Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПАРАЦИИ 8-ОКСОГУАНИНА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
1.1. Системы репарации 8-оксогуанина в клетках про-и эукариот 13
1.2. 8-Оксогуашш-ДНК глнкозилазы 15
1.2.1.8-Оксогуаиин-ДНК гликозилазы прокариот 15
1.2.1.1. Структура Fpg прокариот , 16
1.2.1.2. Субстратная специфичность Fpg прокариот 17
1.2.1.3. Каталитический механизм Fpg прокариот 20
1.2.1.4. Конформационные перестройки комплексов Fpg прокариот с ДНК 24
1.2.1.5. Взаимодействие Fpg прокариот с остатком oxoG поврежденной ДНК.. 27
1.2.1.6. Взаимодействие Fpg прокариот с цепью ДНК, комплементарной поврежденной 31
1.2.1.7. Поиск oxoG в структуре ДНК прокариотическими Fpg ферментами . 32
1.2.2.8-Оксогуанин-ДНК гликозилазы эукариот 35
1.2.2.1. Структура AOggl , 36
1.2.2.2. Субстратная специфичность Oggl эукариот 37
L2.2.3. Каталитический механизм Oggl эукариот 38
1.2.2.4. Конформационные перестройки в комплексе hOggl-oxoG-ДНК 42
1.2.2.5. Поиск в геноме остатков oxoG ферментом hOggl , 45
1.3. Аденин-ДНК гликозилазы 48
1.3.1. Аденин-ДНК гликозилазы прокариот 48
1.3.1.1. Структура MutY прокариот 48
1.3.1.2. Субстратная специфичность MutY прокариот 49
1.3.1.3. Каталитический механизм MutY прокариот 51
1.3.1.4. Конформационные перестройки в комплексах MutY прокариот с oxoGiA-содержащей ДНК 53
1.3.1.5. Взаимодействие MutY прокариот с остатком oxoG ДНК-субстрата . 54
1.3.2. Аденин-ДНК гликозилазы эукариот 55
1.4.8-Оксогуанозинтрифосфатазы 56
1.4,1. 8-Оксогуанозинтрифосфатазы прокариот , 56
1.4.1.1. СтруктураMutTЕ. coli 56
1.4.1.2. Субстратная специфичность MutTЕ. coli 57
1.4.1.3. Каталитический механизм MutT E. coli 58
1.4.2. 8-Оксогуанозинтрифосфатазыэукариот 59
L4.2.L Структура 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот 59
1,4.2.2. Субстратная специфичность 8-оксогуанозинтрифосфатаз эукариот... 61
ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ
ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ Е. COLIC ФОСФАТНЫМИ
ГРУППАМИ ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) 65
2.1. Экспрессия и выделение формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Е. coli ... 67
2.2. Дизайн и синтез модифицированных ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатные и замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы 69
2.3. Исследование структуры модифицированных ДНК-дуплексов комбинированным методом квантовой и молекулярной механики 76
2.3.1. Выбор модельной системы 77
2.3.2. Оптимизация геометрических параметров 79
2.3.3. Сравнение теоретических и экспериментальных данных для структуры модифицированного ДНК-дуплекса , , 81
2.3.4. Влияние пирофосфатной и реакционноспособной О-этилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНК-дуплексов 84
2.3.5. Электронное строение пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп в составе ДНК 87
2.4. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с
формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli 89
2.4.1. Определение констант диссоциации комплексов модифицированных аналогов субстратов сферментом 89
2.4.2. Доказательство специфичности связывания , 91
2.5. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов
формамидопиримидин-ДНК гликозилазой Е. coli 93
2.5.1. Определение кинетических констант каталитического расщепления
модифицированных аналогов субстратов ферментом 94
2.5.2, Изучение взаимодействия ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы, с 8-оксогуании-ДНК гликозилазой человека (hOggl) 99
2.5.3. Изучение механизма взаимодействия ферментов Fpg Е. сой и hOggl с ДНК-дуплексами, содержащими модифицированные межнуклеотидные группы в 3'- и 5'-положениях остатка 8-оксогуанозина 105
2.6. Региоспецифическое ковялентнос связывание Fpg Е. coli с ДНК-дуплексами,
содержащими 0-этилзамещснные нирофосфатные межнуклеотидные группы 109
2.7. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатігую межнуклеотидную группу, с мутаитными формами Fpg. coli 119
2.8. Определение аминокислоты Fpg Е. coli, ковалентно связанной с фосфатной группой ДНК в положении, каталитически расщепляемом ферментом 124
2.9. Схема взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе 132
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 141
3.1. Реактивы и материалы 141
3.1.1. Реактивы 141
3.1.2. Среды для культивирования клеток 141
3.1.3. Буферные растворы 142
3.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды 142
3.1.4.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды 142
3.1.4.2. Анализ синтезированных олигонуклеотидов 142
