Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы 9-40
2.1 Использование масс-спектрометрии при изучении белков 9
2.2 Основы MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов 13
2.2.1 MALDI - получение газофазных ионов биополимеров 14
2.2.2 Фрагментация пептидов, индуцированная MALDI 20
2.2.3 Изучение природных модификаций белков 23
2.2.4 Времяпролетная система разделения ионов и их детекция 25
2.2.5 Разрешение и точность MALDI-времяпролетных масс-спектрометров 27
2.2.6 Получение масс-спектров фрагментации 28
2.3 Белок оболочки X вируса картофеля 31
2.3.1 Строение белка оболочки X вируса картофеля 31
2.3.2 Возможные модификации белка оболочки X вируса картофеля 33
2.4 Гемагглютинин вируса гриппа типа А 35
2.4.1 Строение вирусных частиц гриппа типа А 35
2.4.2 Строение гемагглютинина и его участие в слияниис клеткой хозяина. 37
2.4.3 Ацилирование С-концевого участка гемагглютинина жирными кислотами и возможная роль этой модификации белка 38
3. Экспериментальная часть 41-47
3.1 Препараты X вируса картофеля 41
3.2 Препараты вируса гриппа типа А 43
3.3 Модельные пептиды 45
3.4 Масс-спектрометрия 46
4. Результаты и их обсуждение 48-84
4.1 Масс-спектрометрическое определение положения углеводных остатков в белке оболочки Х-вируса картофеля, штамм UK3, и его мутанта 48
4.1.1 Определение возможных модификаций белка оболочки 48
4.1.2 Определение точного положения сахарных остатков 56
4.2 Изучение ацилирования цистеинов С-концевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами 62
4.2.1 Выделение и идентификация С-концевых фрагментов 63
4.2.2 Изучение лабильности тиоэфирной связи под действием восстанавливающих агентов 70
4.2.3 Определение соотношения количеств пальмитиновых и стеариновых остатков в С-концевой области гемагглютининов разных штаммов 77
4.2.4 Изучение направленности ацилирования трех цистеиновых остатков С-концевой области гемагглютинина разными жирными кислотами 78
Выводы 85
- Основы MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов
- Белок оболочки X вируса картофеля
- Препараты вируса гриппа типа А
- Изучение ацилирования цистеинов С-концевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Модификация белков в биологических системах приводит к изменению их физико-химических свойств, конформации, стабильности, биологической активности. Такие посттрансляционные модификации, как гликозилирование, фосфорилирование, присоединение остатков жирных кислот являются не только наиболее распостраненными, но и функционально важными для обретения белковой молекулой новых свойств, влияющих на их биологическую функцию.
В последние десятилетия были достигнуты впечатляющие успехи в разработке физико-химических подходов к выявлению посттрансляционных модификаций белков, среди которых наиболее важное место заняли методы масс-спектрометрического анализа. С появлением способов получать ионы белков и пептидов, не разрушая их, и измерять их точные массы, появилась возможность судить об их модификациях по расхождению значений расчитанных и измеренных масс. Одним из таких способов ионизации является MALDI - лазерная десорбция/ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы.
При исследовании структуры белка обычно прибегают к получению масс-спектрометрической пептидной карты - определению набора значений масс пептидов после проведения высокоспецифического гидролиза белка - химического или ферментативного («MS-peptide fingerprint»). Помимо получения значений масс целых молекул в сложных смесях, масс-спектрометрия предоставляет и возможность получения спектров фрагментации отдельных пептидов, происходящей непосредственно в масс-спектрометре. Как MS-пептидный фингерпринт характеристичен для данной молекулы белка, так и спектр фрагментации характеристичен для пептида. Получение пептидных карт белка и/или спектров фрагментации отдельных пептидов позволяет подтвердить первичную структуру, выявить посттрансляционные модификации, включая природу заместителей и места их ковалентного связывания.
В ряде случаев, при получении спектров фрагментации оказывается, что энергия связи модифицирующей группы с пептидом низка, поэтому её разрушение происходит наиболее интенсивно и приводит к потере информации об исходной локализации данной группы. Так, например, при определении точек гликозилирования неустойчивость гликозидных связей в условиях ионизации ведет к первоочередному отщеплению сахара от исследуемого пептида. Поэтому для правильной интерпретации масс-спектров необходимо правильно оценивать устойчивость ковалентной связи модифицирующей группы с пептидом и в случае её низкой устойчивости искать комплементарные подходы к установлению точки модификации.
Вследствие разной способности у разных пептидов сокристаллизоваться с матрицей (при использовании метода MALDI), а также образовывать газофазные ионы, масс-спектрометрию нельзя отнести к количественным методам физико-химического анализа. Поэтому, при изучении степени модифицированности белка требуется либо применение специальных методов пробоподготовки, либо параллельное использование других методов (хроматография, электрофорез etc.).
В данной работе при помощи MALDI-времяпролетной-масс-спектрометрии (MALDIOF) исследованы два типа природных модификаций - О-гликозилирование остатков серина и треонина и ацилирование жирными кислотами SH-групп цистеиновых остатков природных белков.
Первая часть работы направлена на определение модификаций белка оболочки X вируса картофеля - представителя группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Роль белка оболочки не ограничивается формированием защитного белкового чехла. Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение резистентности растения картофеля к заражению, значим для регуляции трансляции на разных стадиях инфекции. Факт О-гликозилирования белка оболочки был установлен в 1994 году, но до последнего времени не были изучены ни тип Сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования белка, ни их возможная значимость. Это делает углубленный анализ этой модификации белка оболочки безусловно актуальным.
