Содержание к диссертации
Введение
I. Введение : 5
1.1. Объекты исследования 6
1.2. Цели и задачи работы 6
1.3. Основные реализованные в работе подходы 7
II. Обзор литературы 8
2.1. Введение 8
2.2. Классификация токсинов 10
2.3. Структурные особенности токсинов 12
2.4. Биосинтез полипептидных токсинов 16
2.5. Биологические свойства полипептидных токсинов
2.5.1. Токсины, действующие на К+ каналы 18
2.5.2. Токсины, действующие на Са2+ каналы 22
2.5.3. Токсины, воздействующие на Na+ каналы 26
2.5.4. Токсины, действующие на другие типы рецепторов 31
2.5.5. Токсины с неспецифичным действием
2.6. Современные подходы к исследованию токсинов пауков 34
2.7. Заключение 36
III. Материалы и методы исследования 38
3.1. Материалы 38
3.1.1. Реактивы 38
3.1.2. Биологический материал и животные 38
3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 38
3.2. Математические вычисления и данные для анализа 38
3.2.1. Исходные данные для анализа 38
3.2.2. Вычисления
3.3. Оборудование 40
3.4. Методы
3.4.1. Создание библиотек EST из ядовитых желез 41
3.4.2. Получение кДНК из пауков и морских анемон 41
3.4.3. Определение нуклеотидной последовательности генов, кодирующих токсины 42 3.4.4. Получение экспрессированных TRPV1 рецепторов в ооцитах X. /aevis 42
3.4.5. Разделение ядов на компоненты 43
3.4.6. Протеомные исследования 44
3.4.7. Определение аминокислотных последовательностей 44
3.4.8. Химический синтез пептидов из ядов пауков 44
3.4.9. Получение рекомбинантных токсинов морских анемон 45
3.4.10. Определение концентрации полипептидов 46
3.4.11. Определение констант ингибирования сериновых протеиназ 4б
3.4.12. Биологические испытания
3.4.12.1. Тестирование антимикробной активности 46
3.4.12.2. Тестирование гемолитической активности 47
3.4.12.3. Анализ инсектицидной активности 47
3.4.12.4. Анализ токсичности для млекопитающих 47
3.4.12.5. Измерение анальгетической активности 48
3.4.12.6. Электрофизиологические исследования 48
IV. Результаты и обсуждение 49
4.1. Разработка алгоритмов для анализа банков нуклеотидных
последовательностей 49
4.1.1. Ферменты, задействованные в созревании полипептидных молекул
4.1.2. Субтилизин-подобные пропротеин конвертазы 52
4.1.3. Изучение принципов созревания активных полипептидов из природных ядов пауков 53
4.1.4. Симметричные и регулярные мотивы ограниченного протеолиза 56
4.1.5. Анализ выборки препробелков из банка аминокислотных последовательностей 58
4.1.6. Алгоритм установления структуры зрелой цепи 63
4.1.7. Алгоритм поиска токсинов 64
4.2. Анализ баз данных 68
4.2.1. Создание баз данных нуклеотидных последовательностей 68
4.2.2. Разработка запросов для проведения анализа баз данных пауков69
4.2.3. Анализ базы данных EST последовательностей A. orienta/is
4.2.4. Анализ базы данных EST последовательностей L tarabaevi 75
4.2.5. Сравнение методов анализа банков нуклеотидных последовательностей (мотивы против контигов) 79
4.2.6. Разработка запросов для проведения анализа баз данных морских анемон 82
4.2.7. Анализ базы данных последовательностей морской анемоны A. viridis 86
4.3. Протеомный анализ ядов пауков 95
4.3.1. Компонентный анализ яда паука A. orientalis 95
4.3.2. Компонентный анализ яда паука L tarabaevi 101
4.4. Выделение инсекто-специфических токсинов 103
4.4.1. Инсектотоксины из яда паука S. florentina 103
4.4.2. Инсектотоксины из яда паука L tarabaevi 106
4.5. Поиск полипептидов с антимикробными свойствами 110
4.5.1. Выделение полипептидов из яда паука L tarabaevi 110
4.5.2. Особенности биосинтеза и строения антимикробных компонентов из яда паука L tarabaevi 113
4.6. Поиск селективных модуляторов TRPV1 рецептора 114
4.6.1. Актуальность проблемы поиска модуляторов TRPV1 и первичное тестирование ядов 114
4.6.2. Выделение полипептидных компонентов из яда морской анемоны И. crisp а 115
4.6.3. Биологическая активность новых токсинов из морских анемон 1 V. Выводы 124
VI. Список сокращений 125
VII. Благодарности 127
VIII. Список цитируемой литературы
- Цели и задачи работы
- Токсины, действующие на Са2+ каналы
- Математические вычисления и данные для анализа
- Субтилизин-подобные пропротеин конвертазы
Введение к работе
-
-
Актуальность проблемы
Современная биологическая наука характеризуется мощными технологическими прорывами, благодаря чему возросли темпы сбора и обработки биоинформации, ускорились процессы расшифровки структур новых биомолекул, активно разрабатываются и внедряются постгеномные технологии. Практическую ценность приобретает не просто накопление массивов данных о новых структурных единицах, но и их дальнейший анализ с использованием различных алгоритмов поиска функционально-значимых структур. Очевидно, что время «ручных» анализов безвозвратно ушло, поэтому, активно разрабатываются и внедряются многочисленные автоматизированные методы по работе с биоинформацией, в частности по анализу баз данных случайных нуклеотидных последовательностей – dbEST.
