Содержание к диссертации
Введение
1. Проблемы в фотоаффинной модификации биополимеров при использовании ароматических азидов в качестве функциональных групп аффинных реагентов 8
1.1. Фотоаффинная модификация, и ее место в ряду других методов исследования надмолекулярных комплексов. Типы фотоактивируемых групп,Задача обзора 8
1.2 Проблемы, возникающие при интерпретации результатов экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров 10
1.2.1. Фотоактивируемые реагенты, содержащие азидогруппу в гетероциклическом основании 14
1.2.2. Фотоактивируемые реагенты на основе ароматических азидов 23
1.2.2.1. и-Нитрозамещённые арилазиды 35
1.2.2.2. Прочие арилазиды 38
1.3. Реакционная способность продуктов фотопревращения арилазидов в отношении функциональных групп биополимеров, или групп их имитирующих. 49
1.3.1. Азирины и азациклогептатетраены 49
1.3.2. Аминильные радикалы и радикалы амминия 50
1.3.3. Катионы арилнитрения 52
1.3.4 Нитрозооксиды, нитрозосоединения и гидроксиламины 54
1.3.5. Илиды 63
1.3.6. Производные /7-бензохинонмоно- и диимина. 64
2. Результаты и их обсуждения 69
2.1. Долгоживущие интермедиаты. ответственные за «темновые» процессы, протекающие при фотоаффинной модификации белков реагентами на. основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты 69
2.1.1. Синтез Лг-(5-азидо-2-нитробензоил)-Лг'-((!-биотинил)-1,2- 70
диамиіюзтана(89)иЛг-(5-азидо-2-нитробензоил)-Лг'-((і-биотинил)-1,3-диаминопропана (90)
2.1.2. Связывание фотоаналогов биотина и продуктов их фотолиза с лиганд- связывающим центром субъединиц стрептавидина 71
2.1.3. Фотовзаимодействие и вторичные реакции фотоактивируемьгх аналогов биотина (89) и (90) с активным центром стрептавидина 73
2.1.4. Фотопревращения фотоаналогов биотина (89) и (90) при облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров 76
2.1.4.1. Механизм фотопревращения фотоаналога биотина (89) 77
2.1.5. Механизм фотопревращения «-нитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров 82
2.1.5.1. Фотопревращения іУ-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- диаминопропана (93) при облучении в водных растворах 82
2.1.5.2. Фотопревращение 4-нитрофенилазида (94) при облучении в водных растворах 86
2.2. Изучение продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитро-бензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров 89
2.2.1. Анализ модифицированных пептидов. 90
2.2,2.. Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с функциональными группами Trp, His и Lys 92
2.2.2.1. Синтез 5-азидо-Лг-[2-(ЗН-имвдазол-4-ил)-зтил]-2- нитробензамида (104) и?/-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида(105) 93
2.2.2.2. Фотолиз 5-азидо-^У-[2-(ЗН-имидазол-4-ия)-этил]-2- нитробензамида (104) 93
2.2.2.3. Фотолиз ^-{З-р-амино-З^Н-индол-З-илї-пропиониламино]- пропил} -5-азидо-2-нитробензамида (105) 94
2.2.2.4. Сравнительный анализ результатов.по фотовзаимодействию 5- азидо-2-нитробензоильной- группы с функциональными-группами Trp, His, Lys и Туг [25] 99
3. Экспериментальная часть 101
3.2. Методы 101
3.3. Вычисление квантового выхода фотолиза соединений (89) и (105) 103
3.4. Ступенчатый фотолиз соединений (89) и (90) 104
3.5. Исследование соотношения продуктов фотолизаЛГ-(2-нитро-5- азидобещоил)-Г,3-диамйнодропана (93) 5-азидо-Лг-[2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитро-бензамида (104) и Л^З-р-амино-З^Ш-индол-З-ил)-пропиониламино]~пропил} -5 -азидо-2 -нитробензамида (105) в зависимости от содержания кислорода в облучаемом растворе 104
3.6. Исследование взаимодействия продуктов фотолиза 4-нитрофенилазида (94) с 4-нитронитрозобензолом 104
3.7. Получение свободных оснований ЛЦг-нитро-З-азидобензоил)-!,2- диаминоэтана и Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-1,3-Диаминопропана (93) из соответствующих хлоргидратов 105
3.8. Идентификация продуктов фотолиза#-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- диаминопропана (93) 105
3.9. Синтез Л^(2-нитро-5-азидо5ензокл)-//'-((і-биотинил)-1,2-диаминозтана (89) и Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-Л'''-(сІ-биотинил)-1,3-диаминопропана (89) 106
3.10. Идентификация продуктов фотолизаіУ-(2-нитро-5-азидобензоил)-Лг'-(сі- биотинил)-1,2-диаминоэтана (89) 107
3.11. Синтез 5-азидо-ЛЦ2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитро-бензамида(104) 108
З.12. Идентификация продуктов фотолиза (104) 108
3.13. Синтез Л/'-{3-[2-амино-3-(Ш-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5- азидо-2-нитробензамида (105) 109
3.14. Идентификация продуктов фотолиза арилазида (105) 110
3.15. Взаимодействие предоблучённых фотоаналогов биотина.(89) и (90) со стрептавидином и стрептавидин-биотиновым комплексом 111
3.16. .Фотомодификация стрептавидина фотоаналогами биотина на (89) и (90) 111
З.17. Ферментативный гидролиз фотомодифшщрованного стрептавидина 111
3.18. Анализ последовательности фотомодифицированных пептидов 112
Выводы 113
- Проблемы, возникающие при интерпретации результатов экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров
- Реакционная способность продуктов фотопревращения арилазидов в отношении функциональных групп биополимеров, или групп их имитирующих.
