Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 10
РАЗДЕЛ 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ 15
СТРУКТУР МАТРИЧНОГО БИОСИНТЕЗА: ПРОБЛЕМЫ И
ПЕРСПЕКТИВЫ (обзор литературы)
1.1. Подходы к синтезу фотоактивируемых аналогов компонентов 17
надмолекулярных структур матричного биосинтеза для решения задач
по выявлению точек контакта между биополимерами
Ферментативные методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и 22 РНК
Химико-ферментативные методы получения фотоактивируемых 35 фрагментов ДНК и РНК
Химические методы введения фотоактивируемых групп в ДНК и РНК 43
Роль би- и полифункциональных реагентов в получении специфичных 46 фотоактивируемых белков
Заключение к разделу 1.1. 56
1.2. Структурно-функциональные исследования нуклеопротеидных 57
комплексов рибосом про- и эукариот методом фотоаффинного
сшивания
Рибосомные белки и нуклеотиды рРНК прокариот, сшивающиеся с 58 фотоактивируемыми аналогами мРНК
Расположение мРНК в области декодирования по данным 65 фотоаффинной модификации рибосом человека фотоактивируемыми аналогами мРНК
Пептиды фактора терминации трансляции eRFl, сшивающиеся с 78 фотоактивируемыми аналогами мРНК в составе терминирующих комплексов
Метод «импульсной фотоаффинной сшивки» для исследования 79 динамики взаимодействия тРНК с разными участками рибосомы
Заключение к разделу 1.2. 80
1.3. Фотоаффинная модификация белково-нуклеиновых комплексов 81
матричного биосинтеза нуклеиновых кислот
1.3.1. Некоторые примеры использования метода фотоаффинной 82
модификации биополимеров для структурно-функциональных
исследований РНК-полимераз
1.3.2 Примеры исследования структурно-функциональной организации 86
комплексов репликации и репарации ДНК эукариот методом
фотоаффинной модификации биополимеров
1.3.3. Заключение к разделу 1.3. 93
1.4. Проблемы селективности и эффективности фотоаффинного мечения 95
компонентов надмолекулярных комплексов и пути их решения
Фотоаффинная модификация белков, основанная на синтезе 96 радиоактивного фотоактивируемого реагента in situ
Каталитически компетентное мечение как подход для селективной 99 модификации белково-нуклеиновых комплексов
Применение бинарной системы фотоаффинных реагентов для 105 высокоселективной модификации белков в надмолекулярных комплексах
Влияние строения арилазида на эффективность и селективность 112
фотоаффинной модификации биополимеров реагентами на основе
ароматических азидов
1.5 Заключение к разделу 1 135
РАЗДЕЛ 2. МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 136
РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ С
ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ БЕЛКОВ (результаты и их
обсуждение)
Специфичность и эффективность модификации функциональных 137 групп биополимеров арилазидными реагентами
Фотоиндуцированные реакции арилазидных реагентов в условиях 151 проведения фотоаффинной модификации белков
«Темновые» стадии при фотоаффинной модификации белков 151 реагентами на основе я-азидоанилина и (4-азидофенил)-Л^-алкиламина
Механизмы фотоиндуцированных реакций я-азидофенилфосфата в 157 условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров .
