Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
1. Технологии изготовления ДНК-микрочипов 8
1.1. Синтез олигонуклеотидов in situ 10
1.2. Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов 13
1.2.1. Методы модификации стеклянных подлооюек 16
1.2.2. Методы иммобилизации на полимерных подложках 23
1.2.3. Методы иммобилизагцш на полисахаридах 25
1.2.4. Методы определения поверхностной плотности аминогрупп 29
2. Детекция сигнала в гибридизационном анализе 32
2.1. Прямые методы 32
2.2. Детекция радиоактивных меток 33
2.3. Детекция ферментных меток. 33
2.4. Флуоресцентная детекция 35
3. Активные методы проведения гибридизационного анализа 37
4. Заключение и постановка задачи 41
3. Материалы и методы 42
1. Материалы и оборудование 42
1.1. Реактивы 42
1.2. Подложки 42
1.3. Олигонуклеотиды 43
1.4. Оборудование и программное обеспечение 44
2. Очистка стеклянных подложек. 44
3. Модификация стеклянных подложек в растворе 45
4. Модификация стеклянных подложек в газовой фазе 45
5. Щелочной гидролиз поверхности ПММА 45
6. Модификация поверхности ПММА действием ГМДА в растворе 46
7. Модификация поверхности ПММА действием паров ГМДА 46
8. Модификация поверхности полимеров действием олигомеров АПТЭС. 46
9. Измерение краевого угла смачивания поверхности водой 46
10. Определение плотности аминогрупп на поверхности активированных стекол 47
11. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности стеклянных и полимерных подложек. 47
12. Гибридизация олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов на микрочипах 48
12.1. Гибридизация комплементарных зондам олигонуклеотидов 48
12.1. Гибридизация продуктов ПЦР 49
13. Детекция биотиновой метки с помощью пероксидазной цветной реакции 49
14. Детекция флуоресцентной метки 50
15. Исследование стабильности активированных подложек и ДНК-микрочипов при хранении 50
16. Детекция с использованием суперпарамагнитных частиц 51
16.1. «Классический» метод 51
76.1. «Активный» метод 51
17. Определение отношения сигнал/шум 52
18. Изготовление полимерных пленок на подложках 52|
19. Определение неспецифической адгезии 52
20. Изготовление подложек с декстрановым покрытием 53
21. Изготовление ДНК-микрочипов на подложках с декстрановым покрытием 53
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Исследование ДНК-микрочипов на стеклянных подложках. 54
4.2. Изготовление ДНК-микрочипов на полимерных подложках. 66
4.3. Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе 75
4.4. Изготовление ДНК-микрочипов на подложках с декстрановым покрытием 84
Заключение 91
- Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов
- Активные методы проведения гибридизационного анализа
- Детекция флуоресцентной метки
- Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе
Введение к работе
Многие современные биохимические, генетические, фармацевтические и клинические анализы, анализы загрязнений окружающей среды и пищевых продуктов требуют проведения сотен и даже тысяч однотипных манипуляций. Вполне очевидными представляются тенденция к их автоматизации, а также стремление проводить такие манипуляции параллельно, сводя к минимуму затраты времени и расход реагентов. Среди ряда успешных решений этой задачи особо выделяется внедрение в практику биологических микрочипов — аналитических устройств, позволяющих одновременно выявлять множество специфических межмолекулярных взаимодействий с использованием минимальных количеств анализируемого материала. В настоящее время наибольшее распространение получили ДНК-микрочипы, принцип работы которых заключается в следующем. На поверхности чипа в определенных зонах фиксируются молекулы зондов, представляющие собой олигонуклеотиды или ПЦР-фрагменты, комплементарные анализируемым последовательностям ДНК-мишеней. Количество таких активных зон на микрочипе, в зависимости от его назначения, может составлять от нескольких десятков до сотен тысяч. В ходе анализа, называемого гибридизационным, несущие какую-либо метку фрагменты ДНК-мишеней образуют с молекулами зонда ДНК-дуплексы, которые идентифицируются с помощью специальных детекторов. ДНК-микрочипы могут быть использованы при определении патогенных микроорганизмов и вирусов, выявлении наследственных заболеваний, для обнаружения генно-модифицированных организмов (ГМО) в продуктах питания и т.д. [1,2].