Во второй части работы изучались модификации С-концевого участка малой субъединицы гемагглютинина вируса гриппа А. Гемагглютинин - гликозилированный поверхностный белок вируса. Он представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из двух цепей, связанных между собой дисульфидным мостиком. Легкая цепь заякорена в мембрану своим С-концевым участком. Основные исследования структурных и функциональных особенностей гемагглютинина связаны с изучением его эктодоменов. Для ряда штаммов получены рентгеноструктурные данные, проливающие свет на пространственную организацию экспонированной на поверхность части белка. В то же время, практически отсутствуют данные о структуре заякоренного в оболочке вириона С-концевого гидрофобного пептида. На сегодня опубликована единственная работа на искусственно синтезированном пептиде, встроенном в липосому, направленная на выяснение его свойств и структуры. Фрагмент гемагглютинина, остающийся в вирусной мембране после обработки вириона протеазой бромелаином, содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок. В нём присутствуют три консервативных цистеиновых остатка, которые способны к ацилированию высшими жирными кислотами. Исследование типа и степени ацилирования представляется очень важным, так как остатки жирных кислот могут служить для ориентации трансмембранных доменов в липидном бислое, способствовать тримеризации гемагглютинина, участвовать в образовании пор слияния в процессе инфицирования клетки-хозяина или во взаимодействии гемагглютинина с внутренными вирусными белками.
Цель и задачи исследования.
Работа посвящена отработке методов применения MALDIOF для изучения двух из распостраненных модификаций природных белков - О-гликозилирования и ацилирования цистеиновых остатков высшими жирными кислотами. С этой целью были сформулированны следующие задачи:
1 исследовать возможные посттрансляционные модификации белка оболочки природного штамма UK3 Х-вируса картофеля, являющегося типичным представителем группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Для этого: получить и проанализировать пептидные карты белка, определить степень гликозилирования и тип присоединенных сахарных остатков, разработать подходы к точному установлению сайтов гликозилирования.
2 исследовать структуру и характер ацилирования высшими жирными кислотами цистеинов С-концевого фрагмента лёгкой цепи гемагглютинина трёх штаммов вируса гриппа A: A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для этого: выделить и идентифицировать С-концевые пептиды, определить степень ацилирования трех консервативных цистеиновых остатков этой области белка и тип присоединяемых жирнокислотных остатков, изучить стабильность тиоэфирной связи в условиях получения масс-спектров и в присутствии восстанавливающих агентов в процессе выделения белка.
Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые
выносятся на защиту:
1 Впервые с использованием масс-спектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK.3 и его ST-мутанта, у которого все остатки серина и треонина N-концевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Для них:
- установлено, что модификации сосредоточены только в N-концевой области белка и заключаются в его N-ацетилировании у обоих штаммов, а также О-гликозилировании белка оболочки природного штамма. С точностью, определяемой использованными методами, показано, что выявленные модификации характерны для всех молекул белка оболочки вирусных частиц;
- впервые установлен тип и локализация присоединяемых сахарных остатков. Показано, что единственный остаток моносахарида - галактозы или фукозы — присоединяется только к ацетилированному остатку серина в первом положении аминокислотной последовательности белка оболочки X вируса картофеля штамма UK3;
2 Выделены и методами масс-спектрометрии охарактеризованы С-концевые пептиды легкой цепи гемагтлютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34. Для них:
- впервые продемонстрировано практически полное ацилирование трех консервативных цистеиновых остатков внутривирионного участка белка остатками жирных кислот;
- впервые установлена возможность модификации гемагтлютинина вируса гриппа типа А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов.
- впервые показана неравноценность трех указанных цистеиновых остатков по отношению к ацилированию разными жирными кислотами. Для штамма A/FPV/Weybridge/34 установлено преимущественное присоединение остатка стеариновой кислоты к цистеину, наиболее приближенному к трансмембранному домену белка.
Практическая значимость работы заключается в разработке методологических подходов к изучению неустойчивых при проведении масс-спектрометрического анализа модификаций белков, в разработке способов выделения и MS-детекции трансмембранных пептидов. В ходе исследования также показана достаточная для получения масс-спектров фрагментации устойчивость тиоэфирной связи и исследована лабильность этой связи под действием известных восстанавливающих агентов.
Публикации и апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в 11 работах, в том числе в 5 статьях в отечественных и зарубежных научных журналах, и в тезисах 6 докладов на международных и всероссийских научных конференциях.
Результаты работы доложены на 3"° международном пептидном симпозиуме (Прага, Чехия, сентябрь 2004), на 2"°м международном семинаре-школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, октябрь 2004), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, октябрь 2004), на I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, ноябрь 2003; Санкт-Петербург, май 2005) и на 19"°м Американском пептидном симпозиуме (Сан-Диего, США, июнь 2005).
Вклад автора в разработку проблемы.
Автором проведены все исследования данных вирусных белков в части применения MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, в том числе получения и интерпретации спектров фрагментации. Предложены оригинальные схемы проведения экспериментов для получения масс-спектрометрических результатов. Установлена точка гликозилирования белка оболочки Х-вируса картофеля. Идентифицированы С-концевые фрагменты легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А трех штаммов и определена степень их ацилирования жирными кислотами, получены соотношения пальмитатов и стеаратов, установлена направленность ацилирования трех цистеиновых остатков внутривирионного участка гамагглютинина разными жирнокислотными остатками. Изучены условия разрушения тиоэфирной связи в присутствии восстанавливающих агентов.