- Изучение продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитро-бензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров
- Синтез Л/'-{3-[2-амино-3-(Ш-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5- азидо-2-нитробензамида (105)
Введение к работе
Огромная роль химических методов в изучении белков, нуклеиновых кислот и их комплексов, в том числе, систем матричного биосинтеза, общеизвестна и бесспорна. [2-5]. Особенно привлекательны в этом аспекте фотохимические методы, поскольку фотохимическое превращение можно осуществить за доли секунд, а именно в этом временном диапазоне происходят многие биологические события [4-6]. Кроме того, использование фотореагентов в сочетании с техникой быстрого смешивания компонентов исследуемой системы и последующего импульсного облучения открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.
Несмотря на большое количество времени, прошедшее с начала использования фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов [7], значительная часть вопросов, связанных с особенностями превращения арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации до настоящего времени остается без ответов. Некоторые экспериментальные факты [8,9] свидетельствуют о том, что в ряде случаев в модификации белков принимают участие частицы, время жизни которых значительно превосходит время жизни первичных продуктов фотолиза (арилнитренов или их продуктов внутримолекулярного превращения, таких, как азиридин и азациклогептатетраен [10])..Таким образом, отсутствие достаточной информации о механизме фотовзаимодействия арилазидов с функциональными группами биополимеров и о природе образующихся аддуктов затрудняет интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров.
Целью настоящей работы являлось установление механизма фотоаффинной модификации белков при использовании фотореагентов на основе л-нитрозамещёниых арилазидов. Наличие у этих реагентов в пара- положении к азидогруппе такого хромофора как нитрогруппа делает их перспективными в плане использования для исследования нуклеопротеидных комплексов. Это обусловлено тем, что нитрогруппа вызывает сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область (например, у я-нитрофениазида Xmax = 313 нм, а у фенилазида - Xmax = 254 им). Это позволяет, с одной стороны, эффективно активировать такие арилазиды светом с X > 300 нм, где не происходит фотодеградации молекул биополимеров, и, с другой стороны, облегчает детекцию при выделении модифицированного материала. Но, несмотря на широкое применение я-нитрозамещённых арилазидов, информация о механизме их фотовзаимодействия с биополимерами в условиях фотоаффинной модификации последних до сих пор отсутствует, и все рассуждения базируются на результатах фотолиза арилазидов в органических средах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) изучить природу реакционно-способных частиц, принимающих участие в модификации белков;
2). установить структуру продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с функциональными группами белков.
Как изучение природы реакционно-способных частиц, так и установление структуры продуктов фотовзаимодействия. является нетривиальной задачей по двум причинам. Во первых, константы ассоциации многих исследуемых ферментов не велики: 106 - I07 М"1. В силу этого, фотоаффинная метка реагирует с большим числом функциональных групп биополимера, что, в совокупности с уже обсуждённой неустойчивостью образующегося аддукта, делает невозможным накопление такого количества модифицированного материала, которое можно исследовать информативными физико-химическими методами. Во вторых, продукты фотомодификации биополимеров имеют олигомерную структуру, что затрудняет применение многих информативных физико-химических методов, таких как ЯМР и масс-спектроскопия. В этом смысле, для решения поставленных нами задач целесообразно использование двух моделей, предложенных ранее [11,12]:
комплекс между белком стрептавидином и биотином, содержащим фотореакционноспособную группу, присоединённую к остатку валериановой кислоты через линкер определённой длины. (Кл =10 М" ) [13].
модельная структура, в составе которой находятся исследуемый арилазидный остаток и группа, имитирующая аминокислотный боковой радикал; эти две группы соединены через аминоспейсер определённой длины таким образом, что они находятся в условиях сближения аналогичных таковым при проведении фотоаффинной модификации белка.