С конца 80-х годов прошлого столетия многие научные коллективы занимаются проблематикой, связанной с производством ДНК-микрочипов, однако только небольшая часть этих работ получила практическое воплощение в виде коммерческих продуктов [3]. В нашей стране пионерами в данной области являются сотрудники ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН, разработавшие под руководством акад. А.Д.Мирзабекова гелевые биочипы, применяемые в настоящее время, в основном, в медицинской диагностике. Исследования, направленные на создание новых типов ДНК-микрочипов, ведутся также в ИХБФМ СО РАН в лаборатории проф. В.Ф.Зарытовой [4].
Тем не менее, объемы реального применения ДНК-микрочипов остаются небольшими и явно не соответствуют потенциальным возможностям этого аналитического инструмента. Основными причинами, препятствующими их широкому распространению, являются недостаточная воспроизводим ость отдельных стадий производства микрочипов [5], а также длительность анализа, достигающая нескольких часов [6]. Даже в такой области исследований как анализ уровня экспрессии генов, где ДНК-микрочипы к настоящему времени нашли наиболее широкое применение, периодически возникают сомнения в достоверности и воспроизводи мости получаемых результатов [7-10]. Следует отметить, что и традиционные методы детекции сигнала в гибридизационном анализе, использующие флуоресцентные, ферментные и другие метки, также не лишены определенных недостатков.
Создание тест-систем, основанных на применении ДНК-микрочипов, включает в себя несколько этапов: выбор нуклеотидных последовательностей мишеней, праймеров для их амплификации и комплементарных зондов; создание подложек и иммобилизация на них ДНК-зондов; выбор способа детекции сигнала и соответствующего детектора; отработка условий проведения анализа, включая оптимизацию процедуры пробоподготовки, амплификации анализируемых последовательностей, процесса гибридизации и последующих отмывок [11]. В последнем случае определенная сложность состоит в необходимости учета влияния на термодинамику и кинетику гибридизации таких факторов как свойства поверхности подложки, ее заряд и потенциал, плотность иммобилизации олигонуклеотидов и степень их пространственной доступности и др. [12, 13]. Настоящая работа направлена на решение некоторых из изложенных выше проблем и посвящена сравнительному изучению различных способов изготовления подложек для ДНК-микрочипов и иммобилизации на них олигонуклеотидов, а также разработке нового метода детекции сигнала в гетерофазном гибридизационном анализе.
Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов
Если говорить о разнообразных по своему назначению ДНК-микрочипах, то, несомненно, наиболее распространенным методом их изготовления является иммобилизация на поверхности.- предварительно синтезированных, фрагментов-, ДНК [39], которая по типу связи подразделяется на ковалентную или нековалентную [40]. При нековалентной иммобилизации ДНК-зонды могут удерживаться на подложке за счет специфических или неспецифических (как правило, электростатических) взаимодействий. Простейший пример последних — электростатическое взаимодействие отрицательных зарядов фосфатных остатков в олигонуклеотидах или продуктах ПЦР с положительными зарядами протонированных аминогрупп подложек, импрегнированных поли-Ь-лизином [41] или модифицированных АПТЭС [42]. Важно отметить,.что хотя= в этом случае молекулы зонда удерживаются на поверхности по всей своей длине [42], они сохраняют способность образовывать, ДНК-дуплексы, вероятно, вследствие последовательной равновесной десорбции с поверхности отдельных частей полинуклеотидной цепи. К недостаткам методов. неспецифической нековалентной иммобилизации следует отнести высокие значения фона инизкую эффективность гибридизации [16]; Наиболее ярким и едва ли не: единственным примером; специфичного нековалентного взаимодействия; которое лежит в основе многочисленных тест-систем, но редко: используется: для изготовления ДНК-микрочипов, является образование комплекса биотина с авидином (или стрептавидином) [43]. В то же время, учитывая чрезвычайную прочность такого комплекса, данное взаимодействие мало чем отличается от обычной ковалентной связи. В качестве подложек для ковалентного присоединения биомолекул применяются материалы самой разнообразной природы: стекло [44-49], кремний [50-53], различные полимеры [54-57], золото [58-65], графит [66]; и другие [16].
