Содержание к диссертации
Введение
1. Особенности взаимодействия фактора транскрипции NF-кВ С участками узнавания в ДНК 10
1.1. Функционирование и роль NF-кВ В клетке 10
1.2. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом рентгеноструктурного анализа 19
1.3. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК в растворе 37
1.3.1. Использование метода химической модификации для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. 37
1.3.1.1. Химическая модификация ДНК 37
1.3.1.2. Химическая модификация аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-кВ 38
1.3.2 Использование мутантных форм белка для определения аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-KB, принимающих участие в связывании ДНК и димеризации 40
1.3.3. Использование метода аффинной модификации белка реакционноспособными аналогами ДНК для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с кВ-участком 47
2. ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков 53
2.1. Анализ белково-нукленновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК 57
2.2, Аффинная модификация остатков цистенна белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове 67
2.2.1. Использование ДНК'дуплексов, содержащих единичные 2'-дезокси-2'- йодацетамидоуридиновые звенья, для аффинной модификации белков 68
2.2.1.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичной 2'-йодацетамидной группировкой 70
2.2.1.2. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицыNF-KB 72
2.2.2. Использование ДНК-дуплексов с единичными 2 -дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями для аффинной модификации белков. 79
2.2.2.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями 79
2.2.2.2. Ковалентное связывание ДНК-дуплексов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями с гомодимером р50 субъединицы NF-KB 81
2.2.3. Использование ДНК-дуплексов, содержащих мелснуклеотидные фосфорилдисульфидпые группировки, для аффинной модификации белков 90
2.2.3.1. Синтез и свойства фосфорилдисульфидсодержащих олигонуклеотидов 90
2.2.3.2. Комплексообразование и ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов с гомодимером р50 субъединицы NF-KB 98
2.2.3.3. Ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов с ДНК-метилтрансферазой SsoII 102
2.3. Аффинная модификация остатков лизина белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки вуглеводофосфатном остове 106
2.3.1. Использование ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-0~(2-оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья, для аффинной модификации белков 109
2.3.1.1. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-альдегид-содержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-KB 109
2.3.1.2. Ковалентное связывание 2'-альдегидсодержащих ДНК-лигандов с ДНК-метилтрансферазой SsoII. Исследование возможности одновременного участия С-коицевой (метилирующей) и N-концевой («регуляторной») областей M.SsoII во взаимодействии с ДНК 119
3. Экспериментальная часть 125
Выводы 139
- Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом рентгеноструктурного анализа
- Химическая модификация ДНК
- Использование ДНК'дуплексов, содержащих единичные 2'-дезокси-2'- йодацетамидоуридиновые звенья, для аффинной модификации белков
- Синтез и свойства фосфорилдисульфидсодержащих олигонуклеотидов
Введение к работе
Нуклеиново-белковые взаимодействия являются определяющими для основных процессов, протекающих в клетке - репликации, транскрипции и трансляции ДНК, а также при процессинге РНК. Структуру НК-белковых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и молекулярпо-биологических подходов: направленной замены определенных аминокислотных остатков белка и ковалентного связывания белков с НК. Безусловно, наиболее достоверная информация о структуре НК-белкового комплекса может быть получена методом РСА, однако выделение и кристаллизация соответствующего комплекса возможны далеко не всегда. Кроме того, РСА часто не позволяет выявить конформациошгые перестройки белков при их взаимодействии с НК и влияние нуклеотидной последовательности участков НК, фланкирующих участок связывания белка. ЯМР-спектроскопия, один из методов изучения динамики белково-нуклеиновых комплексов в растворе, не всегда может быть использована для изучения сложных мультисубъединичных комплексов, а также в том случае, когда в процессе взаимодействия происходит значительное изменение структуры биополимеров. Направленная замена определенных аминокислотных остатков белков является мощным и активно используемым методом анализа НК-белковых взаимодействий, однако он весьма трудоемок и в ряде случаев дает некорректную информацию из-за изменения структуры биополимеров, вызванной заменой функциональных остатков аминокислот.
В ряду молекулярно-биологических подходов важное место занимает метод ковалентного связывания белка с НК. Существует ряд задач, для решения которых этот метод на сегодняшний день представляется оптимальным. Прежде всего, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты белка, взаимодействующие с заданным фрагментом НК в НК-белковом комплексе [1-5]. При изучении мультибелковых комплексов, образующихся при репликации, трансляции и т.п., возможно определение белкового компонента, взаимодействующего с определенным участком НК [6]. Этот подход может использоваться для поиска в клеточных экстрактах белков, селективно взаимодействующих с определенной нуклеотидной последовательностью, а также в технологии SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) для создания олигонуклеотидов специфической первичной структуры (НК-аптамеров), необратимо связывающихся с белком [7, 8]. В последние годы достигнуты определенные успехи в кристаллизации ковалентно связанных НК-белковых комплексов и изучении их структур методом РСА [9]. Авторы подчеркивают, что ковалентное взаимодействие ферментов нуклеинового обмена с НК является уникальной возможностью получения комплексов в определенном структурном состоянии и предлагают использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА.
В настоящее время наиболее широко используется фотоаффинная модификация белков, в основе которой лежит ковалентное связывание немодифицированных или модифицированных нуклеиновых кислот с белками под действием УФ-излучения [10-13]. Однако, из-за неспецифичности взаимодействия, происходящего при облучении УФ-светом, данный метод вряд ли можно признать универсальным. Кроме того, для него также характерны низкие выходы НК-белковых конъюгатов и деструкция биополимеров.