Проблемы, возникающие при интерпретации результатов экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров
В идеальном эксперименте фотоаффинной модификации активная частица, образующаяся из арилазида, должна мгновенно связываться с мишенью [47], то есть, высокую степень модификации фермента можно ожидать тогда, когда время жизни комплекса намного больше времени жизни модифицирующей частицы [48]. Эффективность фотоаффинной модификации биополимеров часто оценивается по количеству образовавшихся ковалентных аддуктов. Ранее считалось, что активной частицей, взаимодействующими с биополимером являются исключительно триплетный или синглетный арилнитрены [4,10]. Эти выводы основаны на дедуктивных рассуждениях, базирующихся на результатах исследований кинетики реакций и идентификации стабильных продуктов фотолиза арилазидов в органических средах или в твёрдых матрицах при низкой температуре [49-51]. Согласно совокупности таких данных, при облучении арилазидов светом с определённой длиной волны молекула арилазида (1) отщепляет молекулу азота и превращается в синглетный нитрен (2), который может претерпеть интеркомбинационный переход с образованием триплетного нитрена (3) [52]. Как триплетный, так и синглетный арилнитрены - весьма короткоживущие частицы. Время жизни синглетного нитрена Ю"6 - 10" , а триплетного - 10" - 10 5 секунд [53]. Изменяя заместители в ароматических кольцах, можно увеличивать или уменьшать время жизни каждой из этих частиц [50,54]. Синглетный нитрен может находиться в двух состояниях: в первом состоянии он содежит две. неподелённые пары электронов - одна из них лежит на несвязывающей р-орбитали в плоскости фенильного кольца, другая - на sp-орбитали; во втором состоянии одна из неподелённых пар распределена по двум орбиталям, но суммарный спин электронов при этом равен нулю. В таком, состоянии, один из электронов занимает- несвязывающую р-орбиталь, перпендикулярную плоскости кольца и оказывается вовлечён во взаимодействие с к-системой [55]. В результате этого может образоваться азирин (4) или азациклогептатетраены (5) [50,56,57], которые так же активны в отношении нуклеофилов (схема 1). Основной активностью, которую проявляет синглетный нитрен является образование, вставок в двойные (6) и одинарные связи (7) [6,50,52,58-61].
Триплетный нитрен - бирадикальная частица, среди его активностей основную долю занимают реакции с кислородом [49,62], димеризация, взаимодействие с образованием нового радикального центра на другой молекуле, взаимодействие с радикальным центром с образованием аддуктов (8) и восстановление. Характерными продуктами триплетного нитрена являются амино- (9), нитро- (10), азо- (11) и азоксисоединения (12) [50,61]. апротонными и, достаточно часто, неполярными. Это означает, что в реакционной смеси нет частиц, обладающих ярко выраженными нуклеофильными или электрофильными. свойствами, кроме тех частиц, которые генерировались за счёт фотолиза арилазидов. При проведении фотоаффинной модификации биополимеров используются водные растворы и такие компоненты буфера как Tris-HCI, КС1, MgCl2 [8,11,17,18,29,33,35,37,63-75], Na2HP04 [45,46,76-78], ТгісІпе [48], HEPES [28,44,79], EDTA [28,33,45,46,64], CHAPS ({3-[(3-холамидопропил-диметиламмонио]-1- пропансульфонат}) [37] и NH4HCO3 [36,80]. В ряде работ, тиолы (дитиотреит, р-меркаптоэтанол) используются в качестве реагентов, «гасящих» непрореагировавшие молекулы арилазида [29,35,44,64,66,69,70,75]. В ряде исследований добавляют глицерин [44,65,70,72] и альбумин [70,72]. Кроме того, в активных центрах некоторых ферментов в реакцию вовлекаются молекулы воды. Вода является не только полярным протонным растворителем,,в некоторых реакциях молекулы воды проявляют нуклеофильные свойства. Но самое главное, в структуре самих биополимеров содержится много. нуклеофильных остатков. Такое разнообразие ярко выраженных нуклеофильных мишеней для атаки будет влиять на путь фотопревращения арилазидов. Следовательно, данные о фотопревращении арилазидов, полученные в органических растворителях не подходят для интерпретации биохимического эксперимента. Уже в 90-х годах сведения, накопленные при проведении фотоаффинной модификации биополимеров, привели исследователей к" мысли, что фотовзаимодействие арилазидов с биополимерами в водных средах не может быть сведено только к образованию активных нитреновых частиц и формированию за счёт них устойчивых связей с мишенью. Основные явления, не поддающиеся объяснению с помощью принятой схемы фотопревращения арилазидов, с которыми сталкивались исследователи, применяющие арилазидные фотореагенты: 1) низкая степень модификации фермента (см., например, [24,37,63]); 2) несоответствие степени инактивации и степени модификации фермента (см., например, [8,28,79,80]); 3) модификация полимеров в условиях предоблучения фотореагентов [8,44.45,80,81]; 4) повышение степени модификации после прекращения облучения [9,81]; 5) получение высокомолекулярных фракций, которые не могут быть следствием проведения каких либо экспериментальных процедур (см., например, [82]). Более подробно эти случаи будут рассмотрены ниже. Можно выделить несколько возможных причин низкой степени модификации: 1) химический аспект (образование неактивных или малоактивных продуктов фотолиза фотоаффинного реагента, взаимодействие с компонентами буфера, в том числе, способность азидогруппы восстанавливаться под действием тиол-содержащих соединений); 2) нестабильность ковалентной связи в ковалентном аддукте при хранении или в условиях выделения модифицированного соединения; 3) нестабильность в условиях фотолиза группы, используемой для? визуализации модифицированного материала, например в случае иод-125; 4) повреждение мишени за счёт облучения.