Настоящая работа посвящена изучению биологически активных молекул полипептидной природы, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии или агропромышленном комплексе. Интенсивный поиск новых активных белковых молекул проводится во всем мире с применением различного арсенала исследовательских средств. Для анализа собранных результатов существуют общие схемы обработки данных, отдельные приложения и автоматизированные программные комплексы. Однако, эффективность неспециализированных приложений очень низкая. Основываясь на общедоступных ресурсах белковых последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.) и баз данных EST, полученных самостоятельно или загруженных с сетевого ресурса NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest), предложен новый эффективный алгоритм анализа, специализированный для поиска полипептидных токсинов.
Для поиска новых лекарственных средств идеально подходит яд животных – сложная многокомпонентная смесь различных биоактивных молекул. Созданный по принципу комбинаторной библиотеки яд одного вида животного может содержать от 10 до 500 различных компонентов. Таким образом, актуальными задачами исследования природных ядов являются, во-первых, характеристика структурного разнообразия различных компонентов, во-вторых, поиск соединений, которые обладают специфическим действием на представляющую интерес биологическую мишень.
-
-
-
Цели работы
Основной задачей работы является разработка и практическая апробация новых подходов для направленного поиска полипептидных структур.
Данные о новых структурах могут быть получены при проведении прямых исследований собранных образцов природных ядов. В этом случае используется техника постадийного фракционирования компонентов или протеомика цельного яда. Эффективным также является применение комбинации обеих технологий.
Более перспективный метод, дающий одновременно выверенные полипептидные последовательности компонентов яда, основан на анализе нуклеотидных последовательностей баз данных EST. Этот метод изучает транскриптом изучаемого образца и при наличии специально разработанных алгоритмов анализа позволяет идентифицировать большинство из имеющихся в яде полипептидов. Одной из основных целей работы является разработка специализированного алгоритма анализа EST банков последовательностей и методов предсказания зрелых полипептидных структур из ядов пауков.
В рамках работы проводился направленный поиск активных компонентов, имеющих (1) выраженную токсичность к насекомым, (2) способных эффективно подавлять рост микроорганизмов и (3) модулировать проводимость ионотропного ваниллоидного рецептора 1 (TRPV1).
-
-
Научная новизна и практическая значимость
Разработанные алгоритмы по эффективности поиска полипептидных токсинов в базах структурных данных показали большую эффективность по сравнению с традиционными методами анализа. Они могут быть успешно применены, как для систематизации уже собранных данных, так и для аннотирования вновь создаваемых банков последовательностей.
Полученные в ходе выполнения данной работы инсектотоксины и антимикробные пептиды представляют значительный практический интерес для сельского хозяйства, поскольку могут быть использованы для повышения устойчивости культурных растений.
Охарактеризованные в ходе выполнения этой работы антимикробные пептиды имеют определенный потенциал использования в медицинских целях в качестве антибиотиков нового типа.
Впервые обнаруженные природные полипептидные молекулы, обладающие ингибирующей активностью в отношении TRPV1 рецептора, могут быть использованы для создания лекарственных анальгетических средств нового поколения.
-
-
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на российских и международных конференциях:
VI Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2002);
III Съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);
14 Мировой конгресс по животным, растительным и микробным токсинам (Аделаида, 2003);
Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (Москва, 2003);
Научная конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005);
15 Мировой конгресс по животным, растительным и микробным токсинам (Глазго, 2006);
VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2006);
2 Симпозиум по биофизике мембрано-активных пептидов (Лиссабон, 2007);
Симпозиум «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007);
III Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);
XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008);
IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);
16 Собрание Европейской секции международного общества токсинологии (Лёвен, 2008);
международная конференция “Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008);
12 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века». (Пушино, 2008);
Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech08 (Москва, 2008);
34 Конгресс федерации Европейский биохимических обществ (Прага, 2009);
IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009);
Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009);
Конгресс по TRP рецепторам (Стокгольм, 2009).
-
-
Публикации
Материалы диссертационной работы отражены в 14 научных статьях, 3 обзорных статьях и 3 главах научных сборников.
-
-
Патенты
В рамках выполнения диссертационной работы получено 7 патентов Российской Федерации и 1 международный патент.