Химические реакции, используемые при иммобилизации, также многочисленны (см. рис. 2). Наибольшее образования амидных или фосфамидных связей [67, 68], протекающего в присутствии разнообразных конденсирующих агентов (например, водорастворимого гидрохлорида 1-этил-3-(3- диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) [67]), а также методы, основанные на реакции нуклеофильных групп (-NH2, -NHNH2, -SH и др.) с такими электрофилами как эпокси-группы [69, 70], изотиоцианатные группы [71], малеимидные фрагменты [53, 72] и др. Для формирования связей между двумя нуклеофильными группами, одна из которых находится на поверхности подложки, а вторая присоединена к фрагменту ДНК, активно используют гомобифункциональные (диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола, бисмалеимидогексан, гидрохлорид диметиладипимидата, дисукцинимидилглутарат и др.) и гетеробифункциональные (N- сукцинимидил-3- (2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-(4- иодоацетил)аминобензоат и др.) кросслинкеры [73-76]. В ряде работ особое внимание обращается на структуру и длину так называемых «линкеров» или «спейсеров», отделяющих олигонуклеотиды от поверхности чипа, что, как полагают, существенно для эффективной гибридизации [77, 78]. Последовательная конденсация специально подобранных соединений позволяют конструировать разветвленные «линкеры» (дендримерные структуры) с амплификацией функциональных групп, используемых для иммобилизации [78, 79, 80]. В последнее время исследуются весьма экзотические способы иммобилизации олигонуклеотидов [79-81], например, реакции типа "click chemistry", проходящие быстро в мягких условиях (как правило, в водных растворах) без катализатора. Примером этого может служить присоединение модифицированных ацетиленовым фрагментом олигонуклеотидов к поверхности, несущей азидные группы, в результате реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения (см. рис. 2) [82]. Однако подобные сложные методы иммобилизации представляют чисто теоретический интерес и вряд ли найдут реальное применение в широкомасштабном производстве ДНК-микрочипов. Среди прочих стратегий создания микрочипов стоит особо отметить метод, разработанный сотрудниками ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН и заключающийся в сополимеризации модифицированных алкеновыми фрагментами олигонуклеотидов с акриламидом на поверхности подложки [83-86]. Принципиальное отличие этого метода от всех других заключается в следующем. Вместо плоских активных зон с иммобилизованными на поверхности зондами в данном случае формируются трехмерные ячейки гидрогеля с олигонуклеотидами, распределенными по всему объему ячейки [87]. К достоинствам такого подхода обычно относят удаленность молекул зонда от поверхности, что, возможно, позволяет уменьшить влияние некоторых трудноконтролируемых факторов на процесс гибридизации, а также высокую гибридизационную емкость, на 3 порядка превышающую значение, наблюдаемое для обычных поверхностных микрочипов [88]. Недостатками рассматриваемого метода являются большая продолжительность стадии гибридизации, вследствие низкой скорости диффузии в геле, и большой избыток олигонуклеотидов, требуемый для эффективного протекания сополимеризации [86].
Кроме того, в литературе отсутствуют данные1 о» воспроизводимости данного метода, что не позволяет сравнить его с традиционными способами изготовления ДНК-микрочипов - по этому критерию. 1.2.1. Методы модификации стеклянных подложек К настоящему времени, наиболее распространенным материалом подложек при изготовлении ДНК-микрочипов является стекло прежде всего потому, что методы химической модификации его поверхности хорошо изучены. Для этих целей, как правило, применяются- стандартные микроскопные предметные слайды» размером 26x76x1 мм; изготавливаемые из листового стекла (диапазон оксидных составов: 71,7-72,8% Si02, 1,5-2,0% А1203, 6,7-8,6% СаО,- 3,5-4,1% MgO; 13,4-14,6% Na2Q, 0;1-1,3% К20 [89]). Влияние состава стекла на процессы- химической модификации его поверхности практически не изучено. Недавно было показано, что стекла с высоким содержанием магния имеют более развитую поверхность, и-, как следствие, демонстрируют более высокую эффективность иммобилизации биомолекул [90]. Имеется целый ряд других материалов, для которых применимы те же методы химической модификации, что и для. стекла. Здесь следует упомянуть широко используемый в микроэлектронике кремний [52, 91, 92], покрытый на воздухе оксидной пленкой, и слюду, представляющую собой слоистый алюмосиликат с ровной на атомарном уровне поверхностью сколов, что существенно при иммобилизации различных биомолекул, в том числе фрагментов ДНК, в атомно-силовой микроскопии [93-, 94]. В литературе описано использование аналогичных методов модификации покрытых оксидной пленкой металлических, в частности, алюминиевых поверхностей [95,96]; Первой стадией химической модификации указанных неорганических поверхностей является очистка:от механических и химических загрязнений, обеспечивающая прочность удерживания и равномерность формируемого покрытия. Для этих, целей используется множество различных способов; Наиболее распространенный - обработка окислительными смесями, такими; как хромовая смесь и "piranha" (смесь 30%-ного .пероксида водорода с концентрированной серной кислотой в объемном отношении 3:7), при этом последняя более: предпочтительна вследствие ее меньшей экологической опасности [97], а также действие растворов щелочей, вызывающее растворение верхнего слоя стекла.