Многие исследователи не ставят перед собой цель получить максимально возможную степень модификации, и низкий процент фотомечения не мешает им делать выводы об функционировании того или иного надмолекулярного комплекса. Однако за адекватность этих выводов нельзя поручиться в том случае, если, в силу слишком маленькой степени модификации, часть событий, происходящих в процессе функционирования изучаемого комплекса была упущена из виду. В свою очередь, знания о природе ковалентного аддукта, образующегося при фотовзаимодействии арилазида и мишени, помогли бы выбрать наиболее удачную методику выделения модифицированного материала и избежать потери информации. В силу этого подробное рассмотрение и анализ проблем, возникающих при использовании различных арилазидов для фотоаффинной модификации биополимеров, является, несомненно, ценным не только для интерпретации данных по фотоаффинной модификации, но и полезньш для выбора наиболее оптимальной фотоактивируемой группы при планировании эксперимента. азидоаденозинсодержащие и 8-азидогуанозинсодержащие реагенты могут иметь как syn-, так и дл/г-конформацию. Это влияет на способность их связывания с ферментами [5]. Во-вторых, как утверждают авторы [18], такие реагенты нельзя использовать при каталитически компетентном мечении. Результаты, полученные при исследовании биополимеров методом фотоаффинной модификации с использованием фотоактивируемых реагентов на основе гетероциклических оснований, и проблемы, суммированы в таблице 1. При анализе данных особое внимание уделено условиям проведения эксперимента с целью выявления всевозможных факторов, влияющих на эффективность модификации. Первое, что можно заметить, глядя на суммированные результаты, это большой разброс значений степени фотоаффинной модификации, полученный в ходе различных экспериментов, свойственный этому типу реагентов. Это могло бы быть обусловлено рядом причин: 1) высокой селективностью фотоактивируемых групп к определенным аминокислотным остаткам; 2) взаимодействием реагента с компонентами буфера; 3) образованием ковалентного аддукта с лабильной связью. 4) образованием при фотолизе арилазидной группы активных интермедиатов, время жизни которых больше времени существования комплекса.
Реакционная способность продуктов фотопревращения арилазидов в отношении функциональных групп биополимеров, или групп их имитирующих.
Процесс фотохимического превращения ароматических азидов можно разделить на три стадии: 1) акт поглощения кванта света, при котором появляется электронно-возбужденное состояние; 2) первичные химические процессы, в которых образуются ширены; 3) вторичные, или «темповые», реакции различных химических соединений, образующихся в результате превращения нитрена.. 4) фотоактивация некоторых продуктов превращения арилнитренов Для полного понимания механизма фотохимической реакции каждую из. стадий, перечисленных выше, следует рассматривать подробно. Однако нет необходимости делать. всесторонний обзор по первым: двум пунктам, поскольку имеется несколько прекрасных обзорных статей на эту тему [55,49,50,52]. Поэтому во второй части обзора будут рассмотрены и обсуждены свойства реакционноспособных соединений, предшественниками которых был нитрен. При этом основной упор будет сделан на реакции с функциональными группами биополимеров или: с соединениями, имитирующими их; 1.3.1. Азирины и азациклогептатетраены Для азациклогептатетраена (б) (схема 4) характерны реакции присоединения и поэтому в случае участия: его в модификации мы имеем ограниченный набор функциональных групп, с которыми соединение (6) может взаимодействовать. Кроме того, простые и замещённые дегидроазепины являются не очень хорошими реагентами для фотоаффинной модификации из-за низкой реакционной способности [54]. Но это не исключает возможность их участия в процессе фотоаффинной модификации белков. Авторы работы [46] считают, что н-азидобензоильный остаток является источником азациклопентатетраеновых частиц. Азирин может вступать в реакцию с такими нуклеофилами как амины и меркаптаны. При облучении фенилазида в присутствии этилендиамина и меркаптоэтанола в качестве основных продуктов были получены соединения 19) и (20), соответственно (схема 4) [96,97]. В работе [89] было показано образование соединения (21) при взаимодействии азациклогептатетраена и уксусной кислоты, с дальнейшей перегруппировкой в соединение (22), а затем в продукт (23).
Если за то время, пока центры, содержащие неспаренные электроны, находятся рядом один из электронов не успевает поменять спин, то кроме аддукта, образованного аминильным радикалом, мы можем получить аддукт, образованный вторым радикальным центром. В работе [78] была изучена кинетика фотомодификации 6-звенного дезоксирибоолигонуклеотида производным комплементарного ему олигонуклеотида, несущего на концевой фосфатной группе остаток 3-(я- азидотетрафторбензоиламино)пропиламина. Как уже было сказано, фотолиз дуплекса при избытке мишени приводит, наряду со 100 % модификацией мишени, к 29 % модификации адресной части самого фотореагента по аденину. При таких условиях облучения весь фотореагент находится в дуплексе. Наличие: самомодификации фотореагента наряду с модификацией мишени авторы объясняют взаимодействием модифицированного основания мишени с одним из оснований адресной части фотореагента. С другой стороны,. как считают авторы работы, триплетные нитрены должны взаимодействовать с гетероциклическими основаниями с образованием радикалов, которые, в свою очередь, могут реагировать с гетероциклами комплементарной цепи дуплекса. Но это справедливо, единственно, при образовании триплетного нитрена, как основного продукта фотолиза п-азидотетрафторбензойной кислоты. На справедливость последнего факта указывает работа [6]. Проанализировав, какие активные частицы, образовавшиеся из триплетного-нитрена, могут приводить к образованию радикалов, можно заключить, что на эту роль подходят аминильные радикалы. Радикал аминия (29) (схема 5), являющийся сопряжённой кислотой аминильного радикала, согласно расчётным данным должен иметь плоскую структуру. Радикалы аминия могут вступать в большее число реакций, чем нейтральные аминильные радикалы,51. вероятно, из-за их большей электрофильности, т. е. для радикалов аминия характерны реакции с нукдеофилами [99]. 1.3.3. Катионы арилнитрения Косвенным доказательством того, что катионы арилнитрения могут образовываться в качестве промежуточных продуктов при фотолизе азида может служить работа [100]. Авторы обнаружили, что термолиз при 138 С и фотолиз при 25 С арилазида (30) в кислых условиях в присутствии ЕЮН даёт продукты, являющиеся результатом превращения азациклогептатетраена (31), и соединения, являющиеся результатом превращения катиона арилнитрения (32) (см. схему 7).