Работа выполнена в отделе хроматографии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН и в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН.
Объем и структура работы.
Диссертационная работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 37 рисунков и 2 приложения. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы, содержащего 121 ссылку.
Основы MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов
Масс-спектрометрия - это определение масс заряженных частиц по их поведению в электрических и/или магнитных полях. Поскольку результат действия всех электромагнитных сил пропорционален заряду и обратно пропорционален массе ионов, то измеряемой величиной в масс-спектрометрии является отношение масса иона/заряд (m/z). В зависимости от способа получения газофазных ионов могут образовываться ионы, несущие на себе разное количество зарядов, а в зависимости от природы анализируемого вещества - разные типы ионов. Если рассматривать положительно заряженные ионы, то наиболее часто встречается два типа: ионы, полученные образованием нековатентного комплекса нейтральной молекулы с катионом (Н , Na+, К ), и полученные отрывом от нейтральной молекулы электрона. В подавляющем числе случаев, при описываемом здесь способе получения ионов белков и пептидов - MALDI, заряд привносится присоединением одного протона. При этом регистрируемая масса иона [МН]+=М+1. Индивидуальность белка (пептида) определяется его первичной структурой, и его масса может быть легко расчитана (см. Приложение 1). При этом надо иметь в виду, что в природе представлены разные изотопы элементов, входящих в состав аминокислот. Так 1.1% всего углерода представлен изотопом С, 4.2% всей серы - изотопом S. При синтезе любого пептида (белка) в его состав с некоторой вероятностью включается один или несколько изотопов 13С , а в случае серосодержащих пептидов - 34S , что приводит к увеличению моноизотопной массы пептида на один или несколько Да. Моноизотопная масса пептида - это масса пептида, имеющего в составе только самые легкие изотопы элементов: Н, 2С, 14N, ,60 и 32S. Вероятность включения в пептид ,3С и 34S растет с увеличением общего числа атомов углерода и серы в его составе. На рис.2.1 приведена эмуляция масс-спектра однозарядных ионов пептидов разных масс. Поскольку на масс-спектрах регистрируется сигнал от огромного числа ионов определенного пептида (10 -10 шт), и каждый ион может иметь разный изотопный состав, то речь идет о наблюдении среднего естественного изотопного распределения. В молекуле пептида (белка) массой более 5000 Да вероятность включения в состав только лишь атомов Си S становится очень мала, и детектировать моноизотопный пик невозможно. В таком случае речь идет об измерении средней массы. Измерение средних масс проводится и в том случае, когда разрешение прибора не позволяет наблюдать изотопное распределение. Вид масс-спектра во многом определяется типом прибора, на котором он получен: степенью заряженности детектируемых ионов, диапазоном измеряемых масс, разрешающей способностью масс-спектрометра.
Прибор, использованный для описанных в данной работе экспериметов, содержит MALDI источник ионов, времяпролетную схему разделения и микроканальные пластины для детекции ионов. 2.2.1 MALDI - получение газофазных ионов биополимеров. В источнике ионов генерируются газофазные ионы изучаемых молекул. При исследовании биополимеров (в том числе белков и пептидов) как правило не возникает проблем с получением заряженных частиц, поскольку они легко протонируются в слабокислых условиях. Трудности возникают при переведении ионов тяжелых молекул в газовую фазу, не разрушая их. Разработанные для классической масс-спектометрии методы ионизации не позволяли этого сделать. И только в 1980-х годах были разработаны два способа, позволяющие переводить в газовую фазу ионы биополимеров без их деструкции: ESI и MALDI [16]. MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization) - лазерная десорбция с одновременной ионизацией в присутствии вспомогательного вещества - матрицы. По сути, MALDI является соиспарением анализируемого вещества с матрицей. Сокристаллизованная с исследуемым веществом матрица поглощает энергию лазерного излучения, испаряется и способствует вовлечению анализируемых ионов в газовую фазу. При приготовлении образца анализируемое вещество смешивается с раствором специально подобранного низкомолекулярного органического вещества (матрицы), и смесь высушивается на проводящей масс-спектрометрической подложке. Образуются кристаллоиды матрицы, содержащие вкрапленные ионы аналита. Для правильной сокристаллизации концентрация матричного раствора (10" -10" М) должна сильно превосходить концентрацию раствора анализируемых веществ (10 -10"8 М) и возможных примесей - солей, остатков детергента и т.д. Эффективность MALDI сильно зависит от химической чистоты анализируемого вещества и способа приготовления пробы [17]. Надо отметить, что в ряде случаев присутствие в пробе небольших количеств примесей способствует лучшей ионизации аналита [18,19]. Затем подложка помещается в масс-спектрометр в область высокого вакуума, где на нее подается высокое напряжение той же полярности, что и анализируемые ионы. Под действием точечного кратковременного (2-5x10 9 сек) мощного лазерного импульса происходит локальное испарение (абляция) молекул матрицы, поглотивших энергию излучения лазера. В процессе абляции матрицы сокристаллизованные с ней молекулы анализируемого вещества увлекаются в газовую фазу. Предполагается, что с поверхности кристалла изначально вырываются не индивидуальные ионы, а довольно крупные кластеры матрицы и анализируемого вещества, которые в дальнейшем, в результате столкновений, диссоциируют на отдельные молекулы и ионы.