Активные методы проведения гибридизационного анализа
Известно, что скорость процессов, протекающих в гетерофазных аналитических системах, к которым относятся и ДНК-микрочипы, лимитируется массопереносом реагентов к поверхности [158]. В результате, время анализа оказывается сравнительно большим - до 12 часов. Вместе с тем, существует возможность значительно ускорить проведение подобных анализов, а также повысить их чувствительность, если обеспечить быструю доставку аналита к поверхности микрочипа под действием какой-либо направленной силы. Такие методы проведения анализа носят название «активных» [164], а для ускорения массопереноса могут быть использованы, в частности, силы электрического [165] или магнитного [126] поля. Ускорение гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах действием электрического поля описано в работах [166] и [167]. С этой целью изготавливали ДНК-микрочипы, снабженные набором микроэлектродов, которые располагались непосредственно под активными зонами с иммобилизованными олигонуклеотидами. При приложении электрического поля находящиеся в растворе анализируемые фрагменты ДНК, являющиеся полианионами, электрофоретически двигались к положительно заряженным электродам на микрочипе. В итоге, гибридизация проходила за 15 секунд против нескольких часов в отсутствие электрического поля [167]. Было показано [166], что скорость гибридизации сильно зависит от состава буфера: хорошие результаты были достигнуты только при использовании цвиттер-ионных буферов с низкой проводимостью. Аналогичный эффект электрического поля был продемонстрирован также для иммунохимических анализов на белковых микрочипах [164]. Однако сложность изготовления микрочипов со встроенными электродами существенно ограничивает практическое применение рассматриваемого подхода. Применение магнитных сил вместо электрических обеспечивает дополнительные преимущества при проведении анализов на микрочипах «активным» методом. Во-первых, в этом случае проводимость подложки микрочипа не имеет значения, что позволяет использовать микрочипы более простой конструкции, не имеющие подводимых к активным зонам электродов. Во-вторых, применение магнитного мечения аналита предоставляет возможность совместить ускоренный массоперенос с детекцией сигнала, что обеспечивает дополнительное сокращение времени проведения анализа, а также простоту его технической реализации.
В качестве магнитных меток могут быть использованы суперпарамагнитные микрочастицы, которые являются коммерчески доступными препаратами, широко используемыми для очистки и концентрирования белков и нуклеиновых кислот [168, 169]. Они представляют собой наночастицы ферромагнетика (как правило, Рез04 или у-Ре2Оз), встроенные в полимерную (в большинстве случаев, полистирольную) матрицу, и могут иметь диаметр от 1 до 10 мкм. Благодаря особым магнитным свойствам однодоменных наночастиц ферромагнетика (суперпарамагнетизм), получаемые на их основе частицы не имеют остаточной намагниченности, что предотвращает их агрегацию в отсутствие магнитного поля [170]. В то же время, в магнитном поле такие частицы ведут себя как маленькие магниты, допуская их быстрое перемещение в требуемом направлении. Высокая удельная поверхность магнитных частиц, обусловленная их небольшим диаметром, может быть использована для иммобилизации биомолекул, допускающих специфическое связывание магнитных частиц с определенными маркерами [171, 172]. В частности, для очистки и концентрирования меченных биотином фрагментов ДНК широко применяются магнитные частицы, покрытые ковалентно удерживаемым стрептавидином, и позволяющие собрать на своей поверхности молекулы, содержащие биотиновый маркер, из сравнительно большого объема. Применение описанных выше суперпарамагнитных микрочастиц в качестве активных меток для иммунохимического анализа с использованием белковых микрочипов . детально описано в работах [126-129]. Было предложено [126] несколько экспериментальных методик проведения анализов на микрочипах «активным» методом с использованием магнитных частиц, в том числе, "push-pull" и центрифужное удаление. В основе этих методов лежит общий принцип: сначала поверхность микрочипа покрывается слоем микрочастиц, при этом в активных зонах формируются специфические взаимодействия между поверхностями магнитных частиц и микрочипа. Затем несвязавшиеся частицы удаляются. Различие перечисленных выше подходов состоит в природе и величине сил, под действием которых протекают указанные выше процессы. В случае наиболее быстрой и простой в техническом исполнении техники "push-pull" притягивание и удаление магнитных частиц осуществляется действием магнита. Также описано удаление несвязавшихся частиц с поверхности чипа под действием центробежных сил, контролируемых скоростью вращения центрифуги [126]. Наиболее совершенным методом проведения анализа на микрочипах с использованием магнитных частиц является сканирование в ламинарном потоке [126, 173].