Проблемы, возникающие при интерпретации результатов 157 экспериментов по фотоаффинной модификации белков реагентами на основе л-азидофенилфосфата
Фотохимические превращения и-азидофенилфосфата при его 158 облучении в водных растворах
3',5'-Диметилиндофенол как продукт фотоиндуцированного 164 взаимодействия л-азидофенилфосфата с 2,6-диметилфенолом
и-Азидофенилфосфат как фотоактивируемый фосфорилирующий 166 реагент
2.2.3. Механизм фотолиза и-нитрозамещенных арилазидов в условиях 169
проведения фотоаффинной модификации биополимеров
Фотоиндуцированные превращения Лг-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- 170 диаминопропана при его облучении в водных растворах
Фотоиндуцированные превращения 4-нитрофенилазида при его 175 облучении в водных растворах
2.2.4. Фотолиз перфторированного ароматического азида в водном растворе 177
2.3. Разработка общего методического похода к изучению строения 181
продуктов фотоаффинной модификации белков реагентами на основе
ароматических азидов
2.3.1. Фотоиндуцированная аффинная модификация стрептавидина 186
фотоактивируемыми аналогами биотина
Синтез 5-азидо-2-нитро-Лг-{2-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-с1]- 186 имидазол-6-ил)пентаноиламино]-этил}-бензамида, 5-азидо-2-нитро-Л''-{3-[5-(2-оксогексагидротиено[3,4-с1]имидазол-6-ил)пентаноиламино]-пропил}-бензамида и 5-азидо-2-нитро-тУ-{4-[5-(2-оксогексагидро-тиено[3,4-с1]имидазол-6-ил)пентаноил-амино]-бутил}-бензамида
Связывание фотоактивируемых аналогов биотина с лиганд- 187 связывающим центром субъединиц стрептавидина
Фотоиндуцированные превращения фотоактивируемых аналогов 189 биотина при их облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров
Структурный и спектральный анализ продуктов фотоиндуцированного 196 взаимодействия фотоактивируемых аналогов биотина с функциональными группами стрептавидина
2.3.2. Продукты фотоиндуцироанного взаимодействия 207
5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реагирующих групп
Синтез ЛЦ2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-зтил}-5- 209 азидо-2-нитробензамида и іУ-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида
Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 210 группы с боковым радикалом тирозина
Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной 221 группы с боковым радикалом триптофана
2.3.3. Продукты фотовзаимодействия 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной 228
группы с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров
Синтез производных ароматических аминокислот, несущих остаток 228 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты
Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 229 боковым радикалом тирозина
Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с 235 боковым радикалом триптофана
РАЗДЕЛ 3. ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ НА 244 ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (результаты и их обсуждение)
3.1. Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие арилазидные группы на 246
концевом моноэтерифицированном фосфате, как реагенты для фотоаффинной модификации белков
3.1.1. Синтез арилазидных реагентов - производных 246
олигодезоксирибонуклеотидов - по их терминальной
моноэтерифицированной фосфатной группе
Некоторые аспекты амидирования 5'-концевых 251 моноэтерифицированных фосфатов олигонуклеотидов при использовании трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисульфида
Фосфорилирующие производные нуклеотидов и олигонуклеотидов с 255 цвиттер-ионной группой как промежуточные соединения при получении арилазидных аффинных реагентов и других амидофосфатов
3.1.2. Фотоиндуцированное взаимодействие арилазидных производных 274
олигонуклеотидов с белками хроматина
3.2. Арилазидные производные нуклеозид-5'-трифосфатов и 279
2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов: синтез и использование в матричном биосинтезе аффинных реагентов - фотоактивируемых производных олиго- и полинуклеотидов
Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата 280 РНК-полимеразы II на основе арилазидных производных у-амидофосфатов NTP
Арилазидные С-5-аналоги dUTP и UTP: синтез и субстратные свойства 293 в тестах с ДНК- и РНК-полимеразами
Синтез аналогов UTP и dUTP, содержащих остатки ароматических 294 азидов, соединенных с С-5 положением урацила линкерами разного строения
