Введение к работе
Актуальность проблемы. В процессах поддержания їсизнедеятельности «ивой клетки и воспроизведения ее генетической информации центральное место занимают нуклеишво-белковые взаимодействия и, в частности, РНК-белковые взаимодействия. Круг биологических структур, состоящих из РНК и белка, очень широк, и в него попадают совершенно различные как в структурном, так и в функциональном отношении об'єкта, такие как рибосомы и вирусы, ияформосомы и т.д. Существенной чертой известных до недавнего времени рибонуклеопротеидов являлось то обстоятельство, что взаимодействия между белком и РНК (ионные, гидрофобные, водородные связи) можно разрушить, используя жесткие денатурирующга обработки. РНК и белки довольно сильно различаются по своим свойствам, и поэтому после соответствующих обработок их можно отделить друг от друга.
Однако не так давно выяснилоеь, что круг рибонуклеопротеидов еще шире: были обнаружены вирусные РНК-белковые соединения, которые не удавалось разделить на составные компоненты, даже используя жесткие обработки. Причина заключалась в том, что белок был связан с РНК ковалентно. С функциональной точки зрения, целый ряд данных свидетельствовал об участии белка, входящего в состаа ковалентного комплекса, з репликации той вирусной РНК, с которой он связан. 3 чем конкретно заключается эта роль, что общего в структуре и механизме функционирования таких соединений -предстояло выяснить. С другой стороны, если существуют вируспн-ковалентные РНК- белковые комплексы, то следует ожидать, чіо сходные структуры могут существовать и в нормальных, незараженяых вирусами клетках. Какие белки входят в состав таких соединений, какова их роль в клетке, ззчем может быть нужна ковалентно связанная с белком РНК - вопросы далеко не праздные. Выбранное направление кажется тем более привлекательным, что новый тип РНК-Фзлковых структур подразумевает наличие у них и новых, возможно. неожиданных функций.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования яьилп-поиск новы? вирусных, а также клеточных ковалзнтных РНК-белкош;/
соединений, характеристика составляющих их компонентов, определение структуры таких комплексов, выяснение функций белков, ковалентно связанных с РНК и характеристика их генов. Шли поставлены и решались следующие задачи: I. Доказательство существования ковалентного соединения вирусного белка vpg с вирионной РНК вируса энцефаломиокардита, характеристика белка vpg и 5'-концевой области вирусной РНК. 2. Установление структуры ковалентного соединения vpg-PHK. 3. Моделирование репликации РНК вируса энцефаломиокардита in vitro и выяснение роли vpg в этом пі се. 4. Поиск клеточных ковалентних соединений белок-РНК, характеристика их компонентов и идентификация белка, связанного с РЖ. 5. Характеристика генов этого бежа в геномах человека и Е.соїі. 6. Создание бактериального штамма-продуцента соответствующего белка человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. Доказано наличие ковалентного соединения белка vpg с вирионной РНК вируса энцефаломиокардита; обнаружены две формы белка vpg. Определен тип связи между vpg и РНК. Определена первичная структура и предложена модель вторичной структуры 5'-концевой области РНК вируса энцефаломиокардита. Репликация РНК этого вируса моделирована в Оесклеточной системе. Обнаружено образование соединения vpg-мононуклеотид, выполняющего, по всей видимости, функцию праймера, при инициации синтеза вирусной РНК.
Разработан подход для поиска клеточных РНК-белковых комплексов. С его помощью в цитоплазме целого ряда клеток обнаружено ковалентное соединение белок-РНК. Показано, что белковый компонент этих комплексов имеет МБ 13 кДа и идентичен протимозину а (ПроТа).' ПроТа связан с 5'-концом цитоплазматичвской РНК, имеющей длину около 20 нуклеотидных остатков. Обнаружено, что ПроТа эволюционно консервативен от бактерий до человека, что указывает на наличие у него универсальной клеточной функции. _Амплифщированы, клонированы и секвенированы безинтронные гены
ПроТа человеками—показана, что они являются процессированныш
псевдогенами. В геноме е. сої і обнаружены-—нуклеотидные последовательности, имеющие высокое сходство с различными областями гена ПроТа человека и ряд других особенностей, что
позволило высказать предположение о наличии сплайсинга у эубактерий. Создан и использован для испытаний с целью создания медицинского иммуностимулирупцего препарата бактериальный штамм-продуцент ПроТа человека.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на iv и v Всесоюзных биохимических сездах, Ленинград, 1979 г., Киев, 1986 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки. Структура, функции, вззимодейстие", Москва, 1979 г.; на Международном симпозиуме "Стратегия генома РНК-содержаида вирусов животных". Москва, 1980 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Реализация наследственной информации", Паланга, 1980 г.: на и и iv двустороннем советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке", Пущино, 1980 г.. Киев, 1984 г.; на ні Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии, Тбилиси, 1982 г.; на vi двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", Цхалтубо. 1982 г.; на xvi конференции ФЕЮ, Москва, 1984 г.; на Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Москва, 1985 г.; на viii об'вдияеняом симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии", Рига. 1985 г.; на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии", Москва, 1985 г.; на viii двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Молекулярная биология белков я нуклеиновых кислот", Москва, 1986 г.; иа Республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1986 г.; на Международном симпозиуме "Фундаментальные и прикладные аспекты молекулярной биологии пикорнавирусов", Москва, 1988 г.; на viii двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов", Иркутск, 1989 г.; на п двустороннем симпозиуме СССР-США "Структура эукарнотического генома и регуляция его экспрессии", Тбилиси, 1989 г.; на х двустороннем симпозиума СССР- Франция "Регуляция экспрессии генома зукзриот и прокариот", Киев, 1990 г.; на и и in Всесоюзной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", Пущино, 1991 г., 1992 г.; на двустороннем российско-французской симпозиуме по фазико-химическиы основам
жизни, Конкарно (Франция), 1992 г.; на российско-американском симпозиуме "Геном человека", С.-Петербург, 1992 г.