При получении масс-спектров белков и пептидов наиболее часто используется режим детекции положительно заряженных ионов, и именно этот случай будет рассматривала в дальнейшем. Некоторая часть исследуемого вещества акцептировала протон или другой катион еще на стадии сокристаллизации. Другая часть может приобрести заряд в процессе перехода в газовую фазу. Несущие на себе заряд молекулы (ионы) выталкиваются полем кристаллоиде точки облучения лазером вид масс-спектров может заметно меняться. Таким образом, оценки взаимных количеств в смеси схожих по способности к ионизации соединений возможны только при достижении идентичности их сокристаллизации с матрицей. Эта ситуация достижима только для изотопно меченных аналогов исследуемых веществ, которые практически не отличаются по своим физико-химическим свойствам. В настоящее время активно разрабатываются подходы с использованием изотопного мечения для получения количественной информации о содержании в аналите искомого соединения по данным масс-спектрометрии [21-23]. Важно отметить, что при MALDI образуется ограниченный во времени пакет ионов (лазерный импульс), и это определяет успешное сочетание данного способа ионизации с времяпролетной схемой разделения ионов в приборе. MALDI позволяет получать газофазные ионы массой до 200000 Да. Однако в области низких масс (примерно до 500 Да), в спектрах, затрудняя интерпретацию, присутствуют пики матричного вещества, его кластеров и продуктов деградации. Для ионизации могут быть использованы лазеры с разными длинами волн, в диапазоне от инфракрасного до ультрафиолетового. В зависимости от типа лазера подбираются матричные соединения, способные к активному поглощению данного излучения. Прибор, на котором выполнялась работа оснащен азотным лазером с длиной волны 337 нм. Матрицы, применяемые в сочетании с этими лазерами, практически все являются легкоокисляемыми ароматическими соединениями, содержащими гидроксильные функции. Для получения газофазных ионов пептидов (в случае использования ультрафиолетовых лазеров) в качестве матрицы наиболее часто применяют 2,5-дигидроксибензойную и а-циано-4-гидроксикоричную кислоты. При масс-спектрометрии белков - 3,5-диметокси-4-гидроксикоричную кислоту. Для получения масс-спектров модифицированных пептидов (в частности, гликопептидов) и олигонуклиотидов иногда используют 2,4,6-тригидроксиацетофенон (рис.2.3).
Белок оболочки X вируса картофеля
Роль белка оболочки ХВК не ограничивается формированием защитного белкового чехла. Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение резистентности растений картофеля к заражению и участвует в регуляции процесса трансляции на разных стадиях инфекции [63,64]. В момент заражения растения вирусом инфицированными оказывается незначительное число клеток, Для распостранения инфекции необходим межклеточный транспорт, который является активным процессом, осуществляется через плазмодесми и требует участия транспортных белков вируса. Вирусная РНК перемещается из зараженной клетки в соседние здоровые в составе транспортной формы. Роль транспортной формы потексвирусов выполняют либо зрелые вирусные частицы [65,66], либо комплекс РНК с белком оболочки и одним из трех транспортных белков (ТБ1) [67]. Было показано, что РНК X вируса картофеля в составе вирусных частиц является нетранслируемой in vitro, но приобретает способность транслироваться в результате взаимодействия с ТБ1 либо фосфорилирования БО [68]. Была предложена модель, согласно которой в инфицированной клетке растения БО ХВК фосфорилируется киназами клетки-хозяина и вирусная РНК становится доступной для трансляции. Затем в цикле размножения РНК одевается в чехол из новых субъединиц БО, временно исключается из процессов трансляции и направляется к плазмодесмам для перемещения в соседние клетки. Здесь надо отметить, что факт фосфорилирования БО ХВК in vivo никем отмечен не был. Тем не менее, приведенные выше данные предполагают серьезное влияние пространственной организации белка оболочки и наличия его возможных модификаций на жизнеспособность вируса. Согласно нуклеотидной последовательности молекула белка оболочки X вируса картофеля природного штамма UK.3 состоит из 236 аминокислотных остатков. Было показано, что N-конец белка ацетилирован [69]. Также было отмечено, что при проведении электрофореза в денатурирующих условиях наблюдается аномально замедленная подвижность белка по сравнению с ожидаемой, исходя из его первичной структуры [63]. Замедленная подвижность при проведении денатурирующего электрофореза часто бывает связана с наличием в белке таких посттрансляционных модификаций как гликозилирование, и факт О-гликозилирования БО ХВК в 1994 году был установлен [70]. Обе концевые области белка оболчки ХВК богаты потенциальными сайтами О-гликозилирования и фосфорилирования - остатками серина и треонина, но поверхностная локализация N-концевой области белка в вирусной частице позволяет предположить, что возможные модификации могут находиться именно в ней.