В этом методе магнитные частицы притягиваются к поверхности микрочипа под действием магнитного поля и одновременно перемещаются вдоль поверхности в ламинарном потоке контролируемой скорости. Варьируя скорость потока, можно изменять значение гидродинамичеких сил, двигающих частицы по поверхности. При определенной скорости потока магнитные частицы задерживаются только в тех зонах микрочипа, где устанавливаются специфические взаимодействия. Благодаря возможности точного и плавного изменения силы, удаляющей частицы с поверхности, данный метод позволяет различать специфические взаимодействия по их механическим, а не термодинамическим характеристикам, открывая принципиально новые возможности тест-систем на основе микрочипов. Например, показана возможность различения между собой родственных антигенов, имеющих близкие значения констант связывания с антителом [129]. Как уже отмечалось, магнитные частицы могут не только содействовать ускоренной доставке аналита к поверхности микрочипа, но и являться детектируемой меткой. Детекция может основываться на светорассеянии магнитных частиц, благодаря чему они могут быть обнаружены простым оптическим микроскопом при темнопольном освещении [126]. Другой способ регистрации магнитных частиц основан на использовании сенсоров магнитного сопротивления [174], встроенных в поверхность микрочипа, но применение этого метода ограничено высокой стоимостью и сложностью изготовления таких микрочипов. Известны работы по применению магнитных частиц для детекции сигнала в гибридизационном анализе [175, 176], однако в этих исследованиях использовались микрочипы сложной конструкции с многослойным покрытием (меченные биотином олигонуклеотиды иммобилизовали на слое нейтравидина, удерживаемого на поверхности кремния, покрытого плазмохимически слоем нитрида кремния), малопригодные для практического применения. В то же время, проведение гибридизации на ДНК-микрочипах «активным» методом с использованием магнитных меток в литературе не описано.
Детекция флуоресцентной метки
В качестве флуоресцентной метки использовали краситель Су5, структура которого изображена на рис. 15 [177]. Детекцию сигнала осуществляли с помощью детектора ВАФ-1, разработанного компанией ММТех и любезно предоставленного в наше пользование. Полученные изображения обрабатывали с помощью программы Photoshop. Исследование стабильности активированных подложек и ДНК-микрочипов. Аминированные стеклянные подложки хранили в холодильнике при 6 С. Раз в 3 месяца отбирали по 3 подложки для иммобилизации олигонуклеотида NOS-P, как описано в п. 11, и проводили гибридизацию с комплементарным олигонуклеотидом NOS-Cy, как описано в п. 12, с последующей флуоресцентной детекцией. ДНК-микрочипы с иммобилизованным зондом NOS-P, изготовленные на стеклянных аминированных подложках, хранили при комнатной температуре или в холодильнике при 6 С. Раз в 3 месяца отбирали по 3 микрочипа из партий, хранящихся при двух указанных условиях, и проводили гибридизацию с комплементарным олигонуклеотидом NOS-Cy, как описано в п. 12, с последующей флуоресцентной детекцией. 16. Детекция с использованием суперпарамагнитных частиц. 16.1. «Классический» метод Для предотвращения сорбции магнитных частиц рабочие зоны поверхности микрочипа после гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом блокировали в течение 30 минут 2%-ным раствором BSA в 0,2xSSC. Блокирующий раствор удаляли и наносили суспензию магнитных частиц. Для одного кластера из 4 активных зон использовали 3 мкл смеси, содержащей 0,2 мкл 1%-ной суспензии магнитных частиц и 2,8 мкл 0,2xSSC. Непосредственно перед экспериментом магнитные частицы дважды промывали 0,2xSSC буфером. Под микрочип помещали редкоземельный магнит на 10 секунд для притягивания магнитных частиц к поверхности. Несвязавшиеся магнитные частицы удаляли с помощью другого магнита, снабженного коническим концентратором, таким образом, чтобы конец концентратора был погружен в раствор, но не касался поверхности подложки.