В работе [102] показано, что образование С-8 аддукта (36) между катионом нитрения и гуанозином in vitro происходит через триплетное состояние нитрениевого иона (схема 8). Катионы арилнитрения несут на атоме азота положительный заряд и пару электронов. Электроны в этой паре могут иметь как одинаковый, так и разный спин, что определяет триплетное и синглетное состояние нитрениевого иона, соответственно [89]. Поскольку катионы нитрения являются электрофильными частицами, то для них характерно взаимодействие с нуклеофилами, даже с бензолом [100]. Надо учитывать, что в катионах арилнитрения положительный заряд делокализован по ароматической системе, что даёт возможность при взаимодействии с нуклеофилами образовывать не только N-, но и С-аддукты [89]. Авторы [100] показали, что характер продуктов, образующихся при кислотном гидролизе арилгидроксиламинов и термолизе, или. облучении арилазидов в присутствии бензола одинаков, но при гидролизе гидроксиламинов образуется большая доля продуктов замещения в ароматическое кольцо (соединения (37), (38)). Авторы объясняют это тем, что в обоих случаях реакция идёт через катион нитрения, но в случае гидроксиламина образующийся нитрениевый ион в кислой среде протонируется ещё раз. Таким образом, положительный заряд находится и на атоме азота и в ароматической системе, что увеличивает процент С-аддуктов среди продуктов реакции (схема 9). Интересный результат был получен в работе при изучении продуктов фотовзаимодействия. реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты с функциональной группой тирозина. [12]. Было обнаружено, что при облучении такого типа реагентов в атмосфере аргона в водных растворах образуется 4,4 -динитроазоксибензол (47). Единственно возможным путем образования этого соединения в бескислородных условиях может быть реакция iV-арилгидрокисиламина (48) — продукта взаимодействия арилнитрена с водой - с нитрозосоединением (49) - продуктом диспропорционирования гидроксиламина (схема 14). Нитрозосоединения способны атаковать радикальные центры, образуя нитроксильные радикалы (53), взаимодействовать с нуклеофильными частицами, образуя N-дизамещё нные гидроксиламины (54) и изомеризоваться с образованием оксимов (55) [ПО]. Последняя реакция конкурирует с образованием димера (56) нитрозосоединения и в случае алкилнитрозосоединений является необратимой. Изомеризация в оксимы ароматических нитрозосоединении происходит обратимо и может привести к формированию хинон-подобных структур (57), если исходный арилазид содержал в пара-полжении к нитрозогруппе заместители, имеющие положительный мезомерный эффект (например, амино- или гидроксигруппы) [108,110]. Общая картина этих превращений представлена на схеме 18.
Изучение продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитро-бензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров
На данный момент единственным продуктом фотоаффинной модификации белков, для которого установлена структура, является продукт фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильного остатках функциональной группой тирозина [12]. Отсутствие таких знаний объясняется трудностью накопления достаточных количеств индивидуальных модифицированных пептидов с целью последующего их анализа с помощью физико-химических методов.. Лишь в двух случаях модифицированные пептиды бьши. охарактеризованы электронной спектроскопией [12,17]. Решение проблемы по установлению структуры продуктов фотомодификации аминокислотных остатков мы проводили с использованием двух модельных систем: 1) комплекса стрептавидиН фотоаналог биотина; 2) соединения, в котором аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. Ранее [11,12] эти модели хорошо зарекомендовали себя при установлении структуры модифицированного тирозина реагентом на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты. Для того чтобы расширить спектр модифицированных аминокислотных остатков, нами были получены два новых фотоаналога биотина (89) и (90), отличающиеся длиной спейсера (схема 36). Однако в ходе изучения фотоиндуцированного взаимодействия стрептавидина с соединением (89) было обнаружено, что модифицированные пептиды не устойчивы в условиях анализа. Поэтому все работы по установлению структуры модифицированных пептидов проводились с использованием стрептавидина, модифицированного фотобиотином (90). Условия и результаты модификации подробно обсуждены в разделе 2.1.3. Для анализа использовали модифицированный пептид, элюирующийся во фракции пика 4 (см. рис. 5), Этот пептид образуется и при модификации белка фотоаналогом биотина, и на стемновой» стадии при реакции стрептавидина с долгоживущим «интермедиатом», образующемся при фотолитическом разложении соединения (90), 2.2.1. Анализ модифицированного пептида Индивидуальный пептид, модифицированный; реагентом- (90) был получен в количестве, достаточном как для его секвенирования, так и для исследования с помощью электронной; спектроскопии и MALDIOF масс-спекгрометрии.