Химические методы присоединения белков к НК основаны на использовании неспецифических агентов, например, формальдегида [14-16], а также на селективном введении в состав белка или НК реакциошюспособных группировок. В последнем случае основное внимание уделяется использованию модифицированных НК для зондирования белково-нуклеиновых контактов, т.е. определения аминокислот, сближенных с нуклеиновой кислотой в участке специфического связывания [17]. Возможность вводить активную группировку в любое заранее выбранное положение олигонуклеотидной цепи позволяет зондировать точечные контакты между различньши участками биомолекул. Оптимальные для ковалентного связывания НК-реагенты должны обладать рядом характерных свойств: селективно взаимодействовать со сближенными в пространстве функциональными группами аминокислот белка; образовывать устойчивый конъюгат с белком без дополнительной активации извне при физиологических значениях рН (6,0-8,0); сохранять стабильность в нейтральных водных растворах в течение длительного времени без потери реакционной способности.
Химически активные группы могут быть введены в любое положение НК -гетероциклическое основание и различные участки углеводофосфатного остова. Однако следует отметить, что наиболее часто используемая модификация гетероциклических оснований может нарушать как комплементационные взаимодействия в НК, так и специфические взаимодействия в белково-нуклеиновом комплексе. В тоже время, введение химически активных групп по концевым фосфатным группам не несет полезной информации о структуре НК-связывающего центра белка, так как аффинной модификации чаще всего подвергаются его нефункциональные участки.
Известно, что контакты между белком и углеводофосфатным остовом НК составляют более половины всех взаимодействий в белково-нуклеиновом комплексе и вносят существенный вклад в его устойчивость и структурную организацию. В связи с этим для изучения особенностей функционирования ДНК-узнающих белков и ферментов необходимо создание ДНК-лигандов с модифицированными межнуклеотидными фосфатными группами и углеводными остатками. Наиболее перспективным представляется введение в состав синтетических олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов различных реакционноспособных группировок, способных селективно взаимодействовать с остатками лизина, аргинина или цистеииа, реализующими большую часть контактов белка с углеводофосфатным остовом ДНК [18]. Подобные ДНК-реагенты представлены пока малочисленным классом соединений, к числу которых можно отнести дуплексы с межнуклеотидными замещенными пирофосфатными и ацилфосфатными группировками [19-25], а также диальдегидсодержащие аналоги НК [26, 27].
В настоящей работе было проведено всестороннее исследование возможности использования для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-йодацетамидные, 2'-дисульфидсодержащие, 2'-02-оксоэтильные и межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки. Важной особенностью предложенных ДНК-лигандов является то, что модифицированные уридиновые или цитидиновые звенья могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи. Реакционноспособные группировки в составе 2'-йодацетамид-, 2'-дисульфид- и фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов способны селективно взаимодействовать с тиогруппами пространственно сближенных остатков цистеина белков, а 2'-0-2-оксоэтильная группировка ДНК-лиганда - подвергаться нуклеофилыюй атаке со стороны Е-аминогрупп остатков лизина.
В процессе работы предложенные ДНК-лиганды применяли для аффинной модификации двух ДНК-узнающих белков: гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека и прокариотической ДНК-метилтрансферазы SsoII (M.SsoII), входящей в систему рестрикции-модификации Shigella sonnei 47. Следует отметить, что для фактора транскрипции NF-кВ в литературе имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплексов с различными последовательностями участка узнавания ДНК. Сравнение данных РСА с результатами аффинной модификации позволяет оценить целесообразность использования тех или иных типов ДНК-лигандов для изучения структурно-функциональных аспектов взаимодействия различных белков, в частности M.SsoII, с углеводофосфатным остовом участка узнавания в ДНК. Для M.SsoII отсутствуют данные
РСА ее комплексов с ДНК, однако, известно, что в составе этого белка присутствуют два различных ДНК-связывающих центра, обуславливающие способность M.SsoII выступать, с одной стороны, как С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза, а с другой - как фактор транскрипции, связывающийся с «регуляторным» участком, локализованным в промоторнои области генов системы рестрикции-модификации SsoII. При отсутствии данных РСЛ метод аффинной модификации белка предложенными реакционноспособными ДНК-лигандами позволял нам проверить способность M.SsoII формировать комплекс, в состав которого входит как участок метилирования, так и «регуляторный» участок, а также выявить некоторые особенности, сопровождающие образование такого комплекса.
Работа содержит литературный обзор, посвященный особенностям взаимодействия фактора транскрипции NF-кВ с участками узнавания ДНК, изученным с помощью различных методов.
Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом рентгеноструктурного анализа
В 1995 году различными авторами были опубликованы две работы по РСА комплексов гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ с олигонуклеотидными дуплексами, содержащими кВ-участок [94, 95]. В работе [94] с разрешением 2,3 А была исследована структура комплекса между гомодимером ДНК-узнающего участка (39-364 аминокислотный остаток) субъединицы р50 NF-кВ мыши, в который входит RHR, и ДНК-дуплексом, образованным палиндромным олигонуклеотидом: 5 -GGGAATTCCC-3 ((И-кВ)-участок). Отметим, что такой «идеальный» кВ-участок не встречается в промоторных областях генов in vivo, но эффективно связывается с гомодимером р50 фактора транскрипции NF-кВ. ПО данным РСА вторичная структура кВ-участка ДНК в комплексе с белком практически не отличается от канонической структуры В-формы ДНК. Узнавание ДНК гомодимером р50 осуществляется за счет полипептидных петель, которые соединяют (3-структуры в белке. Всего у гомодимера имеется десять петель (по пять у каждой субъединицы), которые взаимодействуют с ДНК в основном со стороны большой бороздки. При этом каждая из субъединиц димера преимущественно взаимодействует с одним из тяжей кВ-участка. Структура исследованного комплекса напоминает бабочку, телом которой является ДНК, а крыльями - белковые домены (рис. 1.8). Подобный тип ДНК-белкового узнавания ранее был обнаружен для некоторых эндонуклеаз рестрикции П-го типа и белка р53 [96], хотя размер полипептидных петель и число их специфических контактов с ДНК значительно меньше. Согласно данным РСА, RHR белка р50 сложен в два белковых домена. N-концевой домен (39-240 аминокислотный остаток) принимает участие в связывании с ДНК, а С-концевой (249-350 аминокислотный остаток) ответственен за димеризацию и также играет важную роль в связывании с ДНК. N-концевой и С-концевой домены RHR соединены своеобразным линкером - последовательностью из 10 аминокислотных остатков, которая играет существенную роль в конформации комплекса, образуя изгиб в районе остатка Рго243. Данная аминокислота вместе с Lys241 расположена в центре большой бороздки ДНК и взаимодействует с центральным остатком аденина в кВ-участке узнавания. Пять пептидных петель из каждой субъединицы (LI, L2, L3, L4, L5), включая линкер (L3), объединяются, образуя обширную поверхность специфических контактов с гетероциклическими основаниями в большой бороздке ДНК и углеводофосфатным остовом ДНК.
Предложенная модель согласуется с данными работы [30], согласно которой для связывания с ДНК фактору транскрипции NF-кВ необходим весь RHR. Схема контактов аминокислотных остатков гомодимера р50 с ДНК (по данным работы [94]) представлена на рис. 1.9. Обращает на себя внимание большое количество контактов белка с углеводофосфатным остовом ДНК. Двенадцать из 18-ти межнуклеотидных фосфатных групп в (Ы-кВ)-участке вовлечены во взаимодействие с р50 NF-кВ, причем каждая из них контактирует как минимум с одним аминокислотным остатком белка. Оставшиеся 6 межнуклеотидных фосфатных групп (по три в каждой цепи) находятся на концах кВ-участка (рис. 1.9). Отсутствие контактов белка с этими фосфатными группами компенсируется контактами двух аминокислотных остатков аргинина каждой из субъединиц р50 с гуанинами на концах кВ-участка. Всего с ДНК взаимодействуют 16 положительно заряженных групп боковых цепей аминокислотных остатков р50, из которых все, кроме остатков Lysl44 и Lysl45, поддерживаются при помощи белковой структуры в большой бороздке ДНК. Два дополнительных контакта гомодимера р50 с межнуклеотидными фосфатными группами кВ-участка обеспечиваются иминогруппами пептидных связей остатков Lysl44 каждой из субъединиц. Центр димеризации субъединицы р50 NF-кВ гидрофобен и образуется с участием боковых групп семи аминокислотных остатков петель L4 и L5 С-концевых доменов (Val251, Туг267, Leu269, His304, Phe307, Ala308, Val310) (рис. 1.10, а). Он окружен солевыми мостиками, образованными Arg252 и Arg305 с Asp254, Asp302 и Glu265. Необходимо отметить, что аминокислотные остатки, участвующие в димеризации р50, являются консервативными для всех белков семейства NF-KB/Rel (рис. 1.10, б) [97]. В работе [95] с разрешением 2,6 А была исследована структура комплекса между гомодимером ДНК-узнающего участка (2-366 аминокислотный остаток) субъединицы р50 NF-кВ человека и ДНК-дуплексом, образованным самокомплементарным олигонуклеотидом, содержащим кВ-участок из энхансера генов первой группы основного комплекса гистосовместимости (МНС): 5 -GGGGAATCCCC-3 . По данным авторов работы [95], наличие некомплементарной пары А/А в центре кВ-участка практически не влияет на сродство гомодимера р50 NF-кВ К ДНК. Структура ДНК-белкового комплекса, описанная в работе [95], в целом похожа на структуру, описанную в работе [94], но и имеет ряд отличий. В полученной структуре RHR также представляет собой два белковых домена, причем оба домена принимают участие в связывании с ДНК, а С-концевой домен ответственен также за димеризацию, механизм которой совпадает с описанным в работе [94] (рис. 1.10, а). Схема контактов гомодимера р50 с кВ-участком МНС приведена на рис. 1.11. Следует отметить, что аминокислотные последовательности ДНК-связывающих участков RHR белков р50 мыши и человека гомологичны, различие наблюдается лишь в порядковых номерах соответствующих аминокислотных остатков (порядковые номера аминокислотных остатков р50 NF-кВ человека больше на три по сравнению с соответствующими им порядковыми номерами аминокислотных остатков р50 мыши). Поэтому в целях упрощения интерпретации результатов по аффинной модификации мы использовали для обоих белков общую нумерацию аминокислотных остатков, принятую для р50 NF-кВ мыши. Контакты аминокислотных остатков С-концевого домена белка р50 с углеводофосфатным остовом ДНК закрепляют димер и располагают его над центром кВ-участка. Из рис. 1.11 видно, что в образовании водородных связей и электростатическом взаимодействии с межнуклеотидными фосфатными группами в ДНК участвуют боковые группы остатков Lys272, Gln274, Arg305 и Gln306.