-
-
Объем и структура диссертации
Цели и задачи работы
Каждый биологический класс животных пошел своей эволюционной тропой, поэтому не все яды одинаковые: есть структурно ограниченные, есть структурно разнообразные, есть функционально ориентированные. Одними из самых интересных представителей ядовитой фауны являются пауки. Количество описанных биологических видов пауков огромно - более 40000 [1]. Количество компонентов в их ядах в среднем более 100, что предполагает наличие нескольких миллионов структур активных компонентов с чрезвычайно широким спектром действия.
Практически на уровне каждого вида реализовано широкое разнообразие синтезируемых структур за счет комбинаторики в распределении аминокислотных остатков на основании нескольких общих структурных матриц. Такая организация позволяет эффективно подбирать "ключи" к самым различным "замкам" клеточных рецепторов, поэтому поиск потенциальных лекарств на основе структур полипептидных токсинов считается одним из наиболее перспективных. Большее внимание в данной работе было сосредоточено на исследовании ядов пауков. Все подробности о ядах и токсинах пауков рассматриваются в разделе обзор литературы.
Помимо пауков широко распространены большие комбинаторные полипептидные библиотеки в ядах морских животных, наиболее известные из них -улитки конусы и морские анемоны. Полипептидные токсины морских анемон так же стали объектом исследования данной работы.
Работа ориентирована на достижение результатов, обладающих значительным потенциалом для внедрения в практику. Основной задачей работы является разработка и практическая апробация новых подходов для направленного поиска полипептидных структур. Данные о новых структурах могут быть получены при проведении прямых исследований собранных образцов биологических ядов. В этом случае используется техника постадийного фракционирования компонентов или протеомика цельного яда.
Более перспективный метод, дающий одновременно выверенные полипептидные последовательности токсинов, основан на анализе случайных нуклеотидных последовательностей (EST). Этот метод изучает транскриптом изучаемого образца и при наличии специально разработанных алгоритмов анализа позволяет идентифицировать большинство из имеющихся в яде токсинов. Одной из основных целей работы является разработка специализированного алгоритма анализа EST банков последовательностей и методов предсказания зрелых активных полипептидных структур из ядов пауков.
Также в рамках работы проводился направленный поиск активных компонентов, имеющих (1) выраженную токсичность к насекомым, (2) способных эффективно подавлять рост микроорганизмов и (3) модулировать проводимость ионотропного ванилоидного рецептора transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1).
Развитие новых технологий и совершенствование инструментальной базы привело к появлению новых течений и тенденций в биохимии. Основной упор в работе сделан на внедрение таких новаторских технологий в процесс поиска новых полипептидных структур, представленных в природных ядах животных. Разработанные уникальные программы математического анализа массивов полнпептидных последовательностей позволили сформулировать новые структурные аминокислотные мотивы и проследить последовательность формирования активных полипептидов в процессе их созревания из неактивного препробелка. В свою очередь, для подтверждения правильности расчетов и предсказаний проводились протеомные исследования различных образцов ядов животных, а также использовались традиционные хроматографические методы выделения активных полипептидов.
В данной работе продемонстрирована неотъемлемая связь в исследовании белков и генов их кодирующих. Доказано, что для получения полной информации о структуре всевозможных вариантов имеющихся в ядах полипептидов надо подтверждать протеомные исследования геномными, а геномные исследования протеомными.
В качестве объектов исследования были выбраны яды пауков среднеазиатского региона: Agelena orientalis; Lachesana tarabaevi и Segestria florentina. Кроме того проводили детальное исследование спиртового экстракта из тропического вида морской анемоны Heteractis crispa и базы данных EST средиземноморской анемоны Anemonia viridis.
Природные токсины представляют собой обширную группу природных соединений разнообразной химической природы. Особое место принадлежит полипептидным токсинам, которые составляют, по-видимому, наиболее многочисленный класс природных токсинов и образуют обширные гомологичные семейства. В основном они состоят только из обычных аминокислотных остатков, однако встречаются и молекулы с модифицированными аминокислотами. Многие полипептидные токсины являются сегодня важными инструментами в исследовании молекулярной организации различных рецепторных комплексов, а некоторые уже нашли применение как терапевтические средства в медицине.
Интерес к полипептидным токсинам пауков, в первую очередь, как к инструментам для проведения научных исследований возник в конце 80х годов прошлого века, когда в нескольких лабораториях были охарактеризованы первые полипептидные токсины из. пауков рода Atrax, Agelena и Phoneutria [2-7]. Дальнейшие успехи в области исследования полипептидных токсинов пауков приводили к постепенному росту публикуемых в научной литературе индивидуальных последовательностей. С начала нового тысячелетия заметен существенный рост количества таких публикуемых последовательностей в общедоступной мировой базе UniProt (Рисунок 1), что было обусловлено в первую очередь новыми технологическими прорывами в исследованиях белковых молекул. В результате количество известных структур полноразмерных полипептидных токсинов в открытой базе данных белковых последовательностей UniProt на конец октября 2010 года составило более 900 штук.
