Введение к работе
Актуальность проблемы. Морские организмы, на жизнедеятельность которых влияет множество факторов (соленость океанических вод, гидростатическое давление, колебания температур, освещенность и другие), продуцируют эффективные и стабильные ферменты различной специфичности. Изучение структуры и каталитических свойств этих ферментов является актуальной задачей современной энзимологии.
Данная работа посвящена исследованию двух групп ферментов из морских моллюсков: О-гликозидгидролаз, катализирующих трансформацию углеводов и углеводсодержащих веществ, и ферментов, участвующих в метаболизме соединений, содержащих сульфатную группу.
О-гликозидгидролазы: 1^3-р-О-глюканазы (ламинариназы) и p-D-глюкозидазы, являются ключевыми ферментами метаболизма углеводов. К настоящему времени имеется ряд данных о структуре и механизме действия ламинариназ и глюкозидаз из морских беспозвоночных. Особенностью этих ферментов является способность катализировать с одинаковой эффективностью как реакции гидролиза, так и синтеза О-гликозидных связей. Субстратами ламинариназ являются 1^-3-р^-глюканы и смешанные 1^3;1^4- и 1^-3;1^-6-р^-глюканы, представляющие собой полифункциональные соединения и нередко обладающие иммуномодулирующей, противоопухолевой и радиопротекторной активностью. Изучение механизма действия, свойств и структуры новых О-гликозидгидролаз позволит расширить теоретические знания об этих ферментах и создаст основу для их практического использования в установлении структуры олиго- и полисахаридов и в ферментативном синтезе новых биологически активных соединений.
Сульфатирование и десульфатирование биомолекул морского происхождения и роль этих процессов в жизнедеятельности морских организмов в настоящее время практически не изучены, несмотря на то, что сульфатированные углеводы, белки и вторичные метаболиты в них широко представлены. Поэтому изучение сульфатаз, катализирующих гидролиз сульфоэфирных связей, и тирозилпротеин сульфотрансфераз, которые катализируют широко распространенный в организмах процесс переноса сульфатной группы на молекулы белков и пептидов, является важной задачей. С участием этих ферментов осуществляются детоксикация ксенобиотиков, белок-белковые взаимодействия, в которых участвуют белки системы гемостаза, хемотаксиса, а также белки, вовлечённые в развитие вирусных инфекций и онкологических заболеваний.
Цель и задачи работы. Цель работы - изучение специфичности, механизма действия и структуры некоторых гидролаз морских моллюсков (ламинариназ, p-D- глюкозидаз, сульфатаз), катализирующих трансформацию углеводсодержащих природных соединений, а также тирозилпротеин сульфотрансфераз.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) выбрать моллюсков с высоким уровнем активности ферментов; 2) разработать схемы очистки О-гликозидгидролаз и сульфатаз из выбранных объектов; 3) исследовать основные биохимические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 4) установить первичную структуру эндо-1^-3-р^-глюканазы и ее принадлежность к определенному структурному семейству О-гликозидгидролаз; 5) исследовать трансгликозилирующую активность новых О-гликозидгидролаз; 6) провести сравнительный анализ специфичности сульфатаз морских моллюсков из различных мест обитания; 7) разработать методы поиска тирозилпротеин сульфотрансфераз, продуцируемых морскими беспозвоночными и установить аминокислотную последовательность этого фермента.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований найдены новые источники ферментов, катализирующих не только реакции гидролиза, но и переноса функционально значимых остатков глюкозы и сульфатных групп. Из морского моллюска Littorina sitkana выделены гомогенные эндо- 1^3-р-О-глюканаза (КФ 3.2.1.39) и p-D-глюкозидаза (КФ 3.2.1.21). Определены биохимические свойства, специфичность, тип действия и трансгликозилирующая активность этих ферментов. Установлены первичные структуры эндо-1^-3-р^- глюканазы и тирозилпротеин сульфотрансферазы из L. sitkana. Выделены и охарактеризованы две новые сульфатазы из брюхоногих моллюсков L. sitkana и Turbo chrysostomus, катализирующие гидролиз сульфатной группы в тритерпеновых гликозидах голотурий. Получены данные о природных соединениях, оказывающих ингибирующие или активирующие действие на исследуемые ферменты.
Изучение молекулярных и каталитических свойств О-гликозидгидролаз позволило выявить особенности действия этих ферментов и определить возможности их практического использования в исследованиях структуры углеводсодержащих веществ и синтезе новых биологически активных гликоконьюгатов. Основные положения, выносимые на защиту.
-
Эндо-1^-3-р^-глюканаза (КФ 3.2.1.39), выделенная из печени брюхоногого моллюска L. sitkana, на основании установленной аминокислотной последовательности отнесена к 16-му структурному семейству О-гликозидгидролаз.
-
Эндо-1^-3-р^-глюканаза из L. sitkana синтезирует как р-1^3-, так и р-1^4- гликозидные связи, её трансгликозилирующая активность выше гидролитической, что отличает эту глюканазу от известной эндо-1^-3-р^-глюканазы из морского моллюска Pseudocardium (Spisula) sachalinensis.
-
p-D-Глюкозидаза (КФ 3.2.1.21), выделенная из печени L. sitkana, обладает необычной способностью катализировать гидролиз ламинарана.
-
Моногалактодиацилглицерин, выделенный из бурой водоросли Fucus evanescens, действует на активность p-D-глюкозидазы и эндо-1^-3-р^-глюканазы из L. sitkana подобно известным ингибиторам нойримицину и глюконолактону.
-
Арилсульфатазы (КФ 3.1.6.1), выделенные из печени брюхоногих моллюсков L. sitkana и T. chrysostomus, катализируют гидролитическое отщепление сульфатной группы в положении С4 остатка ксилозы, входящей в состав углеводных цепей гликозидов голостанового ряда.
-
Методом Вестерн-блота показано присутствие ТПСТ в некоторых видах морских моллюсков. Установлена аминокислотная последовательность ТПСТ L. sitkana. Апробация работы. Материалы данной работы были представлены автором в виде стендовых и устных сообщений на IV Европейской конференции «Marine natural products», Франция, 2005 и на I международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах из списка ВАК РФ и 3 тезисов докладов в материалах научных конференций. Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем были выполнены анализ литературы, планирование экспериментов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль соискателя была определяющей. Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы вкючает 208 источника. Диссертация изложена на 138 страницах и содержит 21 таблицу и 41 иллюстрацию. Сокращения и условные обозначения. а.о. - аминокислотный остаток, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ДСН - додецилсульфата натрия, ИЭР МС/МС - тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, МАЛДИ МС - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, PMSF - фенилметилсульфонилфторид, п.н. - пара нуклеотидов, ТПСТ - тирозилпротеин сульфотрансфераза, ФАФС - 3'- фосфоаденозин-5'-фосфосульфат.