Боковая группа Рго243 из пептидной последовательности, связывающей N- и С-концевой домены, контактирует с дезоксирибозой. Аминокислотные остатки N-концевого домена белка р50 также взаимодействуют с ДНК (рис. 1.11). Фосфатная группа в положении (-1) образует три водородные связи: с NH-группой пептидной связи Lysl44 и функциональными группами боковых цепей Туг57 и Htsl41, а s-аминогруппа боковой цепи Lysl44 контактирует также с фосфатной группой в центре кВ-участка. Гуанидиновые группы боковых цепей Arg54 и Arg56 петли L1 так же, как и в структуре, описанной в работе [94], взаимодействуют с ДНК путем образования водородных связей с гуанинами в положениях 3 и 4, соответственно. Функциональная группа боковой цепи GIu60 поддерживает боковые цепи Arg54 и Arg56 за счет образования водородных связей с этими остатками, а также контактирует с гетероциклическими основаниями цитозинов в положениях 2 и 3. С одной стороны структурного элемента Arg54-Arg56-Glu60 располагается остаток His67, имидазольная группа которого находится в межплоскостном ("стэкинг") взаимодействии с гуанидиновыми группами боковых цепей Arg54 и Arg56 и образует водородную связь с гуанином в положении 5. С другой стороны этого элемента располагается гидроксильная группа Туг57, образующая водородную связь с межнуклеотидной фосфатной группой в положении (-1). В работе [94] сделано предположение, что элемент Arg54-Arg56-Glu60 петли L1 играет решающую роль в специфическом узнавании кВ-участка ДНК, образуя контакт с консервативным для всех нуклеотидных последовательностей кВ-участка блоком (G/C)(G/C) (GG-кором) (рис. 1.9, стр. 21). В работе [95] предполагается, что С-копцевая часть основной ДНК-узнающей петли L1 р50 субъединицы NF-кВ, содержащая три аминокислотных остатка лизина (Lys74, Lys76 и Lys77), также может быть вовлечена в формирование дополнительных контактов с углеводофосфатным остовом ДНК за пределами кВ-участка. Авторы работы [98] провели сравнительный анализ исследованных с помощью РСА структур комплексов гомодимера р50 с двумя различными кВ-участками ДНК [94, 95]. На рис. 1.12 суммированы возможные ДНК-белковые контакты, реализующиеся в составе этих двух комплексов.
Химическая модификация ДНК
Для определения контактов гомодимера субъединицы р50 фактора транскрипции NF-KB человека с межнуклеотидными фосфатами и гуаниновыми основаниями в кВ-участке авторы работы [113] изучали влияние статистического алкилирования ДНК на связывание с р50, В качестве субстрата был использован 26-звенный ДНК-дуплекс, содержащий кВ-участок из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (Ig-кВ: 5 -GGGACTTTCC-3 ). После статистической модификации нитрозоэтилмочевиной, дуплекс, содержащий Р-метку, инкубировали с белком р50 и образующийся ДНК-белковый комплекс отделяли от несвязавшейся ДНК электрофорезом в ПААГ в неденатурирующих условиях (метод "торможения в геле"). Связавшуюся и несвязавшуюся с белком ДНК выделяли из геля, обрабатывали 0,1 М гидроксидом натрия (рН 13,2) для определения положения этилированных межнуклеотидных фосфатных групп или 1 М водным пиперидином (рН 12,5) для определения положения этилированных остатков гуанина и анализировали методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Установлено, что все остатки гуанина и фосфатные группы (Ig-KB)-y4acTKa вовлечены во взаимодействие с белком (рис. 1.21). Полученные результаты свидетельствуют о важности 5 -концевых остатков гуанина кВ-участка для образования комплекса р50 с ДНК и находятся в соответствии с данными РСА [94, 95]. Однако данные о том, что наиболее важные контакты димера р50 с межнуклеотидными фосфатными группами находятся на концах кВ-участка не совпадают с данными РСА, согласно которым аминокислотные остатки р50 взаимодействуют с фосфатными группами в центре участка узнавания. Следует отметить, что метод модификации ДНК с использованием нитрозоэтилмочевины дает возможность получить для исследуемой полинуклеотиднои последовательности картину распределения некоторых контактов с ДНК-узнающим белком, однако не позволяет определить аминокислотные остатки белка, взаимодействующие с ДНК. 1.3.1.2. Химическая модификация аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-KB В работе [50] метод химической модификации использовали для определения остатков лизина гомодимера р50 NF-KB человека, контактирующих с кВ-участком H2TF1 ДНК. Белок, содержащий дополнительную С-концевую последовательность (GKPIPNPLLGLDST), обрабатывали цитраконовым ангидридом (ангидридом 2-метил-г/мс-бутадиеновой кислоты) в присутствии или в отсутствие ДНК (схема 1.1). Модификации подвергались только остатки лизина, не связанные с ДНК. ДНК-белковый комплекс разрушали и модифицированные остатки лизина необратимо ацетилировали в присутствии ацетата iV-гидроксисукцинимида (схема 1.2). После кислотного деблокирования цитраконилированных остатков лизина, белок был подвержен действию эндопротеазы, расщепляющей только немодифицироваиные остатки лизина.
