Введение к работе
Актуальность темы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы являются ферментами, ответственными за точный синтез ДНК в живых клетках. К настоящему времени ДНК-полимеразы выделены из различных источников и биохимически достаточно хорошо охарактеризованы. Однако, несмотря на значительный прогресс в изучении этих ферментов, информация о природе взаимодействия, т.е. типе связей с матрицами и праймерами, в литературе практически отсутствует. До недавнего времени для исследования участков связывания матриц ДНК-зависимых полимераз в основном использовались классические методы, типа: центрифугирование ферментов с различными ДНК в градиенте плотности сахарозы или глицерина и анализ ингибирования реакций полимеризации модифицированными ДНК. Причем исследования первого рода носят в основном качественный характер, а интерпретация результатов ин-гибиторного анализа не всегда однозначна ввиду сложности анализируемой системы. Это требует развития для изучения полимераз новых подходов, адекватных рассматриваемым проблемам и требующих для проведения экспериментов минимальных количеств 5елка. Одним из достаточно перспективных методов исследования іерментов является аффинная модификация. С помощью этого под-:ода количественные характеристики комплексообразования фер-ентов с различными лигандами могут быть получены из зависи-остей скоростей инактивации фермента от концентрации аффин-ых реагентов и конкурентных им лигандов. Этот метод практи-ески не применялся для исследования ДНК-полимераз и пока не элучил широкого распространения для исследования других фер-энтов.
Цель работы. Основной задачей исследования было изучение :ханизма узнавания матриц ДНК-полимеразой I из E.coli, роли 'дельных структурных элементов матриц в их комплексообразо-.нии с ферментами. В задачу работы входил поиск (синтез) аф-нных реагентов для избирательной модификации матричного участка ДНК-полимеразы I.
Научная новизна и практическая ценность работы. Синтезирован ряд неописанных ранее Р-t -содержащих олигонуклеотидов, избирательно модифицирующих матричные участки фермента. С по-
мошью этих реагентов оценено сродство матричного участка фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (ФК) к различным лигандам, включая олигонуклеотиды различной структуры и длины. Выявлена роль межнуклеотидных фосфатных групп и оснований матрицы в ее взаимодействии с ферментом, а также типы связей, образуемых этими структурными компонентами матриц с полимеразой. Найдены простые алгоритмы оценки сродства матриц на основании данных об их структуре и длине. Предложена термодинамическая модель узнавания ДНК-полимеразой I матрично-затравочного комплекса. Результаты работы представляются важными для понимания механизмов репликации и белково-нуклеиновых взаимодействий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на УІ симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988), Международном совещании по перспективам применения производных олигонуклеотидов (Новосибирск, 1988), III Всесоюзном совещании "Матричный синтез нуклеиновых кислот" (Тбилиси, 1988), Двухстороннем симпозиуме СССР-Франция "Физико-химические основы жизни" (Бордо, 1988), II Двухстороннем симпозиуме СССР-США "Структура эука-риотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 1989), III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Москва, 1989), Конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989).
Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Работа изложена на 133 страницах, включая 4 таблицы и 13 рисунков. Список цитируемой литературы включает 151 работу.
