Введение к работе
Актуальность проблемы. Начавшаяся около 30 лет назад пандемия ВИЧ-инфекции и СПИДа охватила все регионы мира. Согласно оценкам, к концу 2008 года численность ВИЧ-инфицированных составила около 33.4 миллионов. Количество умерших от СПИДа достигло 20 миллионов. Каждый день в мире вирусом СПИДа заражаются 7400 человек. Одни из самых высоких темпов роста заражения ВИЧ-инфекцией в мире наблюдаются в Украине и России. Именно поэтому задача разработки эффективных лекарственных препаратов для борьбы с вирусом является особенно актуальной для нашей страны. Одной из самых привлекательных мишеней для разработки ингибиторов является вирусный фермент интеграза (ИН), катализирующая интеграцию вирусной ДНК в клеточную.
На настоящий момент протестировано более 250 000 потенциально-возможных ингибиторов интегразы, но только один из них препарат Isentress или ралтегравир официально разрешен к применению в качестве одного из компонентов высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Однако даже комплексная терапия не способна полностью подавить репликацию вируса и с течением времени к ней развивается устойчивость. Так показано, что устойчивость к ралтегравиру развивается у некоторых пациентов в течение 12 недель. На стадии клинических испытаний находятся только близкие к ралтегравиру по механизму действия ингибиторы. Уже показано, что к ним развивается устойчивость, перекрестная с ралтегравиром. В связи с этим разработка новых ингибиторов интеграции, механизм действия которых отличается от действия ралтегравира, является актуальной задачей.
Поиск новых ингибиторов осложняется тем, что зачастую активные in vitro ингибиторы, оказываются неактивными in vivo. Эксперименты на культуре ВИЧ-инфицированных клеток достаточно трудоемки и дороги, поэтому, несомненно, актуальным является создание системного подхода к оценке механизма действия ингибиторов, который позволил бы отсеять соединения, неспособные работать in vivo и обладающие механизмом действия, схожим с уже известными ингибиторами, к которым выработались устойчивые штаммы вируса.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в создании системы методов, позволяющей охарактеризовать механизм ингибирования ИН различными соединениями и дать рекомендации по дальнейшему применению новых ингибиторов.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
Сформулировать общую схему характеристики ингибиторов ИН.
Оптимизировать методику ингибирования каталитической активности ИН.
Разработать методику, позволяющую изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН.
Провести апробацию разработанных подходов на ингибиторах ИН с известным
механизмом действия.
5. Осуществить поиск новых ингибиторов ИН и исследовать их механизм ингибирования интеграции с использованием разработанной системы подходов.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе разработана и апробирована система подходов для характеристики ингибиторов ИН с различными механизмами действия in vitro. В частности, можно сказать какой этап интеграции подавляется, связывается ли ингибитор в каталитическом центре ИН или с С-концевым доменом белка, взаимодействует ли ингибитор с ионом металла в активном центре ИН, способен ли действовать на пресформированный комплекс ИН/ДНК. Разработана методика, позволяющая изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. Кроме того, изучено влияние клеточного партнера ИН, LEDGF/p75, на каталитическую и ДНК-связывающую активность фермента. С использованием метода кросс-линкинга уточнено расположение вирусной ДНК в ее комплексе с ИН и LEDGF. Предложено использовать комплекс ИН/LEDGF в качестве более адекватной модели для характеристики действия ингибиторов ИН ВИЧ-1 in vitro. Исследование действия ингибиторов на активность ИН в комплексе с LEDGF позволит дать рекомендации к дальнейшему изучению их действия на культуре ВИЧ-инфицированных клеток.
Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1. Найден новый класс ингибиторов интегразы: нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны, изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам З'-процессинга, связываются в активном центре ИН, препятствуют связыванию в нем ДНК-субстрата и не взаимодействуют с ионом металла-кофактора.
Показано, что димерные бисбензимидазолы (DBBI) способны ингибировать обе стадии интеграции за счет нарушения правильной укладки ДНК-субстрата в активном центре ИН. Эффективность ингибирования зависит от природы линкера, соединяющего пары бензимидазолов, и может различаться в 300 раз. На основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI обусловлена разным механизмом их действия: DBBI с гептаметиленовым линкером является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI с триэтиленгликолевым линкером предполагается неконкурентный или более сложный механизм ингибирования.
Публикации и апробация работы. По материалам публикации опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных реферируемых журналах. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006", секция "Химия. Науки о живом" (Москва, 12-15 апреля 2006 г.), 32nd FEBS Congress - Molecular Machines (Вена, Австрия, 7-12 июля 2007 г.), VI съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 6-10 апреля 2009 г.), научной конференции «Bionano'09. Химическая
биология, фундаментальные проблемы бионанотехнологии», (Новосибирск, 10-14 июня 2009 г.), международной конференции «Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface» (Манчестер, Великобритания, 7-8 сентября 2009 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 65 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированные работы.