Анализ продуктов расщепления проводился методом гель-элекрофореза в денатурирующих условиях. Затем поводили "блоггинг" с антителами, специфичными к дополнительной аминокислотной последовательности р50 (см. выше). Далее по молекулярным массам вступающих в реакцию с антителами пептидных фрагментов и данным о положении остатков лизина в белке были определены модифицированные ацетатом Лґ-гидроксисукцинимида остатки лизина. Согласно полученным результатам, остатки лизина в положениях 74-77, 144-146 и 272-275 образуют контакты с ДНК в составе комплекса гомодимера р50 с дуплексом, содержащим участок узнавания H2TF1. Для определения аминокислотных остатков цистеина гомодимера р50 NF-кВ человека, контактирующих с ( -кВ)-участком, белок, связанный с ДНК, модифицировали йодацетатом натрия [114]. ДНК-белковый комплекс формировали, пропуская р50 NF-KB через колонку с иммобилизованным кВ-содержащим дуплексом. Затем добавляли йодацетат натрия. Алкилирование остатков цистеина производными йодуксусной кислоты происходит за счет нуклеофилыюй атаки тиогруппы остатка цистеина по атому углерода йодацетата, который находится в а-положении по отношению к двойной связи углерод-кислород и одновременно связан с атомом галогена (схема 1.3). В составе комплекса (p50)2 (Ig-K.B) модификации подвергались только не участвующие во взаимодействии с ДНК остатки цистеина р50. После элюции белка с колонки за счет повышения концентрации NaCl в Na-боратном буфере проводили дополнительную модификацию р50 йодацетатом, содержащим радиоактивно меченный 14С. Теперь алкилирование происходило только по тем остаткам цистеина, которые ответственны за связывание ДНК.
Модифицированный белок р50 подвергали трипсинолизу и анализировали продукты протеолитического расщепления методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Среди тридцати хроматографических пиков пептидов, полученных после трипсинолиза, шесть содержали метку 14С, причем 66% всей радиоактивности приходилось на три пептида, имеющих в своем составе остаток Cys59. Определение аминокислотной последовательности этих трех пептидов методом Эдмана подтвердило, что метку 14С содержал именно аминокислотный остаток Cys59. Полученные в работах [50] и [114] результаты подверждали данные PC А комплексов гомодимера р50 с участками узнавания в ДНК [94, 95], согласно которым, выявленные методом химической модификации белка остатки лизина и цистеина действительно задействованы в процессе связывания кВ-содержащих дуплексов. 1.3.2. Использование мутантных форм белка для определения аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-кВ, принимающих участие в связывании ДНК и димеризации Для определения областей NF-кВ, вовлеченных в процессы димеризации и связывания ДНК, авторами работы [115] были сконструированы химерные белки, представляющие собой комбинацию субъединиц р50 и RelA человека (рис. 1.22). Известно, что белки семейства NF-кВ связываются с участками узнавания в ДНК в виде гомо- или гетеродимеров. Результаты работы [115] показали, что на способность химерных белков (рис. 1.22) димеризоваться влияли замены С-концевых аминокислотных остатков, а замены в N-концевой области не оказывали существенного влияния. Способность химерных белков связываться с участком узнавания в ДНК определяли методом "торможения в геле". В результате были выявлены аминокислотные последовательности р50 и рб5 субъединиц, определяющие специфичность их связывания с участком узнавания в ДНК. Так, белок, состоящий из 68 N-концевых аминокислотных остатков р50 и аминокислотных остатков RelA с 45 по 309 (p50(68)/RelA) проявлял при связывании различных последовательностей кВ-участка специфичность, характерную для р50. Второй белок RelA(216)/p50, состоящий из 216-ти N-концевых аминокислот RelA и аминокислотных остатков 274-377 р50, связывался с ДНК со специфичностью RelA. Белки ReIA(44)/p50 и p50(273)/ReIA вообще не связывались с ДНК. Причиной, вероятно, послужили конформационные перестройки, сопровождающие проведенные аминокислотные замены. Проведенная замена His64 на Arg в белке p50(68)/RelA повлияла на специфичность связывания этой химерной конструкции. Такой белок, в отличие от исходного, был спсобен образовывать комплексы с участками узнавания RelA. Полученный результат выявил определяющую роль аминокислотного остатка His64 р50 в обеспечении специфичности связывания р50 с определенными кВ-участками. Следует отметить, что области р50(Р40-G65) и RelA (P19-G44) имеют 73% гомологии - только 7 аминокислотных остатков отличаются в этих последовательностях белков (выделены жирным шрифтом):
Использование ДНК'дуплексов, содержащих единичные 2'-дезокси-2'- йодацетамидоуридиновые звенья, для аффинной модификации белков
Ранее способность тиоловых групп цистеина легко алкилироваться под действием йодацетамида была использованы в работе [158] для получения ковалентной связи между соответствующим производным олигонуклеотида и цистеинсодержащим пептидом. Йодацетамидная группировка вводилась на 5 -конец цепи ДНК в процессе ацетилирования йодацетангидридом аминогруппы в составе исходного 5 -аминогексильного производного олигонуклеотида. Важной особенностью реакции являлось проведение ее в слабощелочной среде (рН 8,3). В качестве исходных соединений для направленного введения в состав углеводофосфатного остова ДНК йодацетамидных группировок мы использовали синтетические олигонуклеотиды, содержащие единичные 2 -амино-2 -дезоксиуридиновые звенья (схема 2.2). Использование таких олигонуклеотидов-«предшественников» дает возможность получать ДНК-дуплексы, реакционноспособная группировка в которых пространственно сближена с определенным остатком цистеина в ДНК-белковом комплексе. Кроме того, в условиях проведения реакции ацилирования (водно-органическая среда, рН 8,3 [158]) 2 -аминогруппа присутствует в значительной степени в активной непротонированной форме (рКа 6,2 [168]), а экзоциклические аминогруппы гетероциклических оснований не подвергаются модификации. Модифицированный ДНК-дуплекс 18-1, не содержащий кВ-участка, служил негативным контролем связывания. Первое число в номере ДНК-дуплекса указывает на длину олигонуклеотидной цепи, содержащей химически активную группу, второе - на тип используемого ДНК-лиганда (см. стр. 3), а третье - на положение модифицированного звена в составе (Ig-кВ)- и (М-кВ)-участков с 5 -конца. Предложенный нами вид нумерации универсален и будет в дальнейшем применен для обозначения других ДНК-лигандов. Выбор мест введения 2 -дезокси-2 -йодацетамидоуридиновых звеньев в состав ДНК базировался на построенных ранее схемах взаимодействия гомодимера р50 субъединицы NF-кВ С участками узнавания различной первичной структуры (рис. 2.5), Согласно этим схемам, тиогруппа единственного остатка цистеина (Cys59), входящего в состав ДНК-связывагащего центра р50, сближена с 3 -фосфатными группами 7-ого нуклеотидного остатка (Ы-кВ)-участка и б, 7-ого нуклеотидного остатка (І5-кВ)-участка, соответственно.