3.1.5. Ферменты 143
3.2. Методы 143
3.2.1. Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях 143
3.2.2. Электрофорез в полиакриамидном геле в неденатурирующихусловиях 144
3.2.3. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 144
3.2.4. Радиоавтография 144
3.3. Общие методики 145
3.3.1. Экспрессия FpgE.coli и hOggl 145
3.3.2. Выделение Fpg Е. coli 145
3.3.3. Выделение hOggl 146
3.3.4. 5'-[ Р]-Фосфорилирование олигонуклеотидов 146
3.3.5. Синтез этиловых эфиров олигонуклеотидов 147
3.3.6. Синтез модифицированных ДНК-дуплексов методом химического mлигирования 147
3.3.7. Получение модифицированного ДНК-дуплекса, содержащего АР-участок 147
3.3.8. Аминолиз и гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы 148
3.3.9. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с
FpgE. сой, hOggl и мутантними формами Fpg Е. coli 148
3.3.10. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов
Fpg Е. coli и hOggl 148
3.3.11. Расщепление межнуклеотидной фосфодиэфирной связи в ДНК-дуплексах, содержащих АР-участки , , 148
3.3.12. Ковалентное связывание реакциоиноспособпых аналогов субстратов с
FpgE. coli 149
3.3.13. Нротеолиз ковалентного комплекса ДНК-дуплекса IV с Fpg Е. coli 149
3.3.14. Выделение олигоиуклеотидо-пептидного копьюгата и расщепление ковалентной связи между олигонуклеотиднъш и пептидным фрагментами коныогата 149
3.3.15. Масс-спектрометрия 150
3.3.16. Компьютерное моделирование 150
ВЫВОДЫ 151
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 152
ПРИЛОЖЕНИЕ 175
- Системы репарации 8-оксогуанина в клетках про-и эукариот
- Экспрессия и выделение формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Е. coli
- Реактивы и материалы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Клеточная ДНК в процессе своего функционирования постоянно подвергается воздействию различных экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к ее повреждениям. Одним из наиболее агрессивных факторов окружающей среды является активный кислород, образующийся в качестве побочного продукта клеточного метаболизма, в результате окислительного стресса или под действием ионизирующей радиации. Он индуцирует окислительные повреждения ДНК, которые являются причинами преждевременного старения, заболеваний иммунной системы, кардиологических, онкологических и ряда других. Наиболее распространенным окислительным повреждением является 7,8-дигидро-8-оксогуанин (oxoG), обладающий высокой мутагенной активностью как in vitro, так и in vivo. Наличие oxoG в ДНК вызывает G:C-^T:A трансверсии, поскольку в процессе репликации oxoG может образовывать стабильную хугстиновскую пару с аденином. Кроме того, oxoG в составе нуклеозидтрифосфата встраивается в ДНК напротив аденина ДНК-матрицы, вызывая тем самым A:T-^C:G трансверсии. Такие повреждения эффективно корректируются клеткой с помощью репарационных механизмов, обеспечивающих стабильность и целостность генетической информации. Ключевую роль в этом процессе играют специфические ферменты ДНК-ТУ-гликозилазы, распознающие и удаляющие повреждения в ДНК. Изучение взаимодействия таких ферментов с ДНК является актуальной задачей современной биоорганической химии и молекулярной биологии.
Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия фермента эксцизионной репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (Fpg) Escherichia coli с ДНК. Этот фермент удаляет из ДНК остатки oxoG и является удобной моделью для исследования механизма действия репарирующих ферментов данного класса, поскольку аминокислотные последовательности прокариотических гомологов этого белка имеют высокую степень консервативности и общие мотивы третичной структуры. Настоящая работа планировалась и была начата в отсутствие структурных данных для Fpg.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса. Для решения этой задачи было необходимо: (1) синтезировать новые аналоги субстратов Fpg Е. coli, содержащие модифицированные фосфатные группы; (2) изучить влияние введенных модификаций на структуру ДНК; (3) изучить связывание и каталитическое расщепление синтезированных аналогов субстратов ферментом и определить их количественные характеристики; (4) осуществить дизайн и синтез oxoG-содержащих обратимых и необратимых ингибиторов Fpg Е. coli и изучить их взаимодействие с
ферментом; (5) определить контакты Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в растворе; (6) на базе полученных экспериментальных данных в совокупности с данными литературы построить модель взаимодействия Fpg Е. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК.