Предпринимались попытки исследования N-концевой части БО путем последовательного отщепления аминокислотных остатков по Эдману, которые по причине ацетилирования N-конца оканчивались неудачей. Таким образом, до настоящего времени не были изучены ни тип Сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования этого белка. Для выяснения важности поверхностно локализованной N-концевой области БО ХВК в сохранении морфологической целостности и физико-химических свойств поверхности интактных вирионов с помощью мутагенеза in vitro был получен мутант природного штамма UK3 (ST-мутант), в белке оболочки которого все потенциальные сайты О-гликозилирования и фосфорилирования N-концевого участка, остатки серина и треонина, заменены на остатки глицина или аланина [71]: SAPASTTQPIGSTTSTTTKT.. - AAPAGGAQPIGAGGAAGAKA.. UK3 ST-мутант Вопреки ожиданиям, ST-мутантный штамм оказался инфекционным. Кроме того, в отличие от природного штамма UK3, его РНК в составе вирусных частиц проявляет способность транслироваться in vitro в отсутствие активации транспортным белком ТБ1 или фосфорилированием. Вероятно внесенные аминокислотные замены приводят к некоторым изменениям в пространственной организации белка оболочки в составе вириона, делая доступной рибосомам 5 -концевую область РНК. Изменения могут быть схожи с теми, что происходят с БО природного штамма при фосфорилирофании in vitro. Эти данные дополнительно указывают на важность изучения структурных особенностей белка оболочки как природного штамма так и его ST-мутанта, особенно их N-концевой области. Интерес представляет определение всех возможных модификаций этих белков, но в первую очередь выяснение типа, точного положения углеводных остатков, степени гликозилирования белка оболочки ХВК. Развитие масс-спектрометрических методов делает возможным проведения такого исследования. 2.4 Гемагглютинин вируса гриппа типа А. 2.4.1 Строение частиц вируса гриппа типа А. К группе оболочечных вирусов относятся различные семейства вирусов, многие представители которых являются опасными патогенами. Их объединяет наличие липопротеиновой оболочки вокруг вирусного генома. Оболочка состоит из липидного компонента мембраны клетки-хозяина и вирус-специфичных белков, а в некоторых случаях в состав вирусной оболочки входит рад клеточных белков. Вирусные частицы приобретают оболочку на поздней стадии сборки вирионов, которая называется «выпочковыванием» [72]. К наиболее изученным в структурном отношении относится вирион вируса гриппа, типичный представитель семейства Orthomixoviridae.
Грипп является серьезной массовой и неуправляемой инфекцией, которая ежегодно регистрируется в различных частях земного шара. Различают три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирус гриппа типа А представляет наибольшую угрозу здоровью населения. В зависимости от строения антигенных детерминант основных поверхностных гликопротеинов вируса гриппа типа А - гемегглютинина и нейраминидазы, его относят к разным подтипам. Пандемии XX века были вызваны штаммами вируса гриппа типа А подтипов H1N1 (1918), H2N2 (1957) и H3N2 (1968) [73]. Деление на подтипы носит несколько условный характер. Так, выделяют более 15 подтипов гемагтлютинина вируса гриппа типа А, которые по сути относятся к двум крупным подсемействам [74]. Геном вируса гриппа А сегментирован; он состоит из восьми фрагментов однонитевой (-) РНК, кодирующей 10 полипептидов [75,76]. Девять из этих полипептидов входят в состав вирионов. Три полипептида встроены в липидную оболочку: гемагглютинин (НА), присутствующий в количестве 500-1000 копий/вирион; нейраминидаза (NA, 100-500 копий/вирион); и минорный белок М2 (14-68 копий/вирион) [77,78]. Все три полипептида оболочки являются трансмембранными белками. В то же время существует мнение, что жирнокислотные остатки могут также служить для ориентации трансмембранных доменов в липидном бислое и способствовать тримеризации гемагглютинина или участвовать во взаимодействии гемагглютинина с внутренними вирусными белками (прилегающим к вирусной оболочке изнутри матриксным белком Ml). Такие выводы, в частности, были основаны на сравнении типов жирнокислотных остатков модифицирующих функционально схожие белки вирусов гриппа типов А и С. Гемагглютинин вируса гриппа А, имеющий более длинный внутренний участок с тремя цистеиновыми остатками, содержит пальмитаты, в то время как гемагтлютинин-эстераза вируса гриппа типа С, имеющий единственный цистеин на более коротком хвосте, - стеараты [107]. Для верной оценки значимости ацилирования указанных цистеиновых остатков в жизнеспособности вирусов гриппа типа А разных подтипов, необходимо в первую очередь располагать структурными данными - знать степень ацилирования и распределение модифицирующих остатков. Тем не менее, характер ацилирования жирными кислотами цистеиновых остатков С-концевой области легкой цепи гемагтлютининов разных подтипов остается мало изученным. Наличие пальмитатов в С-концевой области гемагглютинина определялось только после выращивания вирусных частиц в присутствии радиоактивно-меченной пальмитиновой кислоты. Такой подход позволяет узнать лишь общее количество связавшихся с гемагглютинином радиоактивных пальмитиновых остатков, не позволяя получить информацию о распределении пальмитатов среди трех цистеиновых остатков и степени ацилирования. Разработка подходов к выделению и последующему масс-спектрометрическому анализу С-концевых пептидов легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А разных подтипов призвана помочь в решении этой проблемы.