Дополнительная модификация соседних нуклеотидных звеньев позволяла изучить региоспецифичность протекания реакции ковалентного связывания 2 -йодацетамидных производных ДНК с (р50)г NF-кВ И ВЫЯВИТЬ степень корреляции данных по распределению ДНК-белковых контактов, полученных с помощью метода РСА и аффинной модификации. 2.2.1.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичной 2 -йодацетамидной группировкой В качестве исходных соединений для синтеза модифицированной цепи 2 -йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов были использованы соответствующие синтетические олигонуклеотиды с единичными 2 -амино-2 -дезоксиуридииовыми звеньями nU, любезно предоставленые научным сотрудником Химического факультета МГУ к.х.н. Е.М. Зубиным: В результате реакции образовывалось соединение, обладающее меньшей подвижностью в геле, чем исходный олигонуклеотид 14-6 и его йодацетильное производное, и, по-видимому, представляющее собой конъюгат глутатиона и модифицированного олигонуклеотида (рис. 2.8, дорожка 5). Образование конъюгата происходит с количественным выходом и может служить доказательством высокой реакционной способности йодацетилировапных производных ДНК в реакции с цистеинсодержащими пептидами и белками. Дальнейшее изучение свойств олигонуклеотидов с единичными йодацетамидными группами показало, что данные соединения устойчивы длительное время при хранении в водном растворе при 5С, но деградируют при комнатной температуре в течение 10 дней примерно на 50%. Проведение в течение 1 ч тепловой денатурации-ренатурации йодацетилированного олигонуклеотида 14-6 в буфере А с рН 7,5 от 60С и 90С до 25С приводило к уменьшению количества модифицированного производного на 5% и 9% соответственно. В связи с этим, ДНК-лиганды типа I, используемые для аффинной модификации белка р50, получали непосредственно перед их использованием путем гибридизации йодацетилировапных олигонуклеотидов с комплементарными матрицами в буфере А (рН 7,5) при комнатной температуре в течение 1 ч. 2.2.1.2. Комплексообразование и ко валентное связывание 2 - йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-KB Способность 2 -йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов образовывать специфические комплексы с гомодимером р50 субъединицы NF-KB изучалась методом «торможения в геле». Суть метода заключается в том, что в процессе гель-электрофореза в неденатурирующих условиях комплекс белка с радиоактивно меченой ДНК сохраняется (по крайней мере частично), и его подвижность в геле существенно меньше, чем подвижность ДНК. Все модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие кВ-участки, также как и немодифицированные 15N и 14N эффективно связывались с гомодимером р50 субъединицы NF-кВ С образованием белково-нуклеиновых комплексов (выход продуктов комплексообразования составил более 80%) (рис. 2.9). Таким образом нами было показано, что введение 2 -дезокси-2 -йодацетамидоуридинового звена в положения 5, 6 и 7 (Ig-кВ)- и (И-кВ)-участков существенно не влияет на способность ДНК-лигандов связываться с гомодимером р50. Следует отметить, что неспецифический ДНК-дуплекс 18-1, не содержащий кВ-участка, не взаимодействовал с белком (рис. 2.9). Из рис. 2.10 видно, что только дуплексы 15-1-7 и 14-1-7, содержащие модификацию в 7-ом положении участка узнавания Ig-кВ или Id-кВ, эффективно взаимодействуют с гомодимером р50 субъединицы NF-кВ С образованием ковалентной связи. Выходы продуктов реакции составили 33% и 26% соответственно. Выходы остальных ДНК-белковых конъюгатов не превышали 6%. ДНК-дуплекс 15N, не содержащий реакционноспособную группировку в составе кВ-участка, не взаимодействовал с гомодимером р50, а выход продукта реакции ковалентного связывания в случае неспецифического ДНК-дуплекса 18-1 составил всего лишь 2%.