Среди ядовитых животных пауки (отряд Агапеае, класс Arachnida, подтип Chelicerata, тип Arthropoda) представляют собой одну из наиболее успешных в эволюционном отношении группу живых существ. Они появились на земле более 300 миллионов лет назад и следом за насекомыми являются наиболее распространенными и разнообразными существами на нашей планете.
Ранее уже упоминалось, что представители свыше 40 тысяч видов пауков на сегодня описаны в каталоге [1]. Однако биохимическому исследованию на сегодня подвергались весьма ограниченная часть видов, а в банк данных белковых стуктур попали токсины только из 52 различных видов пауков (Рисунок 2).
Токсины, действующие на Са2+ каналы
Два южноамериканских паука G. rosea и Brachypelma smithi стали источником выделения еще двух ингибиторов Na+ каналов GrTxl (Р85117) и Bsl (B3FIV1). Для GrTxl были измерены максимальные значения блокирования Na+ токов 85% при концентрации 10 мкМ (1С50 2.8 мкМ) на клетках нейробластомы F-11, эффекта на К+токи замечено не было [119]. Для токсина Bsl, протестированного на большом количестве различных экспрессированных в ооцитах лягушки Na+ и нескольких К+ каналах, найден незначительный эффект при концентрации 2 мкМ на Para/tipE рецептор насекомых. Характер воздействия токсина на канал позволил предположить взаимодействие токсина с сайтом 4 [120].
Яд китайского тарантула С. jingzhao стал источником большого количества нейротоксинов, действующих на Na+ каналы. Полипептидный токсин джингзяотохин-І (Р83974) на TTS-R каналах кардиомиоцитов имел сродство в 30 раз большее, чем на TTX-S типах (1С5о 31.6 нМ). JZTX-I уменьшал скорость инактивации и характеристики проводимости канала аналогично а-токсинам скорпионов, действующим по сайту 3 [121, 122].
JZTX-III (Р62520), изначально охарактеризованный как селективный ингибитор TTS-R каналов кардиомиоцитов (1С5о 380 нМ) [123], в дальнейшем проявил себя еще и как ингибитор KV2.1 каналов (Kd 430 нМ), взаимодействующий с 4 сайтом канала [124].
Для JZTX-IV был измерен необычный эффект воздействия на Na+ каналы в DRG нейронах, его аппликация приводила к сдвигу кривой активации в область большей деполяризации мембраны (противоположный эффект токсинам действующим по сайту 4) и замедляла инактивацию канала в состоянии покоя (в отличие от токсинов действующих по сайту 3) [125], что позволило предположить наличие еще одного нового сайта взаимодействия токсинов с Na+ каналами.
Токсин JZTX-V (Q2PAY4), ингибирующий как TTX-R, TTX-S Na+ каналы, так и KV4.2 К+ каналы, большей селективностью действия обладал по отношению к Na+ каналам. Для каналов TTX-R, TTX-S ЕС5о составляло 27.6 и 30.2 нМ против 604.2 нМ для KV4.2 [126].
Еще один токсин JZTX-IX (Р0СН44) ингибирует TTX-R, TTX-S Na+ каналы и Kv2.1 К+ каналы. Предположительно, воздействуя на сенсор напряжения в стадии покоя, он приводит к полному блоку тока, который достигается при концентрации в 10мкМ[127]. Совсем недавно было найдено целое семейство родственных токсинов в яде паука A. orientalis, которые за необычный эффект воздействия на DmNa(V)l/tipE Na+ каналы насекомых были названы р/8 агатоксины (Q5Y4U7, Q5Y4U6, Q5Y4V8, Q5Y4V3, Q5Y4V2, Q5Y4U8, Q5Y4V6). Предположительно, связываясь по еще одному новому сайту рецептора, токсины повышают проводимость Na+ каналов за счет сдвига потенциала активации, подобно токсинам, действующим по 4 сайту, и одновременно замедляют процесс инактивации канала [13].
Два полипептидных нейротоксина ProTx-I (Р83480) и ProTx-II (Р83476) из яда паука Thrixopelma pruriens имеют низкую степень структурного родства с ингибиторами Na+ каналов. Среди всех известных токсинов специфичность их к Na+ каналам самая низкая. Помимо обратимого ингибирования TTX-S каналов нейротоксины действовали на TTX-R каналы (NaVi.s и NaVi.s каналы) и на Са2+ каналы, снижая пиковое значение тока и изменяя значения активации и инактивации каналов [128]. Столь высокая неизбирательность действия связана с ориентированностью токсина на потенциал чувствительный домен потенциал-активируемых ионотропных рецепторов, что в принципе совпадает с 3 сайтом узнавания для Na+ канала. Однако, проведение комплексного исследования и мутагенеза РгоТх-П выявило, что, по-видимому, токсин взаимодействует с сенсором напряжения по новому сайту узнаванию, отличному от 3 и 4 сайта [129]. 2.5.4. Токсины, действующие на другие типы рецепторов
Разнообразие мишеней действия дисульфид-содержащих пептидов из ядов пауков не ограничивается системами ионного транспорта. Например, пептид ТхЗ-4 из яда P. nigriventer, помимо действия на кальциевые каналы, обладает способностью блокировать обратный захват глутамата в синаптосомах, по-видимому, воздействуя на глутаматный транспортер [130]. Функция некоторых пептидов, как в случае CSTX-13 из яда С. salei, может и вовсе состоять в потенцировании активности других компонентов [131].