Электронный спектр поглощения модифицированного пептида приведен на рис. 12. Спектр характеризуется Хтах = 385 нм, что указывает на присутствие в составе продукта: остатка реагента. Активный центр стрептавидина хорошо изучен различными методами [143-146]. Его формируют аминокислотные остатки и пептиды, показанные на рис. 13: Asn(23)GlnLeuGlySer(27) (выделен жёлтым цветом); Tyr(43)GluSerAlaValGlyAsn(49) (выделен голубым цветом); Ser(88)AlaThrThrTrp(92) (выделен оранжевым цветом); Рис. 13 Структура субъединицы стрептавидина, содержащей irp(lUoJLeuLeu(llU) (выделен молекулу биотина (выделена зелёным цветом). розовым цветом); а так же Тгр-79; Trp-120; Asp-128 и Thr-129 (выделены красным цветом) [144]. Таким образом, видно, что модифицированный пептид попадает в район активного центра стрептавидина, причём, согласно компьютерному моделированию активного центра стрептавидина Тгр-75 и Тгр-79 могут взаимодействовать непосредственно с фотоаналогом биотина (рис. 13). Стрептавидин состоит из четырех одинаковых субъединиц, каждая из которых способна связывать одну молекулу биотина с высокой аффинностью (Кй = 10 14 М) [13]. В ходе экспериментов по исследованию аффинных свойств фотоактивируемого производного биотина и продуктов его фотолитического разложения нами было показано, что эти соединения связываются со стрептавидином при мольном отношении 4:1, т. е. Они являются аналогами биотина (см. раздел 2.1.2.). Это означает, что во всех случаях активный центр стрептавидина может включать только одну молекулу фотоаналога биотина или одну молекулу продукта его фотолиза, и проникновение туда второй активной частицы практически невозможно. В то же время, очевидно, что одна нитреновая частица, синглетная или триплетная, не может служить причиной модификации двух остатков триптофана. К тому же модифицированный пептид образовывался как при фотовзаимодействии стрептавидина с фотобиотином, так и при добавлении к белку предоблученного реагента. Фотомодификация активного центра одной субъединицы реагентом, связанным в активном центре другой субъединицы стрептавидина, также исключается.
Это следует из анализа данных компьютерного моделирования активного центра стрептавидиновой субъединицы, содержащей молекулу фотобиотина. Для того, чтобы арилазидогруппа провзаимодействовала с любым из остатков триптофана соседней субъединицы, нужно сместить её на расстояние, превышающее суммарную длину остатка валериановой кислоты, аминоспейсера и самой арилазидной группы. Окисление второго остатка триптофана под влиянием условий проведения эксперимента так же отвергается, поскольку данный эксперимент был проведён в условиях. аналогичных описанным. авторами [11], при этом модификация двух, аминокислотных остатков в составе одного активного центра стрептавидина в этой работе не наблюдалась. Таким образом, факт модификации двух остатков триптофана одной молекулой фотореагента может быть объяснён тем, что при облучении фотореагента образуется соединение, которое, модифицируя один аминокислотный остаток, превращается в другое активное соединение, взаимодействующее со вторым остатком триптофана. Изучение структуры продуктов фотомодификации стрептавидина может дать ключ к пониманию механизма взаимодействия активных частиц, генерируемых при фотолизе арилазида, с функциональной группой триптофана. На основе этих данных можно было бы создать предсказательную модель, полезную при интерпретации данных, полученных при других исследованиях биомакромолекул и биохимических процессов методами фотоаффинной модификации. Поэтому в задачу следующего этапа работы входило определение структуры модифицированного триптофана. 2.2.2. Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с функциональными группами Тгр, His и Lys Решение проблемы установления структуры продуктов фотомодификации аминокислотных остатков целесообразно начать с исследования фотолиза модельных соединений, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. Для исследования продуктов фотомодификации функциональных групп Tip и His реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислот нами были синтезированы два модельных соединения: 5-азидо-Л -[2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитробензамид (104) и //-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамид (105). 2.2.2.1. Синтез 5-азидо-М-12-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитробензамида (104) и N-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида (105) Соединение 104) было получено путем бензоилирования аминогруппы гистамина N-гидроксисукцинимидным эфиром 5-азидо-2-нитробензойной кислоты. Синтез соединения (105) проводился через ацилирование аминогруппы спейсера пентафторфениловым эфиром Йос-защищенного триптофана (схема 41). Детали синтеза описаны в разделе 3 «Экспериментальная часть». Структуры модельных соединений были подтверждены методами Н-ЯМР, 13С-ЯМР, ИК- и электронной: спектроскопией и MALDIOF-масс спектрометрией. Все спектральные характеристики приведены в разделе 3 «Экспериментальная часть».