Параллельно мы исследовали возможность взаимодействия 2 -йодацетамидсодержащего дуплекса 15-1-7 с различными цистеинсодержащими белками. В качестве модельных белков были использованы ферменты нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII) и эндонуклеаза рестрикции SsoII (R.SsoII), а также фермент репарации - урацил-ДНК-гликозилаза (УДГ). Эти белки способны взаимодействовать с произвольной последовательностью ДНК с образованием неспецифических комплексов [129, 169, 170]. Реакции ковалентного связывания проводили в соответствующих буферах (см. экспер. часть) в течение 3 ч при 37С и анализировали в 12%-ном ДСН-ПААГ (рис. 2.11). Как видно из рис. 2.11, ни один из рассматриваемых ферментов не образовывал конъюгата с модифицированным дуплексом 15-1-7. Формирование ковалентной связи между 2 -йодацетамидсодержащей олигонуклеотидной цепью дуплекса 15-1-7 и белком наблюдалось только в случае гомодимера р50 субъединицы NF-KB. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что образование ковалентной связи ДНК-белок с участием 2 -йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов не только эффективно, но и высокоспецифично. Введенные в 2 -положение углеводофосфатного остова ДНК, данные группировки реагируют с нуклеофильной группой пространственно сближенного аминокислотного остатка только в составе специфического белково-нуклеинового комплекса. При проведении реакций ковалентного присоединения ДНК-дуплексов, содержащих химически активные группировки, к белкам и пептидам, особое внимание следует уделять проблеме селективности их связывания по отношению к определенным аминокислотным остаткам белка (пептида). Из литературных данных известно, что йодацетамид в определенных условиях способен алкилировать не только тиоловые группы цистеина, но и нуклеофильные группы остатков метионина, гистидина, лизина и аспарагиновой кислоты [171]. Данная способность зависит от рН реакционной смеси и особенностей микроокружения модифицируемого аминокислотного остатка в составе пептида или белка. Так, преимущественное алкилирование тиоловых групп цистеина наблюдается при проведении реакции в интервале значений рН от 7,5 до 8,5.
Синтез и свойства фосфорилдисульфидсодержащих олигонуклеотидов
Как показали эксперименты, при синтезе фосфорилдисульфидньгх производных по методу «2» лучше активировать меркаптокомпонент: 5 -меркаптопроизводные более склонны к окислению до 5 ,5 -дитиодимеров, чем олигонуклеотид-З -тиофосфаты до соответствующих 3 ,3 -дифосфорилдисульфидов [179]. Для получения 5 -дезокси-5 -меркаптопроизводных олигонуклеотидов в качестве исходных соединений были использованы 5 -дезокси-5 -тритилтиопроизводные соответствующих олигонуклеотидов. Тритильные группы удаляли 8,5 мМ раствором нитрата серебра согласно методике [180] с некоторыми модификациями. Лигирование фосфорилдисульфидсоставляющих компонентов 21-звенного олигонуклеотида 5 -ACGTTCCTGGCTApSSTTGACTGC-3 по методу «1» в присутствии 70 мМ перекиси водорода в буфере В (50 мМ MES, 20 мМ MgCb, рН 7,0) позволило получить продукты реакции, содержащие ФДГ, с выходами 5-10% (рис. 2.22, дорожка 3). В присутствии комплементарной тиофосфатному и меркаптосодержащему компонентам матрицы, сближающей реагирующие группы, выход олигонуклеотидов с ФДГ повышался до 80-85% (рис. 2.22, дорожка 4). Реакции проводили при 0С. Как показано ранее, одним из продуктов реакции образования ФДГ по методу «2» является 2-тиопиридон (схема 2,10), который имеет максимум поглощения при 343 нм (єз43=7060 NT см 1), т.е. в той области спектра, где не поглощают пуриновые и пиримидиновые основания нуклеиновых кислот и их компонентов. Следовательно, за протеканием реакции можно следить спектрофотометрически по количеству образующегося 2-тиопиридона. Данный подход ранее был предложен в работе [181] и использован нами для определения константы скорости реакции образования ФДГ в составе модельного олигонуклеотида 5 CGGTTCpSSCTGGCTCT-3 и изучения ее зависимости от рН среды. Для этого мы варьировали рН используемого буфера Г (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат натрия, 20 мМ MgCh). Ранее было показано [182], что присутствие ионов Mg+ повышает устойчивость олигонуклеотидов, содержащих дисульфидную группу, связанную с 5 -фосфатом, что особенно важно при их хранении. Реакция образования ФДГ в составе модельного олигонуклеотида по методу «2» проводилась при 25С.