Научная новизна и практическая значимость. До настоящего времени основное внимание исследователей было направлено на изучение взаимодействия Fpg Е. coli с окисленными гетероциклическими основаниями ДНК и практически не уделялось внимания исследованию контактов с фосфатными группами ДНК. Вместе с тем эти контакты играют важнейшую роль в функционировании фермента. Так, при взаимодействии Fpg Е. coli с поврежденной ДНК происходят значительные конформационные изменения в ее структуре, включающие расширение малой бороздки, частичное плавление и изгиб в месте модификации, выпетливание окисленного основания из спирали. Такие фермент-зависимые изменения структуры ДНК осуществляются в основном за счет образования специфических контактов аминокислот из активного центра Fpg Е. coli с фосфатными группами ДНК в составе продуктивного фермент-субстратного комплекса. Важным обстоятельством является то, что в отличие от слабых неспецифических аддитивных взаимодействий Fpg Е. coli с фосфатными группами неповрежденной ДНК, в специфическом фермент-субстратном комплексе такие контакты многократно усиливаются, приобретают кооперативный характер и реализуются по типу взаимодействия отдельных непосредственно контактирующих групп (Невинский, 2004).
В настоящей работе впервые изучены контакты фосфатных групп oxoG-содержащей ДНК с Fpg Е. coli в составе специфического фермент-субстратного комплекса. С помощью реакционноспособных аналогов субстратов выявлено семь специфических контактов аминокислот активного центра фермента с фосфатными группами ДНК. Определена аминокислота, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом. С этой целью разработан масс-спектрометрический подход, основанный на использовании фермента, меченного стабильным изотопом азота. Впервые получены обратимые и необратимые oxoG-содержащие ингибиторы Fpg Е. coli и его эукариотического аналога - 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы человека (hOggl), что открывает возможность проведения структурных исследований комплексов этих ферментов с oxoG-содержащей ДНК. Синтезированные соединения представляют интерес как потенциальные терапевтические препараты для лечения заболеваний, вызванных окислительными повреждениями ДНК. Полученные в работе результаты в совокупности с данными других исследований пополняют сведения о
процессах репарации ДНК, что позволяет направленно влиять на эти процессы в борьбе со многими опасными заболеваниями.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids" (Leuven, 10-14 сентября 2002 г.), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), "Биология - наука XXI века" (Пущино, 7-21 мая 2004 г. и 18-22 апреля 2005 г.), "Ломоносов 2004" и "Ломоносов 2005" (Москва, 10-13 апреля 2004 г. и 12-15 апреля 2005 г), "Computational Molecular Biology" (Москва, 18-21 июля 2005 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы "Ферменты, участвующие в репарации 8-оксогуанина", результаты и обсуждение, экспериментальная часть, выводы, список литературы и приложение. Материал иллюстрирован 70 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 244 цитированные работы.
Системы репарации 8-оксогуанина в клетках про-и эукариот
Поврежденное основание oxoG, возникающее в ДНК в результате окислительного стресса или под воздействием ионизирующей радиации, удаляется прокариотическим ферментом Fpg, а последующие репарационные процессы восстанавливают исходную G:C пару. В том случае, когда по каким-либо причинам основание oxoG не было удалено до процесса репликации, образуются ДНК, содержащие как oxoG:C пары, так и oxoG:A пары. Прокариотический фермент MutY удаляет ошибочно встроенный аденин, затем ДНК-полимераза I встраивает dCMP напротив oxodG, а ДНК-лигаза восстанавливает непрерывную цепь ДНК. В результате образуется ДНК, содержащая oxoG:C пару, являющаяся субстратом Fpg прокариот.
Действие реакционноспособных частиц кислорода может приводить к возникновению oxodGTP. В этом случае прокариотический фермент MutT гидролизует oxodGTP до oxodGMP, удаляя поврежденный трифосфат из смеси мононуклеозидтрифосфатов клетки. Однако возможно ошибочное встраивание остатков oxoG напротив аденииа ДНК-матрицы. В таком случае прокариотический фермент MutY оказывается вовлечен в процесс мутагенеза, поскольку удаление аденииа из неканонической oxoG:A пары приводит к трансверсии А:Т пары в C:G. Кроме того, oxoG может быть встроен напротив цитозина в процессе репликации, что приводит к образованию ДНК, содержащей oxoG:C пары. Удаление остатка oxoG из нары oxoG:C происходит с помощью фермента Fpg.