Препараты вируса гриппа типа А
Гидролиз карбоксипептидазой Y [110] N-концевого триптического пептида БО ХВК и его фрагментов проводили следующим образом: растворы пептидов, полученные с помощью ВЭЖХ, высушивали для удаления ТФУ и перерастворяли в воде до концентрации около 0.1 мгхмл"1, к этому раствору добавляли карбоксипептидазу Y в соотношении фермент/субстрат 1:5 (по массе). Гидролиз проводили при 22С. Для получения MALDI-масс-спектров отбирали по 0.5 мкл раствора через 15, 30, 45, 60 мин от начала гидролиза. Препараты вируса гриппа типа А были нам любезно предоставлены В.Т. Ивановой (штамм Х-31, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) и С.Г. Маркушиным (штаммы Puerto Rico/8/34 и FPV/Weybridge/34, ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН). Вирус нарабатывался в аллантоисной жидкости 10-дневных куриных эмбрионов по стандартной методике [111]. Аллантоисная жидкость осветлялась низкоскоростным центрифугированием (2000-5000g, 30 мин), затем вирус из суспензии осаждали ультрацентрифугированием при 4С в течении 3 часов при 14 000 обУмин. с использованием ротора Beckman JA14 (штаммы Puerto Rico/8/34 и FPV/Weybridge/34) либо в течении 1 часа при 25 000 обУмин. с использованием ротора ТІ35 (штамм Х-31). Вирусные препараты ресуспендировали и очищали ультрацентрифугированием через 20%-ную сахарозную подушку в STE-буфере (ЮмМ Tris-HCl, 0.1М NaCl, ІмМ ЭДТА, рН 7.4) в течении 2.5 часов при 25000 обУмин. с использованием ротора SW28 при 4С. Для удаления сахарозы проводили повторное осаждение в течении 1 часа при 25 000 обУмин. с использованием ротора ТІ35. Вирусные частицы ресуспендировали в STE-буфере и их количество оценивали измерением концентрации белка по методу Петерсона [112], которая составляла 2-5 мг/мл, и хранили при +4С. Получение субвирусных частиц. Субвирусные частицы получали добавлением к суспендии вирусных частиц бромелаина в соотношении фермент/субстрат 1:1 (по массе). Гидролиз проводили в течение 15-18 часов при 37С в присутствии 50 мМ Р-меркатпоэтанола [92] либо без добавления Р-меркаптоэтанола. Для удаления бромелаина и эктодоменов мембранных вирусных белков субвирусные частицы осаждали ультрацентрифугированием через 20%-ную сахарозную подушку в STE-буфере в течение 1 часа при 30 000 об./мин. с использованием ротора SW50.1 при 4С. Для электронной микроскопии растворы вирусных и субвирусных частиц наносили на сетки для электронной микроскопии (Sigma), покрытые формваром, в качестве контрастирующего вещества использовали 2%-ый водный раствор фосфорновольфрамовой кислоты, рН 7.0, не проникающий внутрь липидной капсулы вируса.
Препараты анализировали на электронном микроскопе (Hitachi HU-1 IB, Япония, увеличение 30 000). Разделение компонент субвирусных частиц экстракцией по Фолчу [113]. К суспензии субвирусных частиц в STE-буфере (0.2 мкл) добавляли 0.6 мл смеси хлороформ: метанол (2:1). После тщательного перемешивания (ЗОмин при комнатной температуре) проводили центрифугирование в течение 5 мин. при 3000 об./мин. (Beckman Coulter Microfuge 18). Отдельно отбирали верхнюю (водно-метанольную), нижнюю (органическую) фазы и интерфазу (белковую прослойку на границе раздела фаз). Для получения масс-спектров к хлороформ-метанольному экстракту пептидов, добавляли равный объем раствора: 0.1М NH4HCO3, 25мМ n-октилглюкопиранозид в 50% водном ацетонитриле (рН 7.5). Гидролиз трипсином частично деацилированного С-концевого пептида гемагглютинина из штамма A/FPV/Weybridge/34 проводили так: органический экстракт пептидов (Юмкл) высушивали и растворяли (растворение проходит не полностью) в Юмкл 30% водного ацетонитрила, содержащего 0.1М NH4HCO3, 25мМ п-октилглюкопиранозид, 5мМ дитиотреит (рН 7.5). Добавляли 1 мкг трипсина (Promega) и инкубировали в течении 15 минут при 37С. По окончании гидролиза 1мкл реакционной смеси использовали для получения масс-спектра. Частичное удаление липидов из огранической фазы достигалось их экстракцией этиловым эфиром. Органическую фазу (хлороформ) упаривали, добавляли эфир (100-200 мкл), интенсивно перемешивали (Юмин при комнатной температуре) и проводили центрифугирование в течение 5 мин. при 3000 об./мин. (Beckman Coulter Microfuge 18). Супернатант (эфир) удаляли, а осадок ресуспендировали в смеси хлороформгметанол (2:1) и использовали для дальнейших анализов. Секвенирование по Эдману пептидов было любезно проведено для нас Т.В. Овчинниковой (ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН). Для секвенирования пептидов из частично делипидизированной огранической фракции от разделения компонент субвируных частиц был использован автоматический секвенатор Precise cLC Protein Sequencing System 491 (Applied Biosystems, США). Деацилирование С-концевых пептидов гемагглютинина под действием дитиотреита проводили следующим образом. К 20мкл хлороформной (органической) фазы после проведения экстракции по Фолчу, добавляли равный объем раствора: 0.1 М NH4HCO3,25мМ п-октилглюкопиранозид, ЮмМ дитиотреит в 50% водном ацетонитриле (рН 7.5). Реакцию проводили при 50С в течение 2 часов. Через каждые 10-15 мин аликвоты (по 2 мкл) реакционной смеси отбирались для проведения масс-спектрометрического анализа.