В результате для каждого значения рН буферной смеси были получены отдельные кинетические кривые накопления 2-тиопиридона (рис. 2.23). Концентрацию выделившегося 2-тиопиридона (С) рассчитывали по формуле: С=А/(є 1), где А - оптическая плотность раствора реакционной смеси при 335 нм, є - коэффициент экстинкции 2-тиопиридона при 335 нм (7000 М_1сми), 1 -длина оптического пути (1 см). Константу скорости реакции образования ФДГ в составе модельного олигонуклеотида (кг) вычисляли по формуле: где Со(Х) и Co(Y) - начальные концентрации З -тиофосфорилированного и 5 -(2-пиридилдисульфид)содержащего компонентов олигонуклеотидной цепи, соответственно, С -концентрация 2-тиопиридона, выделившегося за время t. Далее были построены соответствующие графики зависимости от времени и по тангенсу угла наклона определены значения кг. На основании полученных данных была построена кривая зависимости Іпкг от значений рН реакционной смеси (рис, 2.24). Проведенные исследования показали, что с уменьшением рН скорость реакции образования ФДГ в составе олигонуклеотида по методу «2» возрастает. Так, например, при уменьшении рН от 7 до 4,5 константа скорости увеличивалась примерно в 60 раз. Зная приблизительные значения констант диссоциации функциональных групп, участвующих в образовании ФДГ, а также на основании данных статьи [181], мы предположили, что механизм реакции образования ФДГ, по-видимому, предполагает атаку моноаниона 3 -тиофосфорилированного компонента на монокатион 2-пиридилдисульфидного производного олигонуклеотида. Протонирование атома азота пиридинового цикла, вероятно, увеличивает электрофилыюсть атома серы, связанного с метиленовой группой олигонуклеотидного компонента и делает протонированный 2-тиопиридон лучшей уходящей группой (схема 2.12). Образование ФДГ в составе олигонуклеотида 5 CGGTTCpSSCTGGCTCT-3 по методу «2» в присутствии комплементарной матрицы протекало одинаково эффективно при всех значениях рН реакционной смеси в интервале от 4,5 до 7,8. Скорость реакции в этих условиях оказалась настолько велика, что рост оптической плотности при выделении 2-тиопиридона не удавалось детектировать спектрофотометрически, кинетическая кривая сразу выходила на плато (данные не показаны). Таким образом, нами было установлено, что для получения ФДГ-содержащего олигонуклеотида по методу «2» не требуется увеличивать время реакции, а достаточно уменьшить рН реакционной смеси или добавить в раствор комплементарную матрицу. Олигонуклеотиды, содержащие ФДГ, являются классом сравнительно новых соединений, отличительная особенность строения которых заключается в различной электрофильности атомов серы, входящих в состав дисульфидной группы. Предполагаемый Дополнительно нами были изучены свойства олигонуклеотидов, содержащих ФДГ, по отношению к действию таких низкомолекулярных пуклеофилов, как Е-аминогруппа аминокислоты лизина и тиоловая группа цистеина (табл. 2.6). Полученные данные позволяют предположить, что модифицированная группировка в составе ДНК-белкового комплекса будет преимущественно взаимодействовать с остатками цистеина белка, в то время как остатки лизина практически не будут вступать в реакцию.
Предполагаемый механизм расщепления ФДГ в составе ДНК под действием тиоловой группы цистеина (схема 2.13) был изучен на примере реакции взаимодействия олигонуклеотида 5 -ACCTCGGAAAGTpSSCCCCTCT-3 с глутатионом. Данный пептид, содержащий остаток цистеина, количественно расщеплял дисульфидную связь ФДГ, как в составе одноцепочечного олигонуклеотида, так и в составе соответствующего ДНК-дуплекса (рис. 2.25, дорожки 3, 4). Отметим, что в результате атаки тиоловой группы глутатиона происходил не только разрыв ФДГ, но образование соединения, обладающего меньшей подвижностью в геле, чем исходный 5 -дезокси-5 -меркаптокомпонент олигонуклеотидной цепи, и представляющего собой, по всей видимости, конъюгат пептида и данного компонента. Синтезированный олигонуклеотидопептид обладал той же подвижностью в геле, что и продукт реакции взаимодействия ФДГ-содержащего олигонуклеотида с глутатионом (рис, 2.25, дорожки 2 и 3, 4). Строение и идентичность выделенных из геля соединений бьши доказаны методом масс-спектрометрии в варианте MALDIOF (времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной матричной десорбции, «Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, Time Of Flight»), Полученные результаты представлены в табл. 2,7. Таким образом, показано, что атака тиоловой группы остатка цистеина пептида или белка направлена на электрофильный атом серы ФДГ, связанный с метиленовой группой олигонуклеотида (схема 2.13). Следовательно, для того, чтобы зафиксировать образование ковалентной связи между ДНК-лигандом Ш-го типа (стр. 53) и белком, необходимо использовать олигонуклеотидные дуплексы, меченные радиоактивным фосфором по 3 -концу модифицированной цепи (схема 2.15). В дуплексах 19-Ш-6 и 19-III-7 З -фосфатные группы 6го и 7го нуклеотидных остатков (Іе-кВ)-участка, соответственно, были заменены на ФДГ. Модифицированный дуплекс 21-111, содержащий в своем составе только половину кВ-участка, предполагалось использовать в качестве негативного контроля. Олигоиуклеотидные цепи, содержащие ФДГ, были синтезированы по методу «2» в буфере Г (рН 4,5) в отсутствие комплементарной матрицы (схема 2.12). Реакция полностью протекала за 30 минут при комнатной температуре и приводила к получению продуктов лигирования с выходами 95-98%. Последующее формирование химически активных ДНК-лигандов проводили в течение 1 ч при комнатной температуре, смешивая эквимолярные количества модифицированной цепи и комплементарной матрицы. При изучении методом УФ-спектроскопии термической устойчивости ФДГ-содержащих ДНК-лигандов, оказалось, что введение единичной pSS-группировки в состав немодифицированного ( -кВ)-содержащего дуплекса 19N понижало его температуру «плавления» на 2-3 С, т.е. приводило лишь к незначительной дестабилизации. Модифицированные дуплексы 19-III-6 и 19-III-7, также как и немодифицированный дуплекс 19N, эффективно связывались с гомодимером р50 субъединицы NF-KB И его мутантной формой (р50(С59А))г (выход продуктов комплексообразования составил более 80%). Неспецифический ДНК-дуплекс 21-Ш практически не взаимодействовал с белками (рис. 2.26).