Синтез 5-{Лг-[Л"-(5-азидо-2-нитробензоил)-3-аминопропионил]амино 298 метил}-2'-дезоксиуридин-5'-[сс- Р]-трифосфата
Введение фотоактивируемых групп в нуклеиновые кислоты в процессе 301 матричного биосинтеза в системах с ДНК-полимеразами
Введение фотоактивируемых групп в РНК в процессе матричного 308 биосинтеза в системе с РНК-полимеразой
3.2.3. Разработка подхода, основанного на фотоаффинном мечении, для 310
выявления на метафазных хромосомах в условиях флуоресцентной
гибридизации in situ уникальных ДНК-последовательностей с
помощью зондов-праймеров
3.2.4. Структурно-функциональные исследования репликативного комплекса 319
вируса клещевого энцефалита методом каталитически компетентного
мечения с использованием арилазидных производных UTP
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 324
Материалы и методы 324
Реактивы 324
Методы 327
Методы исследования и методики к разделу 2 330
Конструирование модельного дуплекса и исследование 330
внутрикомплексного фотоиндуцированного взаимодействия
арилазидных групп с функциональными группами биополимеров
Реагенты основе и-азидоанилина и (4-азидофенил)-Лг-алкиламина 335
Реагенты на основе и-азидофенилфосфата 338
Реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты 340
Реагенты на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты 350
Взаимодействие фотоактивируемых аналогов биотина со 354
стрептавидином
Методы исследования и методики к разделу 3 355
Синтез производных олигонуклеотидов 355
Синтез арилазидных производных нуклеозид-5'-трифосфатов для 360
получения фотоактивируемой ДНК и РНК
Флуоресцентная гибридизация in situ 365
Фотоаффинная модификация репликативного комплекса вируса 366
клещевого энцефалита
4.3.5. Фотоиндуцированное взаимодействие арилазидных производных 367
олигонуклеотидов с белками хроматина
ПРИЛОЖЕНИЯ 368
ВЫВОДЫ 371
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 374
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 418
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей работе использованы символы и сокращения в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (ШРАС), Международного Союза биохимиков (ШВ), а также следующие обозначения:
є-ABA-Lys-TPHK- еМ-(азидобензоил)лизил-тРНК ALABdCTP -5-[М-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-т/?анс-3-аминопропенил-1]-
дезоксицитидин-5'-трифосфат
АРЕ 1 -апуриновая/ апиримидиновая эндонуклеаза 1
АРТР - л-азидофенилтиофталимид
ATPyS - аденозин-5'-^-тио-трифосфат
В ATDHP -М-бромацетил-і'- {2,3 -дигидрокси-3 -[3 -(3 -трифторметилдиазирин-3 -
ил)фенил] пропионил} этил ендиамин
BER -эксцизионная репарация основания
Bicine - Л^-бис(2-гидроксиэтилглицин)
Вое - mpem-бутилоксикарбонильная группа
BrdUTP -5-бромдезоксиуридин-5'-трифосфат
CTD -С-концевой домен наибольшей субъединицы РНК полимеразы II
DCC - Л'Д'-дициклогексилкарбодиимид
DMF - А^УУ-диметилформамид
DMSO - диметилсульфоксид
dNTP - дезоксинуклеозид-5'-трифосфат
EDC - Л^-(3-диметиламинопропил)-Лг'-этилкарбодиимид
FAB-11-dUTP -5-{Лг-[Л/,-(4-азидо-2,3,5,б-тетрафторбензоил)-6-аминогексаноил]-/ира»с-3-
аминопропенил-1}-3'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-13-dUTP -5-{Л/-[Лг-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-8-аминооктаноил]-/иранс-3-
аминопропенил-1 }-3'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-4-ddUTP -5-[#-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-транс-3-аминопропенил-1]-2',3'-
дидезоксиуридин-5 '-трифосфат FAB-4-dUTP -5-[Лг-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-транс-3-аминопропенил-1]-3'-
дезоксиуридин-5'-трифосфат FAB-9-dUTP -5-{Л:-[Лр-(4-азидо-2,3,556-тетрафторбензоил)-4-а.минобутирил]-/77ранс-3-аминопропенил-1} -3 '-дезоксиуридин-5 '-трифосфат
FABCdCTP -э\'50-Л^{[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденамино)-оксиметил-
карбониламино]-этил}-дезоксицитидин-5'-трифосфат FABdCTP -эоо-7^-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-этиламино]-
дезоксицитидин-5'-трифосфат FABGdCTP -зя*зо-ІУ-{[4-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденгидразинокарбонил)-
бутил]-карбониламино}-дезоксицитидин-5'-трифосфат FABOdCTP -ЭА:зо-Л^-{[4-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминооксибутил)]-
окси} -дезоксицитидин-5 '-трифосфат FAP-7-dUTP -5-{ЛЦ#'-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-2-аминоэтионил]-