Модификация синтетического пептида YGPVFMCL. Лиофилизованный пептид любезно предоставлен М.Н. Жмаком (ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН). 0.5 мг пептида растворили в 1 мл 50 мМ ЫаНСОз (рН 9.5) и добавили уксусный ангидрид до 30 мМ концентрации. Реакцию вели 10 мин при 20С. Дважды ацетилированный пептид (acYGPVFMacCL) выделен ВЭЖХ и использован для изучения реакции деацетилирования цистеинового остатка. После полного удаления одного остатка уксусной кислоты образовавшийся пептид ас YGPVFMCL выделили ВЭЖХ, упарили и растворили в 50 мМ NaHC03 (рН 9.5). Конечная концентрация пептида - 0.2 мг/мл. К раствору добавили янтарный ангидрид до 30 мМ концентрации. Реакцию также вели 10 мин при 20С. По окончании реакции модифицированный по остатку цистеина остатком янтарной кислоты пептид (acYGPVFMsucCL) был снова выделен ВЭЖХ и использован для получения кинетики разрушения тиоэфирной связи в присутствии восстанавливающего агента. Реакцию удаления модифицирующих групп с цистеиновых остатков модельных пептидов проводили при добавлении дитиотреита. Модельные пептиды - acYGPVFMacCL и acYGPVFMsucCL - были высушены и перерастворены в 50мМ NH4HCO3 (рН 7.5); концентрация пептидов - 0.2 мг/мл. Дважды пальмитированный пептид palMWApalCQRG (любезно предоставлен Б.В. Васьковским, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) растворяли в 50мМ NH4HCO3, 25мМ n-октилглюкопиранозид в 50% водном ацетонитриле (рН 7.5). Растворение прошло не полностью. Для анализов использовали надосадочный раствор после осаждения нерастворенной части центрифугированием. Концентрация пептида составляла около 0.1 мг/мл. К расворам пептидов добавили дитиотреит до конечной концентрации 10 мМ. Реакцию проводили при 20С в течение 15 мин. Аликвоты реакционной смеси (по 1 мкл) отбирали через 1,2,5,10 и 15 минут для получения масс-спектров. Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на стальной масс-спектрометрической подложке (мишени) смешивали по 0.5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, 10 мгхмл" в 30 % ацетонитриле в воде с 0.5 % ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетных масс-спектрометрах Ultraflex и Reflex Ш (Bruker Daltonics, Германия), оснащенных азотным УФ лазером (Х=337нм). Частота регистрации сигнала в обоих приборах составляет 2 ГГц. Каждый масс-спектр получен суммированием от более 200 лазерных импульсов. Масс-спектры материала хроматографических фракций БО ХВК, гидролизатов после обработки карбоксипептидазой Y фракций 1 и 2 , а также модельных пептидов получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона и задержки экстракции ионов на приборе Reflex III. Подаваемое на мишень напряжение составляет +25 кВ, отпирающее напряжение на первой линзе +20 кВ, время задержки экстракции 200нс, отражающее напряжение на рефлектроне - +28.7 кВ. Погрешность измеренных масс не превышает 0.02 %.
Изучение ацилирования цистеинов С-концевой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов A/Puerto Rico/8/34, А/Х-31 и A/FPV/Weybridge/34 жирными кислотами
В одно время с описаным выше анализом мест гликозилирования белка оболочки X вируса картофеля нами проводилось исследование структуры и характера ацилирования жирными кислотами С-концевой области легкой цепи гемагглютинина трех подтипов вируса гриппа типа A: HI - штамм гриппа человека A/Puerto Rico/8/34, НЗ - лабораторный штамм гриппа человека А/Х-31 и Н7 - штамм птичьей чумы A/FPV/Weybridge/34. В данном случае, интересовавший нас участок белка находится не на поверхности вирусной частицы, а внутри липидной капсулы вируса. Участок содержит три остатка цистеина, способных к образованию тиоэфирной связи. Для исследования в первую очередь было необходимо получить С-концевой фрагмент белка, содержащий модификации. Известно, что в результате обработки вирионов ферментом бромелаином удаляются эктодомены белков оболочки, и образуются С-концевые пептиды легкой цепи гемагглютинина, которые остаются в вирусной мембране и включают трансмембранный домен и внутривирионный участок [92]. Эти пептиды надлежало выделить и провести их масс-спектрометрический анализ. Общая схема проведения эксперимента, которая формировалась по мере получения экспериментальных данных, выглядела следующим образом: 1. С-концевые участки легкой цепи гемагглютинина трех штаммов были выделены и соотнесены с пиками на масс-спектрах. Показано, что цистеиновые остатки этой области могут быть ацилированы двумя типами жирных кислот - пальмитиновой и стеариновой. Отметим, что ранее в литературе для вируса гриппа типа А было показано ацилирование гемагглютинина только одной из них - пальмитиновой. 2. В процессе выделения пептидов нами было отмечено расщепление тиоэфирной связи под действием SH- восстанавливающих агентов, связанное, очевидно, с переносом ацильной группы на реагент. Таким образом, для разработки адекватной процедуры выделения целевых пептидов в химически не изменённом виде необходимо было более детально исследовать эту реакцию. В конечном счете мы отказались от применения SH-содержащих реагентов на протяжении всей процедуры работы с исследуемым материалом. После осаждения центрифугированием субвирусных частиц проводилось разделение их компонентов в системе хлороформ/метанол/вода - экстракция по Фолчу. Когда происходит расслоение на водно-метанольную и органическую фазы, белки, как правило, осаждаются на границе раздела.