Синтез Л/'-{3-[2-амино-3-(Ш-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5- азидо-2-нитробензамида (105)
Соединение (105) (0.1 мМ водный, раствор) облучали в 0.1 см кварцевой кювете, в течение 150 с или в 1 см кварцевой кювете в течение 8 мин. За фотопревращениями следили путём регистрирования спектров поглощения. Продукты фотолиза (соединения (109), (110) и фракцю, имеющую нестабильный состав) выделяли с помощью препаративной хроматографии на: смоле с обращенной фазе, как описано выше. Фракцию, имеющую нестабильный состав упаривали при низком давлении и 40 С на ротационной выпарке, растворяли в метаноле. Содержащиеся в ней компоненты (соединения (109), (111) и (112)) выделяли с помощью препаративной хроматографии на смоле с обращенной фазе,, как описано выше. Неустойчивый продукт (111). УФ-спектр (Н20), Хтах/нм: 358. №{3-[2-амино-3-(Ш-индол-3-ил)-проп иониламино]-проп ип}-5-амино-2-нитробензамид. (109). УФ-спектр (Н20), А.тах/нм (є, M W1): 382; спектр Н-ЯМР (D20, 5, м.д., J, Гц): 1.58 (2 Н,.т. Jvy 6.9, Н2 ), 3.08 (2 Н, T,JVX 6.9, HI ), 3.09-3.20 (1 Н, м, НЗ р), 3.25-3.37 (1 Н, м, НЗ а), 3.40-3.51 (2 Н, м, НЮ"), 4.30 (1 Н, т,-Jir.ur 6.06, НИ"), 6.70 (1 Н, д, J6A 2.5, Нб), 6.92 (1 Н, дд, Дз 9.0, У4)6 2.5, Н4), 7.23 (1 Н, д, У5",б" 8.5, Н5"), 7.29 (1 Н, т, J6i- J 6-,7- 8.5, Нб"), 7.39 (1 Н, с, Н2"), 7.57 (1 Н, д, Jfe» 7- 8.5, Н8"), 7.67 (1 Н, т, Jrfi- J7-x 8.5, Н7"), 8,20 (1Н,д,У3і4 9.0, НЗ),. Азоксисоединение (110).УФ-сткгр (Н20), Хтах/нм: 220, 290, 352. Спектр Н-ЯМР (D20, 5, м.д., J, Гц): 1.58 (2 Н, т, JTy 6.9, Н2 ), 3.08 (2 Н, т, JV,T 6.9, НГ), 3.09-3.20 (1 Н, м, НЗ р), 3.25 - 3:37 (1 Н, м, НЗ а), 3.40-3.51 (2 Н, м, НЮ"), 4.30 (1 Н, т, У„-1Г 6.06, НИ"), 7.23 (1 Н, д, У5-,б" 8.5, Н5"), 7.29 (1 Н, т, Je. 5- J6-,r 8.5, Нб"), 7.39 (1 Н, с, Н2"), 7.57 (1 Н, д, У8»,7» 8.5, Н8"), 7.67 (1 Н, т, Jr,6" Jrjr 8.5, Н7"), 8Л0 (1 Н, д, Jm.m 2.5, H6N), 8.14 (1 Н, дд,Лы,зм 9.0, У4ы.бм 2.5, H4N), 8,34 (1 Н, д, V3H4N 9.0, H3N), 8,39 (1 Н, д, /зда,4Ш 9-0, H3NO), 8.40 (1 Н, д, Лью,4Ш 2.5, H6NO), 8.53 (1 Н, дд, Jwojm 9.0, /4NO,6NO 2.5, H4NO). М-{3-[2-(шино-4-(2 аминофент)-4-оксо-бутуриламино]пропші}-5-амино-2- нитробензамин (112). УФ-спектр (Н20), Х /нм: 228, 262, 390. Спектр Н-ЯМР (D20, 5, м.д., J, Гц): 1.84 (2 H, м, Н2-), 3.18-3.34 (2 Н, м, Нг), 3.34-3.49 (2 Н, м, Н3-), 3.78 (2 Н, д, Ую» и» 6.0, НЮ"), 4.50 (2 Н, T,V„»,IO» 6.0, НИ"), 6.65 (1 Н, д, Ум 2.5, Н6), 6.77 (I Н, дд, Дз 9.0, Де 2.5, Н4), 6.82 (1 Н, T,Jr fi»Jr:r 8-0, Н7"), 6.91 (1 Н, д,/8",г. 8.0, Н8"), 7.45 (1 Н, т, J6 j» J6-.,r. 8.0, Н6"), 7.84 (1 Н, д, /5-,б- 8.0, Н5"), 8.04 (1 Н, д, Д4 9.0, НЗ). MALDI-масс: m/z 427 [М + Н]+, m/z397 [M-NO], Wz381 [M-NO-O]. 3.15. Взаимодействие предоблучённых фотоаналогов биотина (89) и (90) со стрептавидином и стрептавидин.биоткновым комплексом К раствору стрептавидина (0.11 мМ, 56 мкл) в 0.01 М Tris-HCl (рН 7.5) добавили 8 %-ный; водный раствор этанола с предоблучёнными фотоаналогом (89) или (90)(0.12 мМ или 0.24 мМ, 39 мкл).
