной 85 нуклеотидов.
Для более детального изучения структуры участка узнавания белка S7 можно использовать несколько подходов. Направленный мутагенез участка связывания - пример рационального подхода к решению проблемы. Принципиально иные возможности открывает метод так называемого иррационального дизайна, основанный на методологии комбинаторной химии РНК. Он позволяет ответить на вопрос - возможно ли на базе элементов природной структуры создание какого-либо варианта минимальной структуры РНК, узнаваемой белком S7.
Для поиска подобных структур был использован метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) [88]. Суть метода - отбор из комбинаторной библиотеки только тех молекул РНК, которые специфически и с высокой аффинностью связываются с белком (см. Обзор литературы). Такие РНК называют аптамерами. Метод уже успешно применялся для изучения районов связывания рибосомных белков на 16S рРНК [11,65,89].
Во фрагментах РНК «шпилька AG» и «шпилька AU» были рандомизированы 5 нуклеотидов двутяжевого участка II: -53 по -49 (Рис. 5Б), которые по некоторым данным непосредственно не участвуют во взаимодействии с белком. Рандомизация означает, что в указанных позициях участка РНК может находиться любой из четырех возможных нуклеотидов. Таким образом, исходная библиотека содержала 45= 1024 варианта молекул РНК.
Эксперимент по селекции аптамерных РНК к белку EcoS7 был проведен в условиях, подобранных ранее для комплексообразования (20 мМ Трис-НСІ (рН=7,6), 7 мМ МдСІг, 350 мМ NH4CI, 4 мМ р-меркаптоэтанол). Уровень связывания белка с исходной библиотекой РНК не превышал 5-10%, что соответствует уровню неспецифического связывания. Было проведено 10 циклов селекции с постепенным повышением так называемой строгости отбора: от цикла к циклу увеличивалось соотношение белок:РНК от 1:2 на первом цикле до 1:100 на десятом. После десятого цикла оценивали уровень связывания с белком, однако увеличения аффинности обогащенной фракции РНК не произошло. Известно, что при высоких соотношениях белокРНК возможны потери целевых вариантов молекул РНК в силу их низкой представленности в библиотеке.
Повторно эксперимент по селекции был проведен при других соотношениях белок : РНК. В третьем эксперименте был изменен состав буферного раствора (7 мМ MgCI2, 350 мМ NH4CI). Во всех трех случаях отобрать молекулы РНК, связывающиеся с белком EcoS7, не удалось.
Отрицательные результаты селекции можно объяснить высокой специфичностью взаимодействия белка EcoS7 со своим участком связывания на мРНК. Способной к связыванию является лишь исходная, природная структура EcoStr мРНК, а удаление нижней части межцистронной шпильки и стабилизация структуры верхней части шпильки делает невозможным «восстановление» способности взаимодействовать с белком ни при каких изменениях структуры, возможных для использованной библиотеки РНК.