транс-3-аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат FAP-8-dUTP -5-{Лг-[Л^'-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]-
транс-Ъ -аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат
FEN-1 -флэп-эндонуклеаза-1
Gnd.HCl - гуанидиний хлорид
gp -gene product (кодирующие белки репликативного комплекса)
HEPES - Л^-(2-гидроксизтил)-пиперазин-іУ'-(4-бутансульфоновая кислота)
/-РгзРпЗОгСІ - хлорангидрид 2,4,6-триизопропилбензолсульфокислоты
IRES - Internal Ribosomal Entry Site («внутренний сайт посадки рибосомы»)
Mops - 3-(Лг-морфолино)пропансульфоковая кислота
MsCOCl - хлорангидрид 2,4,6-триметилбензойной кислоты МАВ-11^иТР-5-{Лг-[А^'-(2-нитро-5-азидобензоил)-6-аминогексаноил]-транс-3-
аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат NAB-12-dUTP-5-{ЛL[Л/''-(2-нитpo-5-aзидoбeнзoил)-7-aминoгeптaнoил]-7?фaнc-3-
аминопропенил-1} -2 '-дезоксиуридин-5 '-трифосфат КАВ-13-гїиТР-5-{Л4Л^Ч2-нитро-5-азидобензоил)-8-аминооктаноил]-т;?анс-3-
аминопропенил-1} -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфат NAB-2-dUTP -5-[Л/-(2-нитро-5-азидобензоил)-аминометил]-2'-дезоксиуридин-5'-
трифосфат NAB-4-dUTP —5-[Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-т/»анс-3-аминопропенил-1]-2'-
дезоксиуридин-5 '-трифосфат N АВ -7-dUTP —5 -{N-[N '-(2-нитро-5 -азидобензоил)-2-аминоэтионил] -транс-Ъ -аминопропенил-1} -2'-дезоксиуридин-5 '-трифосфат
NAB-8-dUTP—5-{Лг-[Л^'-(2-нитро-5-азидобензоил)-3-аминопропионил]-т/7днс-3-аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат
NAB-9-dUTP—5-{Л^-[//'-(2-нитро-5-азидобензоил)-4-аминобутирил]-/иранс-3-
аминопропенил-1}-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат
NABdCTP -экзо-Л^-[3-(2-нитро-5-азидобензамидо)-этиламино]-дезоксицитидин-5'-
трифосфат
NS - неструктурные белки
NTP -нуклеозид-5'-трифосфат
PARP-1 - поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1
PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток
Pfp - перфторфенильная группа
РЬзР - трифенилфосфин
PTHBEDS -8-(2-пиридил)-8'-{Л7-[3-(3-трифторметилдиазирин-3-ил)бензоил]-
аминоэтил}дисульфид
(РЬО)гРОСІ - хлорангидрид дифенилфосфорной кислоты
(PyS)2 - 2,2'-дипиридилдисульфид
Pyr-6-dUTP -5-{тУ-[4-(1-пиренил)-этилкарбонил]-3-амино-транс-пропенил-1}-2'-
дезоксиуридин-5'-трифосфат
RFC - репликативный белок С человека
RPA - репликативный белок А человека
s4dUTP - 4-тиодезоксиуридин-5'-трифосфат
SRP - сигнальная последовательность секреторных белков
ТВР - ТАТА-связывающий белок
TES - А^-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота
TFII - транскрипционные факторы группы II
TFIII - транскрипционные факторы группы III
Tricine - Лг-трис(гидроксиметил)метилглицин
Tris - трис(гидроксиметил)аминометан
Tte ДНК-полимераза - ДНК-полимераза из экстремально термофильной бактерии Thermus
thermophilus В-35
АТФМД-тРНК- арил(трифторметил)диазирин-меченая тРНК
БХ - бумажная хроматография
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ИОХ - ионообменная хроматография
MKA - моноклональные антитела
н.о. - нуклеотидное основание
ОТ ВИЧ - обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека
ОФХ - обращеннофазовая хроматография
САР - транскрипционный фактор активации транскрипции на /ас-промоторе
СМЕС - Л^-циклогексил-ТУ'-Р-(4-метилморфолиний)-этилкарбодиимид
СПЭВ - культивируемые клетки фибробластов почки эмбриона свиньи
СТМА - М-цетил-ТУ, ./ЧЛ'-триметиламмоний
СТС - JV-(3 -диметиламинопропил)-іУ '-циклогексилкарбодиимид
ТФУ - трифторуксусная кислота
ФИТЦ - флуоресциин
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Светлой памяти моего отца и Учителя
Сергея Ивановича Черникова
посвящается
Введение к работе
Настоящая работа выполнена в рамках научного направления - «Исследование биологических структур, обеспечивающих хранение генетической информации и экспрессию генов, и разработка методов направленного химического воздействия на эти структуры». Она является оригинальным исследованием (с 1986 г. по 2006 г.), направленным на развитие одного из информативных методов физико-химической биологии - метода фотоаффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и их комплексов. Особое внимание в работе уделено изучению химических аспектов фотоаффинной модификации белков в связи с тем, что этот вариант биоспецифической модификации имеет очевидное преимущество, так как его использование открывает перспективу для изучения динамики функционирования надмолекулярных структур.