Далее микрочип помещали под микроскоп с темнопольным осветителем и получали изображение рабочей зоны чипа с помощью цифровой камеры. В этом методе 0,2 мкл 1%-ной суспензии магнитных частиц смешивали с 2,8 мкл раствора, содержащего различные концентрации NOS-B в 0,2xSSC. Смесь аккуратно перемешивали в течение двух минут и затем магнитные частицы со связанным олигонуклеотидом дважды промывали 0,2xSSC следующим образом: магнитные частицы собирали магнитом: на дне пробирки, супернатант аккуратно удаляли, добавляли новую порцию буфера, объемом; 20f мкл и ресуспендировали магнитные частицы. 3 мкл отмытой: смеси наносили; на\ ДНК-микрочищ предварительно; обработанный 2%-ным раствором-ВSА: в 0;2xSSC в. течение 30 минут. Под микрочип помещали редкоземельный магнит на 20 секунд для; притягиваниям магнитных. частиц к-поверхности.. Несвязавшиеся- магнитные: частицы- удаляли: с помощью-концентратора; как описано1 выше. Микрочип помещали: под микроскоп с: темнопольным: осветителем. Полученное изображение: фотографировали цифровошкамерой. 17..Определениеотношениясигнал/шум. Єигнал: и фон:определяли как, интенсивность,окраски; (дляшероксидазной, реакции), флуоресценции (в случае использования флуоресцентной метки); или рассеянного света (для магнитных частиц).; усредненную» по всей/ площади активных зон и области вне активных; ЗОНІ Изображениям оцифровывались и; анализировались с помощью программы-. Photoshop;. Интенсивности в; четырех идентичных активных зонах каждого кластера5: усредняли, и; по: результатам статистической, обработки соответствующих; областей изображения-рассчитывали;: среднее значение: (Mean)j т стандартное1 отклонение (ЄК0):, Єигнал считался достоверным;, если значение (среднишсигнал - средний; фон) /(ЄК0 фона) превышало 2,5;. 181 Изготовлениеполимерныхпленокнатодложках Навеску исследуемого полимера? массой: 10 ME растворяли в; 190? мкл воды, при 90 Є. Раствор полимера: вх количестве 50-, мкл наносили: на:: очищенную вплазме стеклянную подложку на площадь 5 см" и высушивали на.воздухе. 191Определениенеспецифинескойтдгезии Непосредственно» перед экспериментом: магнитные частицы дважды промывали дистиллированной водой: На поверхность полимерной пленки наносили 5 мкл смеси, содержащей 0,2 мкл 1%-ной суспензии магнитных частиц в воде. Под рабочую зону подложки на 10 секунд помещали магнит. Несвязавшиеся магнитные частицы удаляли с помощью другого магнита, снабженного коническим концентратором, так, чтобы конец концентратора был погружен в раствор, но не касался поверхности микрочипа. Далее микрочип помещали под микроскоп с темнопольным осветителем. Полученное изображение фотографировали с помощью цифровой камеры. 20. Изготовление подложек с декстрановым покрытием К раствору 300 мг п-толуолсульфохлорида в смеси 300 мкл пиридина и 300 мкл диметилформамида добавляли 100 мг порошка декстрана и суспензию выдерживали 24 часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Декстран отделяли центрифугированием, промывали дважды 500 мкл диметилформамида и растворяли в 300 мкл воды при 90-100 С. К полученному раствору добавляли 300 мкл 0,5 М раствора NaHC03 и сразу же наносили на поверхность аминированных стеклянных подложек, изготовленных, как описано выше.