Еще одна интересная мишень для полипептидных токсинов пауков - Acid-sensing ion channels (ASICs) ионные каналы, принимающие участие в процессах передачи болевых сигналов. Известен псалмотоксин 1 (Р60514), который с высокой аффинностью (IC50 0.9 нМ) взаимодействовал с ASIC 1а гомомультимерным каналом и не оказывал действия на ASICla/ASIC2a или ASICla/ASIC3 гетеромультимеры [132].
Механо-чувствительные каналы или stretch-activated ионные каналы, ток через которые возникает после применения механических стимулов, также принимают участие в распознавании болевых ощущений. Первый опубликованный полипептидный токсин паука из яда G. rosea GsAF II (Р61409), действующий на этот канал, был запатентован как анальгетическое средство [133]. Еще два гомологичных токсина GsMTx2 (Р60273) и GsMTx4 (Q7YT39) были выделены из яда G. spattilata. Наиболее активный GsMTx4 почти полностью блокировал проводимость механо-чувствительных каналов (Kd бЗОнМ) [134], тогда как GsMTx2 был в 6 раз менее активен [21].
Не менее важный пуринергический рецептор Р2ХЗ тоже нашел своего селективного ингибитора среди компонентов яда тарантула Geolycosa sp., он получил название пуротоксин-1 (Р86269). Ингибитор этого типа рецептора также относится к полипептидам с анальгетическим эффектом, способным блокировать болевые ощущения. Такой эффект достигается за счет увеличения времени нахождения каналов Р2ХЗ в закрытом состоянии под действием токсина [135].
Еще один важный рецептор, задействованный в восприятии и передаче болевых ощущений - TRPV1, относящийся к классу ванилоидных рецепторов, впервые получил специфичные полипептидные лиганды при изучении ядов пауков. Для него были найдены пептидные активаторы, способные связываться с ним и увеличивать капсаицин индуцируемую проводимость канала. Три пептида, названные ванилотоксинами VaTxl-3 (Р0С244 - Р0С246) обнаружили различную специфичность к этому рецептору VaTx3 VaTx2 VaTxl (ЕС5о 0.45 - 1.35 - 9.9 мкМ) и также проявили сродство к К+ каналам KV2.i [136]. Помимо них, известен еще один активатор "double-knot" токсин (Р0СН43) из тарантула С. jingzhao, прозванный так за вдвое больший размер и удвоенное количество дисульфидных связей. Этот токсин способен задерживать канал TRPV1 в открытом состоянии, но точное место его связывания с рецептором пока не определено [137].
Необычную биологическую активность проявляет токсин HWTX-XI (Р68425). Как уже ранее упоминалось в обзоре структурных особенностей строения полипептидных токсинов пауков, этот токсин является первым обнаруженным полипептидом из яда паука, имеющим пространственную укладку ингибиторов протеиназ. При тестировании ингибирующей активности против трипсина значение Kj составило 2.3x10-10 М, это равнялось эквимолярному стехиометрическому соотношению, и соответствовало активности BPTI (6.57 10 9 М). В экспериментах на DRG нейронах крыс и исследованиях на экспрессированных К+ каналах HWTX-XI также проявил себя как сильный блокатор KVi.i типа (ІС5о 11.6 нМ) и показал меньшую активность на KVi.2 и Куі.з типы каналов [138]. 2.5.5. Токсины с неспецифичным действием
Математические вычисления и данные для анализа
По мотиву 1 было найдено четыре полноразмерные структуры белков предшественников, три из которых полностью совпадали с ранее известными токсинами блокаторами натриевых каналов, из этого вида морских анемон. Это нейротоксин 2, токсин 2-ій нейротоксин 8. Четвертый полипептид, получивший имя нейротоксин 1-1, имел всего две аминокислотные замены по сравнению с еще одним известным полипептидом - нейротоксином 1.
Для полипептидных токсинов BDS-1/BDS-2 - специфических блокаторов быстро инактивирующихся К+ каналов KV3.4 [228] в банке была обнаружена структура белка предшественника BDS-1 и еще 12 близких структурных гомологов. Все они были обнаружены на мотив 2, имели хорошую гомологию друг с другом, и поэтому были названы также - BDS. Новые полипептиды получили номера с 3 по 14, наиболее представленным среди них по данным транскриптома являлся белок предшественник BDS-1 (15 повторов в банке EST). Остальные менее распространенные компоненты составляли вариабельное окружение, что соответствует принципам комбинаторного построения библиотек полипептидных токсинов у ядовитых животных.
