Введение к работе
Актуальность проблемы.
Современная модель механизма инициации трансляции
эукариотических мРНК предполагает, что 40S рибосомная
субчастица, образовав предварительно комплекс с рядом факторов
инициации и инициаторной тРНК, связывается исключительно на
5'-конце мРНК вблизи кэпа (кэп-структура - это 7-метилгуанозин,
соединенный с З'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной
связью). При этом считают, что вторичная структура 5'-
нетранслируемой области РНК расплетается эукариотическими
иницнаторными факторами еГР4А, еГР4В и eIF4F. Последний
состоит из трех субъединиц - eIF4G, eIF4A, eIF4E и ассоциирован с
40S рибосомной субчастицей через фактор инициации eIF3.
Первичное узнавание мРНК происходит за счет взаимодействия
eIF4E (кэп-связывающей субъединицы фактора eIF4F) с кэп-
структурой мРНК. Считается, что далее мРНК "сканируется"
40S рибосомной субчастицей до первого, находящегося в
подходящем нуклеотидном контексте, AUG кодона. После этого к ней присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S комплекс начинает синтез белка.
Эта "сканирующая" модель предъявляет определенные требования к структуре мРНК. Так, подавляющее число эукариотических мРНК моноцистронны, содержат относительно короткие (50-150 нуклеотидов) 5'-нетранслируемые области (НТО) и - единственная объединяющая особенность их 5'-НТО -кэпнрованы. Инициация трансляции происходит обычно на первом (то есть ближайшем к 5'-концу мРНК) AUG инициаторном кодоне. Такой механизм инициации трансляции называется кэп-зависимым.
Для ряда мРНК, наиболее характерными представителями которых являются две группы вирусных мРНК (пикорнавирусные и пестивирусные), предложен другой - внутренний (кэп-независнмый) способ инициации трансляции. 5'-нетранслируемые области мРНК пикорнавирусов не кэпированы, имеют длину от 600 до 1200 нуклеотидов и содержат до 11 AUG триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG кодону. Инициация трансляции таких мРНК происходит в результате кэп-независимого связывания 40S рибосомной субчастицы с IRES (internal ribosome entry зке)-элементом - внутренним участком
5'-HT0. IRES-элементы разных групп пикорнавирусов имеют длину от 400-450 нуклеотидов, обладают очень развитой вторичной структурой высококонсервативной для различных серотипов вирусов. В настоящее время выделяют три типа вторичных структур для пикорновирусных 5'-нетранслируемых областей: 1) кардио- и афтовирусы, 2) энтеро- и риновирусы, 3) вирус гепатита А. IRES-элементы пестивирусных мРНК также не кэпированы, сильноструктурированы и, в отличии от пикорнавирусов, включают еще 30 нуклеотидов кодирующей последовательности вирусного полипротеина и функционально важный структурный элемент - псевдоузел. Схематически IRES-элементы EMCV (Encephalomyocarditis virus) и CSFV (Classical swine fever virus) изображены на рис.la и 16.
В связи с такой необычной организацией 5'-НТО этих мРНК
большой интерес представляет изучение механизма их инициации
трансляции. Вторичная и/или третичная структура IRES-элементов
абсолютно важна для трансляции пикорнавирусных и
пестивирусных мРНК. Белковый синтез этих мРНК обеспечивается
трансляционным аппаратом инфицированной клетки
млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации (Pestova et а/., 1996, Pestova et а/., 1998). Внутренняя инициация трансляции используется и рядом клеточных мРНК, такими как мРНК транскрипционного фактора TFIID, мРНК некоторых факторов роста и шаперонов. Регуляция трансляции этих матриц особенно важна для нормального функционирования клетки. Исследование специфического взаимодействия между структурными элементами 5'-НТО мРНК пикорнавирусов, пестивирусов и трансляционным аппаратом клетки могло бы пролить свет на детали механизма инициации белкового синтеза у кэп-независимых мРНК, которые неизвестны в настоящее время.
Эти исследования несомненно важны для понимания регуляторных процессов на стадии инициации трансляции, нарушение которых тем или иным образом губительно для клетки.
Цель работы.
Как показано в нашей лаборатории Т.В.Пестовой, главную роль в первичном узнавании 5'-НТО РНК EMCV играет инициаторный фактор eIF4G, а в узнавании 5'-НТО РНК HCV и CSFV - сама 40S рибосомная субчастица. В структурном
Рис.1 Схематическое изображение вторичной структуры IRES-элементов РНК а) пикорнавирусов (на примере представителя кардиовирусов - EMCV ) и б) пестивирусов (на примере CSFV). Домены обозначены латинскими буквами в случае EMCV и римскими цифрами в случае CSFV, согласно принятой на сегодняшний день номенклатуре.
отношении, однако, эти взаимодействия не были охарактеризованы. Целью настоящей работы являлось изучение специфических взаимодействий между IRES-элементами EMCV (Encephalomyocarditis virus), FMDV (Foot-and-mouth disease virus), HCV (Hepatitis С virus) и CSFV (Classical swine fever virus) и компонентами трансляционного аппарата клетки.
Научная новизна и практическая ценность.
В результате настоящей работы впервые выявлены участки специфических взаимодействий между инициаторным фактором elF4G и IRES-элементом мРНК EMCV. Исследовано влияние на это взаимодействие факторов инициации eIF3, eIF4A и eIF4B. Впервые
локализованы сайты связывания вспомогательного фактора РТВ (pyrimidine tract-binding protein) на IRES-элементах EMCV и FMDV. Впервые охарактеризованы специфические взаимодействия эукариотической 40S рибосомной субчастицы и фактора инициации eIF3 с IRES-элементами HCV и CSFV . Полученные результаты представляют несомненную значимость, так как проливают свет на механизм инициации трансляции на молекулярном уровне, описывая первичные контакты в бинарных комплексах между компонентами трансляционного аппарата и мРНК, что абсолютно необходимо для дальнейшего изучения регуляции трансляции мРНК в целом.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и одна находится в печати. Результаты работы докладывались на Международных конференциях "Translational control", Голд Спринг Харбор, США 1996 г., "The first Annual Meeting of the RNA Society" , Мэдисон, США 1996 г., "Howard Hughes Medical Institute Meeting" , Прага, Чехия, 1996 г. и Варшава, Польша, 1997 г.
Структура и объем работы.