В водно-метанольной фазе оказываются гидрофильные пептиды и часть небольших водорастворимых белков; очень гидрофобные компоненты (в основном липиды) экстрагируются в органическую фазу. Был проведен масс-спектрометрический анализ всех фаз, но только на масс-спектрах органической фазы присутствовала серия пиков, по расчету соответствовавших С-концевым фрагментам гемагглютинина, если принять условие неполного ацилирования трех цистеинов остатками пальмитиновой либо стеариновой кислот (рис. 4.11, Табл. 4.3). Наряду с серией пиков С-концевых участков гемагглютинина в спектрах органического экстракта присутствовали пики липидов вирусных мембран и N-концевых трансмембранных фрагментов белка нейраминидазы. Из данной таблицы следует сделать три вывода: 1 Цистеиновые остатки могут быть модифицированы двумя типами жирных кислот - пальмитиновой и стеариновой. Любопытно, что ранее для гемагглютинина вируса гриппа типа А факт ацилированйя остатками стеариновой кислоты не отмечался. 1 Наблюдается гетерогенность по степени ацилированйя. 2 Помимо пиков пептидов, образованных действием бромелаина по известному сайту, в спектре наблюдаются пики фрагментов, образованных действием трипсиноподобных протеаз (см. рис. 4.10), причем их интенсивность свидетельствует о более эффективном гидролизе гемагглютинина именно по триптическим сайтам. Такая активность может присутствовать в протеазном наборе бромелаина. С другой стороны, трипсиноподобные протеазы в большом количестве присутствуют в среде выращивания вируса - аллантоисе; они участвуют в процессинге гемагглютинина (разделяют белок-предшественник на легкую и тяжелую цепи) и могут совыделяться с вирусными частицами. Предположительно, мы наблюдаем действие именно этих протеаз, так как даже без проведения гидролиза бромелаином на масс-спектрах органического экстракта целых вирусов иногда регистрируются пики соответствующих пептидов. Выводы о природе пиков на масс-спектре основывались пока только на совпадении их значений с теоретическими, и потребовались дополнительные экспериментальные данные, подтверждающие это утверждение. С этой целью, на тандемном времяпролетном масс-спектрометре были получены спектры фрагментации ионов пептидов из всех трех штаммов. Штамм A/Puerto Rico/8/34: На рис. 4.12 приведены масс-спектры фрагментации двух типов ионов С-концевых пептидов данного штамма: массой 4855 - пептид не содержащий ни одной модификации, и массой 5573 - трижды пальмитилированный пептид. На масс-спектрах обоих пептидов присутствуют серии С-концевых фрагментов данных пептидов, претерпевших разрыв по пептидным связям (у-ионы). Спектры подтвердили гипотезу о принадлежности заявленных пиков исследуемому участку гемагглютинина этого штамма и позволили проверить большую часть его аминокислотной последовательности.
Важно, что на спектрах трижды пальмитилированного пептида отсутствуют пики, соответствующие утраченным пальмитатам. Напротив, пики сдвинуты на 238 а.е. после каждого остатка цистеина, свидетельствуя о сохранении жирнокислотных остатков, и это позволяет утверждать, что тиоэфирные связи стабильны в условиях получения масс-спектров фрагментации и тем более в условиях получения простых масс-спектров MALDI. Получив общий масс-спектр органического экстракта, мы были удивлены несовпадением масс серии ионов С-концевых пептидов гемагглютинина с расчитаной по последовательности белка из базы данных. Мы пришли к выводу, что это несовпадение пропадет, если предположить замену Y212- N2i 2, при которой последовательность становится в точности такой же как у большинства гемагглютининов вируса гриппа типа А подтипа Н7 (см. Приложение 2). Для подтверждения соответствия пептидов был получен масс-спектр фрагментации иона пептида, модифицированного двумя остатками пальмитиновой и одним остатком стеариновой кислоты, массой 5534 (рис.4.13). Пики на спектре фрагментации имеют невысокую интенсивность, но все соответствуют у-серии фрагментных ионов указанного нами пептида, тем самым подтверждая первичную структуру приведенную на рис.4.11. При этом фрагментация после кислотного остатка, каким является аспарагиновая кислота, идет с большей эффективностью, давая наиболее интенсивный пик на масс-спектре. Таким образом, сделанное нами предположение о существующей замене полностью подтверждается. Так же, как на рассматриваемых выше спектрах фрагментации пептидов штамма A/Puerto Rico/8/34, цистеиновый остаток не утрачивает своей модифицирующей группы, что подкрепляет утверждение об устойчивости тиоэфирной связи в процессе ионизации. Доказательство принадлежности соответствующей серии пиков С-концевому участку гемагтлютинина штамма А/Х-31 путем анализа масс-спектров фрагментации оказалось менее убедительно. На спектре фрагментации, полученном для иона массой 4870 (пептид, не содержащий ни одного пальмитата), наиболее интенсивные пики принадлежат внутренним фрагментам исходного пептида, образовавшимся в результате двойных распадов. В N-концевой области пептида связь D-W оказывается высоколабильной. Структура данного пептида, вероятно, стабилизирована образованием в процессе выделения внутренних S-S мостов, так как пептид содержит пять цистеинов. Тем не менее, на спектрах присутствуют короткие серии С-концевых (у-ионы) и N-концевых (6-ионы) фрагментов, подтверждающие первичную структуру исследуемого пептида (рис. 4.14).