Следующий известный блокатор калиевых каналов калисептин [29] (запрос по мотиву 3) не был найден в библиотеке, но были обнаружены 11 подобных по структуре полипептидов (avtx-1 - avtx-11). По гомологичности с известными структурами эта группа токсинов наименее похожа на известные (Таблица 12), поэтому велика доля вероятности, что специфичность действия этих токсинов не ограничивается калиевыми каналами. По количеству повторов в банке белок предшественник avtx-І оказался наиболее представленным из всех найденных структур - 103 повтора, что позволяет предполагать заметный уровень его экспрессии и функциональную значимость.
Полипептиды, имеющие характерный мотив укладки Кунитца, были обнаружены по мотиву 4. Среди всех перечисленных полипептидов, эти не имели профрагмента между сигнальным пептидом и зрелой частью, но некоторые имели короткие, выщепляемые С-концевые последовательности. Мотив структуры Кунитца впервые был открыт для протеолитических ферментов, однако характерен и для токсинов, в частности для каликлюдинов и молекул с антифунгальной и антимикробной активностью [29, 231, 232]. Среди выведенных структур в этой группе самыми представленными являются это ранее известный каликлюдин-3 и новый гомолог каликлюдин-4 (AsKC4). Также были обнаружены: одна последовательность, названная AsKCla, которая на один С-концевой аминокислотный остаток длиннее чем каликлюдин-1; один гомолог известного пептидного ингибитора 5 II, который был укорочен на три С-концевых аминокислотных остатка и получил название ингибитор протеиназ 5 III; и последовательности с высокой гомологией к каликлюдинам, которые получили название AsKC4-AsKC16.
Для этого вида морской анемоны ранее в литературе были описаны структуры нейротоксинов 3, 7, 9 и 10 [233, 234], однако по соответствующим им мотивам 6, 7 или 8 сиквенсы в исследуемой базе данных не были найдены. Несколько полипептидов было обнаружено на мотив 5. Две новые структуры были названы Gigt 4 и Gigt 5 за высокое родство к гигантоксину I из другого вида морской анемоны Stichodactyla gigantean [235]. Гигантоксин I является слабым паралитическим токсином, способным связываться с EGF рецептором, однако, исходя из немногочисленных но важных замен, таких как V—»Е, S— Е, QM—»КК, которые значительно изменяют общий заряд на молекуле, можно предположить, что функция полипептидов из A. viridis может быть отличной.
Две интересные последовательности белков предшественников пептидных токсинов AV-1, AV-2 были найдены по мотиву 9. Четыре зрелых полипептида из каждого белка предшественника были умеренно гомологичны пептидным токсинам Ат-1 из морской анемоны Antheopsis maculata [236]. Особенность белка предшественника Ат-1 СОСТОИТ В ТОМ, ЧТО В процессе своего созревания он расщепляется на 6 активных компонентов по специфическим сайтам ограниченного протеолиза, ранее описанным как R(K)toR, и далее в его структуре видны мотивы укорочения полипептидной цепи дипептидил пептидазой. В структуре новых найденных последовательностей присутствуют как характерные аминокислотные остатки, предопределяющие места ограниченного протеолиза, так и мотивы укорочения полипептидной цепи под действием JV-концевых дипептидаз. Для морской анемоны A. viridis такой комплексный белок предшественник полипептидных токсинов был обнаружен впервые.
По мотивам И, 13 и К была получена из EST банка 41 последовательность. Все структуры также приведены в таблице 12, хотя сравнение по blastp для них не дало значимых результатов. Однако все эти последовательности успешно прошли проверку на наличие правильного сигнального пептида и могут секретироваться клетками анемоны. Также, у большинства из них обнаруживаются мотивы отщепления профрагментов R(K)toR.
Последовательности, найденные по мотивам 11 и 13, были названы как токсин подобные. Среди них были 8 коротких цистеин-содержащих последовательностей, две последовательности (Tox-like av-1 и 5) по результатам поиска гомологии совпадали с некими предсказанными ранее структурами (см. данные в таблице 12). Помимо этого были обнаружены длинные цистеин-содержащие последовательности, названные Tox-like av-9 - Tox-like av-16. Они имели интересную особенность первичной структуры - наличие протяженного профрагмента сразу за сигнальным пептидом, в котором преобладают отрицательно заряженные аминокислотные остатки, тогда как в зрелой цепи расположено много аминокислотных остатков аргининов и лизинов. Такой профрагмент, вероятно, стабилизирует белок предшественник за счет компенсации избыточного положительного заряда зрелой цепи и ограничивает преждевременную деградацию под действием ферментов, подобно тому, как это было найдено для некоторых предшественников антимикробных пептидов, о которых речь пойдет далее. Исходя из большого количества положительно заряженных аминокислотных остатков, с уверенностью можно утверждать, о наличии у этих полипептидов цитотоксической функции.