Подложки с раствором выдерживали 12 часов при 37 С, тщательно отмывали водой и высушивали на воздухе. 21. Изготовление ДНК-микрочипов на подложках с декстрановым покрытием На подложку с декстрановым покрытием наносили раствор 50 мг п-толуолсульфохлорида в 200 мкл пиридина, выдерживали два часа при комнатной температуре, промывали этанолом и высушивали на воздухе. На полученные активированные подложки наносили микрокапли 5 мкМ раствора олигонуклеотида NOS-NH2 в 0,5 М NaHC03. Микрокапли объемом 0,2 мкл наносили с помощью ручной микропипетки. После выдерживания в течение 12 часов при 37 С во влажной атмосфере ДНК-микрочипы тщательно промывали водой и высушивали на воздухе. На первом этапе работы в качестве материала подложек для изготовления ДНК-микрочипов было выбрано стекло, поскольку методы введения на его поверхность различных функциональных групп хорошо разработаны. Достаточно подробно они рассмотрены в Главе 2. Вместе с тем, некоторые проблемы в этой области остаются неизученными или исследованными недостаточно. В частности, отсутствуют работы по оптимизации условий модификации, приводящих к получению стабильных подложек для изготовления ДНК-микрочипов, особенно с точки зрения их эффективности в гибридизационном анализе. До сих пор существенной проблемой при производстве ДНК-микрочипов остаётся низкая воспроизводимость отдельных его стадий [5]. Кроме того, считается, что срок хранения чипов с иммобилизованными на поверхности молекулами зонда не превышает двух месяцев, в противоположность гелевым биочипам, для которых этот срок составляет около одного года [88]. Очевидно, что для практического применения микрочипов требуется больший срок их хранения. В связи с этим была поставлена задача исследовать стабильность получаемых в различных условиях стеклянных подложек и ДНК-микрочипов на их основе. Химическая модификация стеклянных подложек включает две стадии: очистку поверхности стекла и формирование органосилоксанового слоя путем обработки поверхности алкилтриалкоксисиланами, несущими различные реакционноспособные группы [39].
Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе
Эффективность аналитических методов, основанных на применении микрочипов, критически зависит от способа детекции сигнала. Традиционные методы, основанные на использовании флуоресцентных, ферментных, радиоактивных и других меток, имеют существенные недостатки, подробно рассмотренные в Главе 2. Поэтому постановка задачи по разработке новых методов детекции, в частности, в гибридизационном анализе, кажется вполне обоснованной. Недавно в качестве метки при анализе белок-белковых взаимодействий на микрочипах были предложены суперпарамагнитные частицы, представляющие собой наночастицы оксида железа, встроенные в полимерную матрицу [126]. Диаметр таких частиц обычно составляет от 1 до 3 мкм, что позволяет им удерживаться на поверхности чипа небольшим числом специфических межмолекулярных взаимодействий: действующие на них силы инерции и гидродинамические силы сравнительно невелики. С другой стороны, такие частицы достаточно велики для их простой оптической регистрации. Преимущества этого метода детекции состоят, во-первых, в высокой чувствительности анализа (магнитные частицы могут обнаруживать единичные молекулы антигенов на поверхности микрочипа) и, во-вторых, в высокой скорости проведения анализа [178]. Задача настоящего исследования заключалась в том, чтобы изучить применимость аналогичных подходов для регистрации на ДНК-микрочипах дуплексов, образованных олигонуклеотидным зондом и комплементарным участком ДНК-мишени. В работе были использованы- покрытые стрептавидином магнитные частицы, способные прочно связываться с биотиновой меткой. Было предложено два способа проведения гибридизационного анализа с применением магнитных частиц. В первом способе, называемом «классическим», магнитные частицы обнаруживают меченные биотином фрагменты ДНК, гибридизованные с олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа. Во втором, «активном» способе, биотинилированные фрагменты анализируемой ДНК сначала связываются с покрытыми стрептавидином магнитными частицами, которые затем вступают в контакт с поверхностью микрочипа и удерживаются на ней за счет образования ДНК-дуплексов с зондами в области контакта.
