Введение к работе
Актуальность проблемы. Генетически кодируемые биосенсоры в последнее десятилетие стали одним из основных инструментов, используемых при исследовании живых систем. В соответствии с названием, эти технологии основаны на полном кодировании всех необходимых сенсорных свойств генами этих белковых структур. В основном в качестве таких биосенсоров используются недавно открытые флуоресцирующие белки (ФБ) семейства GFP. В 2008 году за цикл работ по этой тематике была присуждена Нобелевская премия по химии. Все оптические свойства различных представителей семейства GFP кодируются генетически. Далее генетическая информация реализуется с помощью автокаталитических посттрансляционных реакций, в результате которых из аминокислот синтезируются различные по структуре хромофоры, определяющие спектральные свойства каждого конкретного ФБ. В целом, все эти свойства позволяют проводить различные манипуляции с генами ФБ с целью получения сенсоров с заданными свойствами.
В последнее время на основе ФБ созданы клеточные сенсоры на ионы Са +, Си +, Zn , СГ, а также Н2О2, сАМР, активность клеточных киназ, протеаз, GTP-аз. В настоящее время рассматривается возможность применения этой технологии в медицине для изучения молекулярных механизмов различных заболеваний в масштабе целого организма. Однако существующие на данный момент флуоресцентные маркеры характеризуются множеством недостатков и требуют существенного усовершенствования. В большинстве случаев, практическое применение биосенсоров на основе ФБ требует модификации их свойств и разработки новых измененных (мутантных) вариантов, существующих в мономерной форме и обладающих высокой яркостью, повышенной скоростью созревания хромофора, фотостабильностью. Для практического применения ФБ в медицине необходимо создание вариантов белков со спектрами, смещенными в длинноволновую область. Конструирование мутантных вариантов ФБ с эмиссией в дальне-красной и инфракрасной области спектра (650 - 900 нм) позволит преодолеть клеточную автофлуоресценцию, а также подавить рассеяние и поглощение света живыми тканями, что, в свою очередь, может привести к разработке флуоресцентных маркеров нового поколения для изучения молекулярных процессов в масштабе целого организма.
Многообещающие перспективы применения ФБ в биотехнологии и медицине обусловили сдвиг основных исследовательских акцентов в прикладную область. Однако, помимо практического применения, флуоресцентные белки семейства GFP несомненно представляют собой значительный фундаментальный интерес как объекты белковой
химии и энзимологии. К моменту начала данной работы существовал постулат о хромопротеинах, как о сложных белках, образующихся путем соединения обычного белка (апобелка) с простетической группой небелковой природы. ФБ семейства GFP нарушают эти представления, поскольку для образования хромопротеина в данном случае не требуется присутствия простетической группы и хромофор ФБ синтезируется автокаталитически из собственных аминокислот внутри белковой молекулы.
Особую актуальность представляют исследования механизмов автокаталитических посттрансляционных модификаций ФБ, поскольку эти знания позволят управлять процессом, корректируя или изменяя направление реакций и таким образом получать новые флуоресцентные маркеры с необходимыми свойствами. До сих пор конструирование клеточных маркеров со спектрами, смещенными в длинноволновую область, проводилось по пути случайного введения мутаций в белок с последующим поиском мутантов с искомыми свойствами среди огромного числа полученных вариантов. Изучение посттрансляционных модификаций белков семейства GFP, таким образом, является актуальной и научно значимой фундаментальной проблемой, решение которой будет способствовать разработке новых рациональных подходов в создании флуоресцентных маркеров с заданными свойствами. Дальнейшее применение этих знаний позволит создать флуоресцентные маркеры нового поколения с эмиссией в дальне-красной и инфракрасной области для биотехнологии и медицины.
Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось изучение молекулярных факторов, определяющих спектральные характеристики белков семейства GFP. Особое внимание было уделено исследованию посттрансляционных реакций, которые приводят к синтезу различных по структуре хромофоров, а также изучению стереохимических особенностей строения белка, которые определяют его уникальные свойства, включая характеристики цветового спектра и ключевые аминокислотные остатки, ответственные за синтез хромофоров и спектральные сдвиги этих белков. Нужно было понять, является ли изменение химической природы хромофора необходимым условием при переходе от одной цветовой группы ФБ к другой и если это так, то какие типы структур хромофоров характерны для определенных цветовых групп. Альтернативным вариантом могли быть различия во взаимодействиях с аминокислотными остатками, окружающими хромофор, которые также могли определять фотофизические свойства этих белков. Таким образом, установление химической структуры хромофора и его взаимодействий с окружением представляли особый интерес. Ставилась также задача выявить и охарактеризовать основные интермедиаты автокаталитического синтеза различных хромофоров, а также
понять, каким образом ФБ в отсутствие каких-либо экзогенных кофакторов синтезирует хромофор из собственных аминокислот.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе впервые детально исследованы молекулярные основы спектрального разнообразия белков семейства GFP. В результате проделанной работы показано, что посттрансляционные модификации, приводящие к синтезу различных по структуре хромофоров, используются этими белками в качестве инструмента для «грубой» настройки фотофизических свойств (в пределах 100 нм и более) на определенный спектральный диапазон. «Тонкая» настройка ФБ (в пределах ~ 30 нм) на определенную длину волны осуществляется за счет различных нековалентных взаимодействий хромофора с его аминокислотным окружением.
Установлено, что, несмотря на исключительное спектральное разнообразие, ФБ семейства GFP используют достаточно консервативные химические механизмы для приобретения этих свойств. Все без исключения ФБ используют структуру П-ГБИ в качестве исходного блока в синтезе хромофора. Впервые показано, что в дальне-красных белках, как и в DsRed, структура п-ГБИ дополнительно модифицирована ацилиминным заместителем, за счет которого происходит расширение л-электронной системы хромофора и спектры приобретают дополнительный сдвиг (-110 нм) в длинноволновую область.
В работе также впервые показано, что ацилимин, являясь довольно реакционноспособной группой, может вступать в дополнительные посттрансляционные реакции, что в свою очередь может служить дополнительным источником спектральной вариабельности. Так хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Ammonia sulcata образуется в результате посттрансляционной реакции гидролиза ацилиминзамещенного п-ГБИ и, таким образом, является производным хромофора DsRed-типа. За счет нуклеофильной реакции по ацилимину также, по-видимому, образуется хромофор в белке zFP538.
Открыта новая посттрансляционная реакция хромофора белков GFP-семейства. Показано, что белок z2FP574 из Zoanthus sp.2 подвергается окислению-декарбоксилированию, и эта реакция является необходимым условием для перехода белка из зеленого флуоресцентного состояния в красное. Также, впервые показано, что превращение бесцветного нефлуоресцирующего аналога aceGFP-G222E в зеленую флуоресцирующую форму происходит в результате реакции УФ-зависимого окисления хромофора.
Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о посттрансляционных модификациях белков семейства GFP. Информация о ковалентных модификациях хромофора и структурных детерминантах, соответствующих определенной цветовой группе белков, может быть использована для изменения или оптимизации оптических свойств ФБ с дальнейшей целью рационального подхода в создании флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами для живых систем. В будущем, применение флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами, внесет весомый вклад в развитие методик, используемых в медицине для изучения молекулярных механизмов множества заболеваний, включая такие как рак, нарушения связанные с генными дефектами и т.п.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных и российских конференциях, в том числе: на Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной памяти академика Ю.А. Овчинникова, (Москва 2004, 2006), 30-м Конгрессе FEBS - 9-ой конференции IUBMB (Будапешт, 2005), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007, Казань, 2010, Петрозаводск, 2011), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), конференции «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm» (США, 2007), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), П-ой Национальной конференции «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, 2009), 34-м Конгрессе FEBS (Прага, 2009), XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2010), П-ой Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева (Москва, 2010), VIII-ой Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2010), VI-м Съезде Российского фотобиологического общества (Краснодарский край, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 статьи в российских и международных рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 191 страницы, 31 рисунок 9 схем и 17 таблиц. Список литературы включает 456 источников.
Вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений и методов исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в
обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены лично автором или под его научным руководством, при непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов.