На мотив К было обнаружено несколько явных цитотоксинов, не содержащих аминокислотных остатков цистеинов и сильно обогащенных лизинами, названные Цитолизин-подобными структурами Cyt-like av-1 - av-11. Эти последовательности неплохо представлены в анализируемом банке и группируются в структурное семейство. Определить последовательность зрелой цепи у этих белков оказалось наиболее проблематично. Положительно-заряженные аминокислотные остатки распределены по длине полипептидной цепи очень плотно, и, если рассматривать ограниченный протеолиз по мотиву R(K)toR, то в итоге должны получаться только 3-5 членные пептиды. Анализ процессов созревание цитотоксинов морских анемон показывает, что вероятнее всего, следует рассматривать комбинированный вариант мотивов протеолиза R(K)toR + EtoR. Тогда предполагали, что ограниченный протеолиз проходит после последовательности Е—KR. Следуя этому допущению, предлагается рассматривать два С-концевых фрагмента, около 40 аминокислотных остатков каждый, как наиболее вероятные зрелые полипептиды, получаемые из этих белков предшественников.
Субтилизин-подобные пропротеин конвертазы
Большинство протестированных пептидов обладали высокой антибактериальной активностью, сопоставимой с наиболее эффективными мембранолитическими соединениями, например, мелитином - основным компонентом яда медоносной пчелы Apis mellifera [246]. Как видно из полученных результатов, наиболее активные компоненты Ltc 1, Ltc 2а, Ltc 5 и CIT la имеют определенную специфичность к отдельным штаммам микроорганизмов. Они не просто превосходят мелитин по антимикробной активности, но и существенно менее токсичны для клеток млекопитающих (данные по гемолизу эритроцитов), что позволяет позиционировать эти новые полипептиды как вероятные лекарственные субстанции для разработки антибиотиков нового поколения.
Итогом изучения компонентов яда паука L. tarabaevi с использованием традиционного подхода, основанного на измерении антимикробной активности и токсичности к насекомым, стало обнаружение 17 активных компонентов.
Все обнаруженные в яде антимикробные компоненты принадлежат к 5 классу токсинов по классификации, изложенной в начале данной работы. Это подразумевает отсутствие аминокислотных остатков Cys в их структуре, что, с одной стороны, лишает такие молекулы жесткости пространственной укладки, а, с другой стороны, позволяет более гибко подстраиваться к окружению. Из экспериментальных данных, полученных в лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН, следует, что в водном растворе все найденные пептиды характеризуются неупорядоченностью структуры, в то время как в 50% растворе трифтор этанола, имитирующем мембранное окружение [247], пептиды принимают а-спиральную конформацию. Для наиболее активных компонентов Ltc 2а и CIT 1а спирализация увеличивалась с 6% и с 13% до одинаковой величины в 69%. Для анализа особенностей строения выгоднее представить оба этих белка в виде круговой диаграммы (Рисунок ЗОБ и В).
Аминокислотные последовательности белка предшественника антимикробного пептида Ltc 2а и зрелой последовательности цито-инсектотоксина 1а. (Б) Схема структурной организации молекулы предшественника Ltc 2а в виде а-спиральной шпильки с указанием места расщепления протеиназой. (В) Схема структурной организации молекулы CIT 1а в виде двух а-спиральных фрагментов с негидролизуемым петлевым участком. Положительно-заряженные аминокислотные остатки окрашены в голубой цвет, ароматические остатки в синий цвет, гидрофобные в черный цвет, отрицательно-заряженные в красный цвет, гидрофильные в желтый и малиновый цвет. Мотивы (псевдомотивы) ограниченного протеолиза подчеркнуты под приведенными аминокислотными последовательностями.
предшественников токсинов остальных структурных групп, состоят из сигнальной последовательности, балластной последовательности и зрелой цепи, иногда дополнительно имеются также отщепляемые С-концевые аминокислотные остатки. Особенностью латарцинов является то, что балластная последовательность состоит преимущественно из кислых аминокислотных остатков. Считается, что основная функция профрагментов состоит в обеспечении правильности сборки активных молекул и в защите клеток-продуцентов от нежелательной цитолитической активности зрелых цепей. По данным анализа вторичной структуры пропептиды тоже стремятся образовать а-спиральную структуру, компенсирующую положительный заряд токсинов, и тем самым препятствуют электростатическому связыванию последних с мембранами. Между двумя спиральными структурами находится хорошо экспонированный мотив ограниченного протеолиза ПКМ (Рисунок ЗОБ).