Схема методов представлена на рис. 26. Минимальное число магнитных частиц, необходимое для анализа, можно оценить, учитывая, что для получения максимального сигнала необходимо полностью покрыть микрочастицами активные зоны микрочипа. При диаметре использованных в настоящей работе микрочастиц 1 мкм, для покрытия монослоем магнитных микрочастиц площади кластера из четырех активных зон (0,6 см ) необходимо около 2x10 частиц. В этом случае плотность удерживаемых на поверхности микрочипа частиц оказывается достаточной для того, чтобы активные зоны были видны невооруженным глазом (см. рис. 27(A)). Визуализация магнитных микрочастиц легко осуществляется в оптическом микроскопе с темнопольным осветителем, при этом регистрируется рассеиваемый микрочастицами свет. Такой способ получения сигнала, позволяющий регистрировать единичные микрочастицы, оказался достаточно чувствительным, чтобы обнаружить гетерогенность активных зон на микрочипе (см. рис. 27(Б, В)). Мы полагаем, что наблюдаемый эффект «яичницы» является следствием вариаций поверхностной плотности зондов, возникающих в результате частичного высыхания раствора олигонуклеотида в ходе иммобилизации. Чтобы оценить эффективность предложенных способов детекции, было проведено сравнение описанного выше «классического» способа детекции с традиционными, использующими флуоресцентные и ферментные метки, в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах, изготовленных на стеклянных аминированных подложках. С этой целью взятые в различных концентрациях олигонуклеотиды, меченные биотином или Су5, гибридизовали с комплементарными олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа и детектировали соответствующим методом. Во всех экспериментах гибридизация и последующие промывки проводились в идентичных условиях. Полученные изображения представлены на рис. 28, а результаты их анализа суммированы в табл. 7. Предел обнаружения определяли как концентрацию или количество аналита, при которых соотношение сигнал/шум составляло не менее 2,5, что соответствует доверительной вероятности 0,99. Из табл. 7 следует, что «классический» метод детекции с использованием магнитных частиц на 1-2 порядка более чувствителен по сравнению с традиционными способами. В этом случае сигнал оставался различимым при концентрации гибридизуемого олигонуклеотида до 1 пМ, в то время как сигнал при детекции флуоресцентной и ферментной меток исчезал при концентрации аналита 10 и 500 пМ, соответственно. Следует отметить, что предел обнаружения флуоресцентного метода был определен для конкретного детектора, разработанного компанией ММТех и предназначенного для проведения массовых анализов Интересной особенностью предложенного метода детекции является пороговый характер зависимости величины сигнала от концентрации анализируемых биотинилированных фрагментов ДНК.
Если поверхностная плотность аналита на поверхности микрочипа (в случае «классического» метода) или частицы (в случае «активного» метода) достаточно высока для установления нескольких связей между магнитной частицей и микрочипом, сила удерживания частицы и, соответственно, величина сигнала не зависят от плотности биотиновой метки на поверхности. При некоторой критической поверхностной плотности аналита число ДНК-дуплексов, удерживающих отдельные частицы, снижается до уровня, при котором действие магнитного поля может оторвать частицу от поверхности. Из табл. 7 следует, что динамический диапазон предложенного метода детекции не превышает двух порядков. Опубликованные данные по аналогичным исследованиям на белковых микрочипах демонстрируют существенный разброс значений динамического диапазона — от 2 до 10 порядков. Мы полагаем, что динамический диапазон зависит от прочности нагружаемых связей, а также величины силы, прикладываемой к магнитным частицам, и длительности ее приложения. Это предположение подтверждается данными, полученными в работе [126] для детекции мышиных антител IgG на белковых микрочипах, где динамический диапазон изменялся от 1 до 3 порядков в зависимости от использованного метода удаления несвязавшихся магнитных частиц, причем большие значения приложенной силы приводили к меньшему динамическому диапазону. Среди других способов проведения детекции магнитными частицами (проточная камера, центрифугирование, «магнитная щетка» [126]) мы выбрали схему "push-pull" как наиболее быструю и технически простую. Хотя динамический диапазон в наших экспериментах был небольшим, вероятно, вследствие больших значений прилагаемых сил в методе "push-pull", предложенные способы детекции могут быть вполне применимы для проведения качественного анализа на ДНК-микрочипах.