Репликация, транскрипция, биосинтез белка протекают с участием сложных надмолекулярных структур, состоящих из белков и нуклеиновых кислот (НК). Структуру белково-нуклеиновых комплексов изучают с помощью инструментальных методов, в первую очередь таких как рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Однако привлечение ЯМР-спектроскопии для изучения надмолекулярных структур ограничено чувствительностью метода и недостаточной разрешающей способностью, в силу чего этим методом практически невозможно выявить роль отдельных нуклеотидных и аминокислотных остатков при взаимодействии таких больших молекул как компоненты белково-нуклеинового комплекса.
Самым информативным методом исследования пространственного строения природных соединений является метод рентгеноструктурного анализа, который позволяет получать исчерпывающие данные о координатах атомов в молекуле и тем самым обеспечивает определение конфигурации каждого фрагмента молекулы и анализ ее конформации. Однако чаще всего данный метод невозможно применить для исследования нуклеопротеидных комплексов из-за того, что далеко не всегда можно получить кристаллы белок-нуклеиновых или белок-белковых комплексов, пригодные для кристаллографических исследований с высоким разрешением. В первую очередь это касается надмолекулярных комплексов эукариот. К тому же, методом РСА можно изучать пространственную организацию молекулярных структур лишь в кристаллическом
состоянии, хотя для понимания процессов, протекающих in vivo, гораздо более интересным является установление конформации молекул в растворе.
Достигнутые в последнее десятилетие значительные успехи в структурном анализе РНК- и ДНК-полимераз [1-6], рибосом и их функциональных комплексов с мРНК и тРНК [7-15] уже более прицельно ставят задачи, связанные с детальным изучением динамических процессов, в которых участвует ферменты и белки матричного биосинтеза. Ясно, что с использованием только метода рентгеноструктурного анализа достичь этих целей не удастся в силу сложности и динамичности названных систем. На сегодняшний день подходом, с помощью которого может быть получена детальная информация о структурно-функциональной топографии надмолекулярных комплексов, является метод химического аффинного сшивания. Именно ковалентное связывание белков с НК-лигандами открывает уникальную возможность фиксации белково-нуклеиновых комплексов, в том числе малостабильных, в определенном структурном состоянии. Многими исследователями предлагается использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА. Таким образом, значимость таких подходов и, в первую очередь, аффинного химического сшивания для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов не осталась в «дорентгеновской» эре. Эти методы востребованы и в настоящее время [16-24].
Для аффинной модификации белков чаще всего используют аналоги НК, содержащие различные реакционноспособные группировки в гетероциклических основаниях или углеводном остатке, на концевой или межнуклеотидной фосфатных группах. Особое место в арсенале химических реагентов занимают фотоактивируемые аффинные реагенты на основе ароматических азидов. Под действием облучения арилазидная группа превращается в высокореационноспособную частицу (нитрен), которая может атаковать соседние группы атомов с образованием ковалентной связи между контактирующими партнерами. Идентификация образованного продукта "фотосшивки" позволяет судить о структурной организации белково-нуклеинового комплекса, а также о динамике функционирования системы. В связи с этим, конструирование и синтез фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов является одной из приоритетных задач биоорганической химии.