"GO-система" эукариот построена аналогичным образом. На рисунке 2 в качестве примера представлена схема функционирования ферментов такой системы в клетках человека [11, 12, 13, 14, 15]. 8-Оксогуанин-ДНК гликозилаза человека типа 1 (hOggl) узнает и удаляет остатки oxoG, образующего комплементарную пару с цитозином. 8-Оксогуанин-ДНК гликозилаза человека типа 2 (hOgg2) репарирует остатки oxoG, формирующего пары с пуриновыми основаниями. Аденин-ДНК гликозилаза (или 8-оксогуанин-мисматч гликозилаза) человека (hMYH) удаляет остаток аденина, ошибочно встроенный в процессе репликации напротив oxoG. Фермент репарации ЬМТН гидролизует окисленные иуклеозидтрифосфаты пуринового ряда, включая oxodGTP, эффективно удаляя их из нуклеотидиой смеси и предотвращая их внедрение в ДНК.
class2 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ
ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ Е. COLIC ФОСФАТНЫМИ
ГРУППАМИ ДНК (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) class2
Экспрессия и выделение формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Е. coli
Одним из наиболее эффективных подходов к исследованию структуры и функций ферментов нуклеинового обмена является изучение их взаимодействия с синтетическими аналогами субстратов, содержащими направленные модификации -замены отдельных атомов или групп атомов в молекуле НК. Этот подход позволяет выявить субстратную базу НК-узнающих ферментов, зондировать контакты белка и НК, определить положение субъединиц фермента относительно друг друга и их позиционное расположение на молекуле НК. В отличие от метода РСА, позволяющего получать данные о строении активных центров белков и взаимодействии отдельных групп белка с НК в кристаллическом фермент-субстратном комплексе, подход, основанный на использовании синтетических аналогов субстратов и включающий возможность вариации структуры субстрата при его синтезе, дает возможность изучать молекулярные аспекты НК-белкового узнавания в физиологических условиях и, соответственно, получать более точные данные о функционировании белков и НК.
Среди различных типов аналогов субстратов НК-узнающих белков особое место занимают аналоги, содержащие в своей структуре химически активные группировки. Такие соединения способны образовывать специфические ковалеитные комплексы с аминокислотами, формирующими активные центры белков и непосредственно взаимодействующими со сближенными с ними реакциогшоспособными группами, что позволяет идентифицировать эти аминокислоты и получить сведения о строении НК-связывающих и каталитических центров белков, а также о механизме их действия в целом.
В настоящей работе для изучения взаимодействия формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Escherichia coli с фосфатными группами поврежденной ДНК были использованы синтетические ДНК-дуплексы, содержащие пирофосфатные и реакционноспособные замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы, разработанные в лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. ДНК-дуплексы, содержащие замещенные пирофосфатные группы, были предложенны для изучения топографии активных центров и аффинной модификации ферментов нуклеинового обмена [188, 189].
Реактивы и материалы
Трис(гидроксиметил)-аминометаи (Tris), 2-морфоэтанолсулъфонат (МЭС), MgCI2 6H20, NiS04, Na2HP04, КН2Р04, СаС12, ,5№ВД р-меркаптоэтанол, 1-этил-3(3 -диметиламино пропил )карбодиимид (КДИ), додецилсульфат натрия (SDS), имидазол, JV-метилимидазол (Melm), изопропил-р-Б-тиогалактопиранозид (IPTG), бычий сывороточный альбумин (BSA), витамин В1, фенилметилсульфоиилфторид (PMSF), бромфенодовый синий (ВРВ), ксиленциаиол (ХС), набор белковых маркеров, KyMaccn-G250, Сипро-красный (Sigma, США). Бакто-агар, бакто-триптон, бакто-дрожжевой экстракт (DIFCO Laboratories, США). 2-Гидроксиэтилпиперазин-№2-этан-супъфокислота (Hepes), LiC104, этилеидиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), дитиотреитол (ДТТ), формамид, акриламид, метилен-бис-акриламид, мочевина, глицерин (ICN, США). NaCH3COO, NaCl, KCl, NH4C1, (NH4)2S208, (Fluka, Швеция). №Д -тетраметилэтилеидиамин (TEMED) (Reanal, Венгрия). y [ Р]-АТФ с удельной радиоактивностью 5000 Ки/ммоль (Изотоп, Россия), Остальные реагенты и растворители квалификации х.ч. и о.с.ч. отечественного производства. Для всех процедур, кроме электрофореза, использовалась бидистиллированиая вода. При выделении белков для хроматографии использовались сорбенты: Q-сефароза, HiTrap Chelating, HiTrap Heparin (Pharmacia, Швеция). 3.1.2. Среды для культивирования клеток LB-срсда: 10 г/л триптон, 5 г/л бакто-дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, 2хУТ"Среда: 16 г/л бакто-триптон, 10 г/л бакто-дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl. М9-среда: 6 г/л Na2HP04, 3 г/л КН2Р04, 0.5 г/л NaCl, 1 г/л РцС! или ,5NH4C1 после автоклавироваиия добавляли стерильные 10/л мл 0.01 М СаС12, 1 мл/л 1М MgCl2 6H20; 10 мл/л 20% водного раствора глюкозы и витамин В1 до конечной концентрации 1 мг/мл.