После инкубации в темноте в течение 15 мин образцы подвергли ионообменной микроколоночной хроматографии. Для доказательства того, что предоблучённые фотореагенты (89) и (90) взаимодействуют с тем же сайтом, что и биотин, к раствору биотина (5 мМ, 12 мкл) в 0.01 М Tris-HCI (рН 7.5) добавили раствор стрептавидина (0.125 мМ, 49 мкл). После инкубации в темноте в течение 15 мин к смеси добавили раствор предоблучённого фотоаналога (89) или (90) (0.62 мМ, 39 мкл). Далее образцы инкубировали в темноте в течение 15 мин и хроматографировали на колонке с анионообменной смолой. 3J6. Фотомодификация стрептавидина фотоаналогами биотина (89) и (90) К водному раствору стрептавидина (88 мкл, 0.01 мкмоль) добавили аликвоту фотоаналога биотина (89) или (90), растворённого в этаноле (12 мкл, 0.04 мкмоль). Реакционную смесь выдержали при перемешивании 20 мин в темноте и облучили в течение 40 с (фотоаналог биотина (89)) или 50 с (фотоаналог биотина (90)). Фотомодифицированный стрептавидин-выделяли методом гель-фильтрации. 3.17. Ферментативный гидролиз фотомодифицированного стрептавидина К водному раствору фотомодифицироанного стрептавидина (60 мкл, 0.06 мМ) добавили GncUHCl (156 мкл, 8.4 М, рН 1). Полученную смесь выдерживали 60 мин при постоянном перемешивании и комнатной температуре, 30 мин на кипящей водяной бане и 3 мин на ледяной бане, последовательно. Реакционную смесь титровали КОН (1 М водный раствор) до рН 8-9, далее к реакционной смеси последовательно добавили Tris-HCl (336 мкл, 10 мМ, рН 8.2), ЭДТА (336 мкл, 5 мМ) и протеиназу К (7.2 мкл, 10 мг/мл) и инкубировали в течение 3 ч при 37С. Процесс гидролиза остановили добавлением TFA (1 М водный раствор) до рН 3-4. Фотомодифицированные пептиды выделяли. методом обращённо-фазовой ВЭЖХ согласно описанию, приведённому выше. 3.18. Анализ последовательности фотомодифицированных пептидов
Анализ последовательности модифицированных пептидов провели с использованием газофазного секвенатора «Applied Biosystems» модель 470А, оснащённого РТН-аа анализатором, модель 120А. [150]. Было вьивлено наличие в анализируемом образце пептида Gly Тгр Тге Val Ala Trp Lys Asn. УФ (H20), Хт , нм: 385. MALDI MS, m/z: 1455.1 [М + остаток реагента + 20 +Н]"1". выводы І. В условиях проведения фотоаффинной модификации белков исследован механизм фотохимического превращения «-нитрозамещенных арилазидных реагентов. Впервые показано: 1) облучение л-нитрофенилазида, ЩЗ-азидо -нитробензоил)-1,3-диаминопропана -функциональных фрагментов фотоаффинных реагентов - в водных растворах приводит к образованию п-нитрозамещенных Я-арилгидроксиламинов; 2). предшественником ароматических нитрозо-, амино-, азоксисоединений в водных растворах является jV-замещенный арилгидроксиламин, а не триплетный нитрен, как считали ранее; нитрозо- и аминосоединения образуются при диспропорционировании N-арилгидроксиламина; азоксисоединение является продуктом конденсации исходного N-арилгидроксиламина с образующимся в процессе его окисления нитрозосоединением; 3) «темновые» процессы в фотоаффинной модификации белков при использовании п-нитрозамещенных арилазидных реагентов обусловлены образованием в ходе, облучения арилазидогруппы реакционноспособного ароматичекого нитрозосоединения. II. Для изучения фотоиндуцированного взаимодействия л-нитрозамещенных арилазидных реагентов с функциональными группами аминокислот синтезированы две модельные. системы, обеспечивающие сближение реакционных центров: а) комплекс стрептавидин«фотоаналог биотина; б) соединения, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с- арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка. С помощью их обнаружено: 1) образование нестабильного ковалентного аддукта сульфиминовой природы, в случае модификации соединений, имитирующих остаток метионина; в водных растворах этот продукт модификации гидролизуется с образованием производного сульфоксида; 2) превращение арилазидного реагента в амино-, нитро-, и азоксисоединения в присутствии функциональных групп лизина и гистидина; 3) образование производного кинуренина, в случае модификации остатка триптофана; предложен механизм его образования на стадии «темновых» реакций. В первую очередь автор выражает самые тёплые слова благодарности своим родителям и супругу за неоценимую поддержку, помощь и проявленное терпение. Автор благодарен всем коллегам, оказавшим содействие в выполнении данной работы: Т.М. Ивановой, В.В. Ковалю, А.Ю. Денисову и Ю.Я. Маркушину (ИХБФМ); М.М. Шакирову и В.В. Кандауровой (НИОХ), А.И. Мирошникову и М.В. Серебряковой (институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва), Б. Ересманну и Дж. Рейнболду (Institute de Biologie Moleculaire et Cellulaire du C.N.R.S., Strasbourg, Франция). Отдельно хотелось бы выразить благодарность Кнорре Дмитрию Георгиевичу за постоянное внимание к работе и «катализ» рабочей активности автора, а так же Павлу Алексееву за помощь в освоении некоторых компьютерных программ, поддержку и ценные советы. В заключении хотелось бы сказать тёплые слова благодарности научному руководителю Годовиковой Татьяне Сергеевне за безграничное терпение, и придание формы творческому началу и научному мировоззрению автора.