В отличие от латарцинов, CIT являются сравнительно длинными пептидами, вдвое превосходящими среднюю длину латарцинов. Их заряд также в среднем вдвое выше, и они склонны к формированию амфипатических структур в сс-спиральной конформации. Средняя часть CIT, по данным анализа, не склонна к спирализации, таким образом, структуру этих белков можно рассматривать как две связанные линкером а-спирали (сдвоенный латарцин с петлей) (Рисунок ЗОВ). Линкер хорошо экспонирован, а аминокислотная последовательность этого линкера похожа на мотив ПКМ, единственная ключевая мутация в 38 положении R — Q. Предполагается, что эта существенная замена, произошедшая в ходе эволюции, удачно закрепилась в ходе естественного отбора и привела к образованию нового класса полипептидных компонентов в ядах пауков.
Таким образом, при анализе структурных особенностей антимикробных компонентов яда паука L. tarabaevi была установлена эволюционная связь между латарцинами и цито-инсектотоксинами. А класс сдвоенных амфипатических полипептидов был впервые обнаружен в ходе выполнения данной работы.
Третьей тест-системой, использованной для поиска функционально активных компонентов природных ядов, было электрофизиологическое исследование модуляторов ионотропного рецептора TRPV1, активируемого капсаицином и теплом [248]. TRPV1 выполняет чувствительно-эффекторные функции в периферической нервной системе, где он осуществляет функцию восприятия термических, химических и механических стимулов. Известно, что в ряде патологических состояний TRPV1 играет важную роль, например, при болях воспалительного характера, раке, нейропатических и висцеральных болях, а также при воспалительных заболеваниях кишечника, интерстициальном цистите, недержании мочи, заболеваниях дыхательных путей, панкреатитах и мигренях [249].
Известны низкомолекулярные соединения, такие как арванил, капсаицин, NAD А, олванил, OLDA и RTX которые могут активировать TRPV1 [250]. Найдены три полипептидных агониста из яда тарантула P. cambridgei [136]. Так как для эффективного подавления боли желательно не активировать, а ингибировать проводимость этого рецептора, наибольший интерес представляют соединения, снижающие его проводимость. Было показано, что аргинин-богатые пептиды и низкомолекулярные соединения на основе триалкил глицина или Ruthenium red, ингибирующие проводимость TRPV1, в экспериментах in vivo проявляют анальгетический эффект [136, 251-255]. Данные о полипептидных ингибиторах TRPV1 до момента начала исследования отсутствовали.
Биологические испытания образцов ядов пауков проводили в условиях гетерологичной (овер-) экспрессии TRPV1 каналов в ооцитах лягушки X. laevis. Токи через мембрану ооцитов в ответ на аппликацию селективного агониста — капсаицина измеряли методом двухэлектродной фиксации потенциала.
Среди 34 образцов ядов пауков не удалось обнаружить достойного кандидата для выделения ингибитора TRPV1 каналов. В связи с этим было проведено исследование ядов других животных. Среди 3 препаратов экстрактов морских анемон был найден один, приготовленный из морской тропической анемоны Н. crispa, снижавший регистрируемый ток в электрофизиологических экспериментах.
Морские анемоны относятся к типу кишечнополостных и не имеют специализированных желез для наработки ядовитого секрета. Токсины продуцируются стрекательными клетками, расположенными по всей поверхности организма, поэтому как токового яда из анемоны не получают. Полипептидные компоненты с искомой активностью выделяли из спиртового экстракта целых организмов.
Разделение компонентов экстракта хроматографическими методами потребовало большего количества стадий, чем при работе с ядами пауков. Вероятно, это связано с тем, что комбинаторных вариантов в морских организмах, как эволюционно более древних накоплено больше. Часть операций была выполнена непосредственно после отлова животных сотрудниками лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под руководством д.х.н. Э.П. Козловской.
На первой стадии применяли гидрофобную хроматографию. Применение сорбента Полихром-1 позволило избавиться от таких представленных в экстракте балластных соединений, как липиды, пигменты, соли и низкомолекулярные соединения, а также гемолизинов, эффективно удаляемых промывкой водным буфером. Последующий ступенчатый градиент концентрации спирта позволил получить несколько фракций, среди которых одна обладала искомой активностью.
Рисунок 31 отражает все основные стадии разделения экстракта морской анемоны Н. crispa: вышеупомянутая гидрофобная хроматография, два этапа ионообменной хроматографии на колонках Bio-Rex 70 и SP-Sephadex С-25 в буферных растворах с нейтральным значением рН и, наконец, ВЭЖХ активной фракции на обращено-фазной колонке Jupiter С5. После каждого этапа разделения проводили измерение влияния получаемых фракций на проводимость TRPV1.
Итогом многостадийного разделения стало выделение двух индивидуальных компонентов с очень близкими молекулярными массами. Полипептидные токсины были названы АРНС1 это наиболее представленный компонент с массой 6187 Да (первый элюируемый на обращено-фазном сорбенте) и АРНС2 - слабо-представленный токсин с массой 6185
Похожие диссертации на Новые подходы к изучению структурно-функционального разнообразия полипептидных токсинов
-
-
-
-
-
-
-
-
