Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами (НК) является основополагающим фактором существования живой материи Анализ генома человека позволил предположить, что расположенные в нем нуклеотидные последовательности кодируют более 30000 белков По приблизительным оценкам 6% этих белков являются факторами транскрипции, 13,5% - способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами НК-связывающие белки играют ключевую роль в основных процессах жизнедеятельности клетки, таких как регуляция экспрессии генов, транскрипция, трансляция, репликация и репарация Исключительно важным для понимания этих процессов является изучение природы и механизмов образования комплексов белков с ДНК
Первый ДНК-связывающий белок был открыт в 1967 г (Gilbert et al, 1967) С тех пор методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА) было охарактеризовано более 400 комплексов белков с ДНК Анализ кристаллографических данных позволил не только выявить основные принципы ДНК-белковых взаимодействий, но и определить, каким образом белки узнают определенные последовательности в ДНК Однако даже современные возможности РСА и ЯМР не исключают применения других методов исследования НК-белковых взаимодействий Это связано с тем, что «взаимоотношения» между белками и нуклеиновыми кислотами носят динамический характер и могут сопровождаться значительными изменениями структуры биополимеров
В настоящее время наибольший вклад в понимание принципов НК-белкового узнавания вносит изучение сложных функционально зависимых мультибелковых комплексов, формирующихся при различных клеточных процессах В этих исследованиях незаменимыми оказываются методы направленного изменения структуры НК-лиганда, точечной замены определенной аминокислоты белка и ковалентного присоединения белка к НК, образующие группу так называемых биохимических подходов к исследованию механизмов функционирования НК-узнающих белков Указанные методы позволяют получать сведения об отдельных аспектах и деталях НК-белкового взаимодействия, например, установить белковый компонент, непосредственно связанный с определенным участком НК, выявить механизм передачи «сигналов», обеспечивающих согласованное функционирование биомолекул, зафиксировать контакты, существующие лишь короткое время в процессе ферментативного катализа или структурной перестройки объекта Таким образом, биохимические подходы сохраняют свою неизменную актуальность Их применение особенно эффективно в сочетании с анализом данных РСА, сравнением аминокислотных последовательностей белков, моделированием структуры белков и их комплексов с ДНК
Относительно короткие (10-30-звенные) синтетические фрагменты ДНК используются для изучения природных структур и процессов практически с того момента, как были разработаны эффективные методы их получения Развитие химии нуклеиновых кислот позволяет создавать новые типы модифицированных олигонуклеотидов, которые являются мощным инструментом в исследованиях различных аспектов взаимодействия ключевых ферментов и белков клетки с ДНК В
свою очередь, полученная с помощью синтетических ДНК информация может найти практическое применение для направленного воздействия на функционирование биологических систем
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в разработке комплексного подхода к исследованию ДНК-белковых взаимодействий в растворе Этот подход включает в себя детальный анализ взаимодействия ДНК-узнающего белка с синтетическими ДНК-лигандами различной первичной и вторичной структуры, зондирование групп атомов ДНК, вовлеченных в узнавание с белком, методами «отпечатков» и на основе данных по взаимодействию белка с модифицированными аналогами ДНК, выявление фрагментов белка, контактирующих с ДНК, методом ковалентного присоединения к лигандам, содержащим реакционноспособные группировки, и путем изучения свойств мутантных форм белков, моделирование ДНК-белковых взаимодействий
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи
1 Выбрать и охарактеризовать белки - объекты исследования, которые узнают в ДНК
последовательности различной длины, относятся к разным классам и участвуют в
процессах транскрипции, репарации, метилирования или гидролиза ДНК
Предложить оптимальный набор синтетических немодифицированных и модифицированных одно- и двуцепочечных фрагментов ДНК для изучения особенностей функционирования ДНК-узнающих белков
Сконструировать новые типы ДНК-лигандов с реакциошгоспособными группировками для региоселективного ковалентного присоединения к белкам с целью зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах и определения структурных особенностей последних
4 Разработать новые методики тестирования активности ферментов рестрикции,
модификации и репарации, методы контроля за ходом ферментативных реакций
Оптимизировать стратегию определения функциональных групп белка и ДНК,
вовлеченных во взаимодействие
5 Предложить общую схему зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах на