Несмотря на широкое использование арилазидных реагентов в молекулярно-биологических исследованиях, эксперименты по фотоаффинной модификации белков обычно заканчиваются получением данных одно- или двумерного гель-электрофореза с определением белков, по которым прошла модификация. Отсутствие информации о природе образующейся химической связи не всегда позволяет экспериментатору выбрать
оптимальный путь и условия для выделения и анализа модифицированных белков. Это приводит к тому, что в случае лабильных связей утрачивается ценная информация об окружении реагентов в области связывания. Кроме того, из-за малой изученности природы продуктов модификации определенных аминокислотных остатков и механизмов их образования, подбор специфического реагента для каждого конкретного случая часто является недостаточно обоснованным. Фотохимические превращения арилазидных реагентов исследованы, как правило, для модельных соединений в неводных средах, т. е. в условиях, далеких от условий проведения фотоаффинной модификации белков и их комплексов. В связи с этим, полученные данные не могут объяснить ряд фактов, свидетельствующих о протекании в водных растворах реакций после прекращения облучения системы [25-28]. На момент начала выполнения настоящей работы единственной группой фотоаффинных реагентов, для которых была выявлена природа долгоживущпх интермедиатов, были производные и-азидоанилина. Ранее, авторами работ [29, 30] было показано, что при облучении в водных растворах и-азидоанилина и его нуклеотидных производных накапливаются соединения с хиноидной структурой, которые, являясь электрофилами, могут взаимодействовать с нуклеофильными группами белков. Отсутствие информации по механизмам фотолиза в водных растворах для других арилазидных реагентов не только затрудняет интерпретацию результатов фотоаффинной модификации биополимеров, но и в значительной степени сдерживает поиск «универсальных» арилазидных групп, т. е. таких, которые бы при возбуждении светом в ближнем ультрафиолетовом диапазоне могли бы с высокой эффективностью модифицировать разнообразные функциональные группы биомолекул.
Таким образом, изучение механизмов фотовзаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков представляет собой актуальную задачу, поскольку ее решение обеспечит развитие метода фотоаффинной модификации нуклеопротеидных комплексов - перспективного подхода не только для установления структуры и функции биополимеров и их комплексов, но и для направленного воздействия на них.
Цель настоящей работы - установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и разработка новых подходов к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.
Задачи, на решение которых было направлено настоящее исследование:
изучение фотохимических превращений разного типа ароматических азидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров для выявления возможных вторичных, т. е. «темновых», процессов с их участием;
установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков;
дизайн и синтез новых фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для решения конкретных молекулярно-биологических задач.
Результаты проведенных исследований изложены в двух разделах диссертационной работы. Порядок появления разделов не связан ни с хронологией, ни с относительной важностью раздела. В разделе 2 представлены результаты исследований по установлению механизмов фотоиндуцированного взаимодействия ряда арилазидных реагентов, в основном, из числа широко используемых для фотоаффинной модификации белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, с боковыми радикалами аминокислот. Особое внимание уделено проблеме «темновых» процессов при фотоаффинной модификации белков.
Результаты, полученные при детальном исследовании процессов фотолиза ароматических азидов в водных растворах, и установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков не только проливают свет на механизмы фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами, но и представляют несомненную практическую ценность. Они позволяют сформулировать на качественном уровне некоторые зависимости направления фотоиндуцированных реакций арилазидных реагентов от строения субстрата (аминокислотного остатка) и типа заместителей в арильном кольце азида. Это способствует осознанному выбору фотоактивируемой группы при конструировании фотоактивируемого реагента.
В разделе 3 описаны подходы к созданию высокоэффективных фотоаффинных реагентов - арилазидных производных нуклеиновых кислот, способных реагировать с определенными типами функциональных групп белков в составе надмолекулярных комплексов. Разработанные подходы пост-синтетической селективной дериватизации монозамещенных концевых фосфатных групп олигонуклеотидов, в настоящее время нашли широкое применение в работах других научных коллективов, в том числе и зарубежных (например, [31]). Результаты работы, приведенные в разделе 3, демонстрируют то, как потенциал, заложенный при конструировании реагентов,
реализуется при изучении некоторых белково-нуклеиновых комплексов матричного биосинтеза.
В рамках данной работы впервые осуществлен ферментативный синтез
ДНК-дуплексов, содержащих арилазидные группы в С-5 положении дезоксиуридинов
обеих цепей ДНК, благодаря использованию 5-[3-()-(4-азидо-2,3,5,6-
тетрафторбензамидо)-пропенил-1 ] -2' -дезоксиуридин-5' -трифосфата в качестве
фотоактивируемого аналога элонгирующего субстрата в полимеразной цепной реакции с 7а#-полимеразой. Это представляет практический интерес, например, для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-аптамеров, так как использование такого типа дезоксинуклеозид-5'-трифосфата позволяет исключить стадию пост-селекционной модификации . аптамера. Предложено новое направление использования арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.
По материалам диссертации опубликовано 23 статьи, 2 обзора, 20 тезисов докладов.