различных стадиях их образования
Научная новизна и практическая значимость работы. Предложена стратегия исследования ДНК-белковых взаимодействий в растворе, применимая к любому ДНК-узнающему белку независимо от размера и структуры узнаваемой им нуклеотидной последовательности Получены новые данные, позволяющие сделать выводы об особенностях функционирования р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ, урацил-ДНК-гликозилазы, ДНК-метилтрансферазы SsoII и эндонуклеаз рестрикции SsoII, PspGI, Mbol, EcoRII и Mval Перспективность разработанного нами комплексного подхода к изучению ДНК-белковых взаимодействий подтверждена данными РСА
Впервые для 30 ферментов рестрикции П-го типа, не являющихся изошизомерами, выявлены консервативные ДНК-связывающие мотивы, сделано предположение об эволюционной взаимосвязи между различными эндонуклеазами Н-го типа, предложен дивергентный сценарий эволюции Выявленные закономерности позволяют на базе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей эндонуклеаз рестрикции предсказывать структурные и функциональные особенности отдельных
представителей этого класса ферментов
Идентифицированы группы атомов участка метилирования ДНК и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции-модификации SSOlI, Существенные ДЛЯ формирования КОМПЛеКСОВ С С5-ЦИТ03ИН0В0Й
метилтрансферазой SsoII Предложена модель функционирования метилтрансферазы SsoII как белка, сочетающего в себе свойства фермента модификации и фактора транскрипции
Расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой для исследования механизмов действия ферментов рестрикции, модификации и репарации Продемонстрирована перспективность применения олигодезокси-рибонуклеотидов, содержащих остатки 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 1-(3'-дезокси-Р-В-трео-пентафуранозил)урацила, для структурного анализа комплексов урацил-ДНК-гликозилазы с ДНК
Получили развитие химические подходы к исследованию белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации белка синтетическими аналогами ДНК Установлено, что ДНК-лиганды, содержащие единичные фосфорил-дисульфидные или 2'-йодацетамидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка ДНК с 2'-0-2-оксоэтильными группами в участке узнавания белка позволяют фиксировать остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда Предложена структура дуплексов с реакционноспособной группировкой в определенном положении кВ-участка для необратимого ингибирования фактора транскрипции NF-kB
Впервые показана возможность выявления АР-эндонуклеазной активности с помощью ДНК, содержащих 1,3-пропандиол Предложены новые методы анализа степени метилирования каждой из цепей субстрата ферментами модификации, определения специфичности действия цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, непрерывного контроля за расщеплением ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции, экспресс-детекции активности ферментов репарации, рестрикции и модификации с помощью лигандов, закрепленных на полимерном носителе Два последних метода могут быть использованы для тестирования примесей неспецифических нуклеаз в препаратах целевых белков
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 2-5-ом рабочих совещаниях фирмы «New England BioLabs» по биологической модификации ДНК (Берлин, Германия, 1990, Вильнюс, Литва, 1994, Инсбрук-Игле, Австрия 1997) и «Рестрикция/Модификация» (Бристоль, Великобритания, 2004), на международном симпозиуме «Синтетические олигонуклеотиды прогресс и границы практического использования» (Москва, 1991), на конференциях FASEB «Эндонуклеазы рестрикции и модифицирующие метилтрансферазы структура и механизм» и «Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты» (Сакстон-Ривер, Вермонт, США, 1993, 1996), на XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 3-ей конференции ШВМВ «Молекулярное узнавание» (Сингапур, 1995), на VII конгрессе FAOBMB «Достижения в биохимии и молекулярной биологии» (Сидней, Австралия, 1995), на международном симпозиуме «Биокатализ-2000» (Москва, 2000), на 5-ой международной конференции по
изучению узнавания в нуклеиновых кислотах (NACON-V) (Шеффилд, Великобритания, 2001), на V-ом симпозиуме «Химия и биология нуклеиновых кислот» (Кембридж, Великобритания, 2003), на ежегодных рабочих встречах «Биохимия белково-нуклеиновых комплексов» и «Ферменты и мультиферментные комплексы, воздействующие на нуклеиновые кислоты» (Гиссен, Германия, 2002-2004, 2006, Москва, 2005)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 статей (5 обзоров) Объем и структура работы. Диссертация изложена на 479 страницах машинописного текста, содержит 192 рисунка, 64 таблицы, 27 схем Диссертация состоит из введения, главы «ДНК-узнающие белки - объекты исследования», обзора литературы на тему «Молекулярные аспекты взаимодействия белков с ДНК», обсуждения полученных результатов, заключения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (694 ссылки)
