Содержание к диссертации
Введение
1. Распределение эстрадиола в организме 8
2. Свойства цитоплазматического рецептора мтки
2.1. Физико-химические свойства рецептора и его очистка 11
2.2. Сродство эстрадиола к рецептору и способы его определения 25
2.3. Кинетические и термодинамические параметрысвязывания эстрадиола с рецептором 29
2.4. Специфичность эстрадиол-рецепторного взаимодействия 33
3. Эстрадиольный рецептор ядер матки
3.1. Двухстадийная модель действия эстрогенов 52
3.2. Активация и трансформация цитосольного рецептора 53
3.3. Транслокация эстрадиол-рецепторного комплекса в ядро 57
3.4. Локализация рецептора в ядре матки 58
4. Связывание стероидов с эстрадиолъными рецепторами цитоплазмы и ядер матки
4.1. Параметры связывания [ н]эстрадиола 65
4.2. Зависимость рецепторного связывания эстрогенных стероидов от их структуры 72
а) Способы определения конкурентной способности 72
б) Сравнение специфичности связывания с цитосольным и ядерным рецепторами 84
в) Свойства цитосольного рецептора матки разных животных 94
г) Сравнение рецепторного связывания и эотрогенной активности аналогов эстрадиола 96
д) Изучение температурной зависимости связывания стероидов с цитосольным рецептором 97
5. Ядерная транслокация аналогов эстрадиола в еесклеточной системе
5.1. Изучение специфичности переноса стероидов в ядра матки 99
5.2. Специфичность цитоплазматического рецептора при переносе стероидов 107
6. Определение сродства стероид-рецепторных кошлексов к ядрам 114
Экспериментальная часть 124
Выводы 139
- Сродство эстрадиола к рецептору и способы его определения
- Активация и трансформация цитосольного рецептора
- Зависимость рецепторного связывания эстрогенных стероидов от их структуры
- Изучение температурной зависимости связывания стероидов с цитосольным рецептором
Введение к работе
Гормоны это выделяемые железами внутренней секреции вещества, роль которых заключается в регуляции протекания множества различных процессов жизнедеятельности организмов.
Половые гормоны, синтезируемые гонадами, регулируют у высших животных я человека рост и физиологические функции органов размножения: стимулируют развитие вторичных половых признаков, управляют половыми циклами, обеспечивают оплодотворение, нормальное протекание беременности и лактацию. Помимо этого половые гормоны оказывают действие на многие другие функции организма, например, на синтез белков мышечной ткани (анаболический эффект), на обмен липи-дов и даже на эмоциональное состояние /1.2/.
Строение половых гормонов было изучено в 30-х годах нашего века и было установлено, что они относятся к классу циклопеятаяпер-щцрофеяантрена и представляют собой стероидные соединения. Вскоре после этого были предложены различные способы как частичного, так и полного их синтеза. Эти успехи химиков-органиков имели кроме научного и большое практическое значение, -сделав эти соединения доступными в больших количествах. Женские половые гормоны, эстрогены, нашли применение в медицине при заместительной терапии, при лечении расстройств половой сферы, в акушерстве и гинекологии, при воздействии на опухоли, вызванные нарушением гормонального баланса в организме. Они стали использоваться также в ветеринарии и животноводстве для повышения плодовитости животных и увеличения их продуктивности. Развитие методов частичного и полного синтеза позволило получать соединения, не встречающиеся в природе, и вести поиск новых лекарственных средств направленного действия. - 5 -В лаборатории химии стероидов ИБХ им.М.М.Шемякина АН GCCP в конце 50-х - начале 60-х годов был разработан метод полного синтеза эстрогенов и 19-норстероядов /3/:
0^^(сн2)п 0^^(сн2)п .(сн2)п + Rj в Н, ОН, ОСН3 Е2 = Alk n = 1} 2
Этот метод позволил получать как природный женский половой гормон эстрадаол,
так я его структурные и пространственные аналоги.
Было проведено широкое исследование как химических свойств, так и биологической активности в ряду синтезированных аналогов. Особый интерес представляло изучение реакционной способности функциональных групп при G-3 и G-I7 атомах в молекуле эстра-1,3,5, (Ю)-триеяа, поскольку именно по этим группировкам и осуществля- ются метаболические превращения эстрогенов в организме. В ходе исследования кинетики химического ( сгО, ) и ферментативного (17/3- эстрадйолдегидрогеназа из плаценты человека) окисления
17/3- оксигруппы показано, что реакционная способность 17-гядро-ксильной группы определяется размером кольца D , характером сочленения колец В/С и природой заместителя при С-3. Корреляция между электронной природой заместителя при С-3 и константой скорости окисления ОН-группы при C-I7 была объяснена открытым Бартояом дистанционным эффектом электронной природы и подтверждена данными УФ-спектроскошш /4-II/. Были обнаружены и различия в рКа в ряду 3-оксипроизводных эстратриенов в зависимости от структурных изменений в молекуле эстратриена, что может быть следствием дистанционного эффекта от кольца d к кольцу А кинформационной природы. Наличие линейной корреляции между константами скорости окисления к2 и константой диссоциации Кмсс. подтвердило существование взаимного влияния заместителей в молекуле эстрогенов, определяющее реакционную способность молекулы в целом. При сопоставлении констант химического и ферментативного окисления для изученных::аналогов 17/3- оксяэстратриенов была обнаружена линейная корреляция значений максимальной скорости ( v* ) и скорости химического окисления ( к2). На основании этих данных сделан вывод, что основной вклад в скорость распада фермент-субстратного комплекса вносит реакционная способность самого субстрата, обусловленная дистанционным эффектом заместителей от кольца А к кольцу d и обратно.
Продолжением этих экспериментов стала данная работа, посвященная исследованию возможности проявления дистанционного эффекта при образовании эстрогея-рецепторного комплекса.
На основании современных представлений о механизме действия эстрогенов эстрадиол проявляет свое специфическое гормональное действие в органах-мишенях, проникая внутрь клетки и оказывая влияние на процессы синтеза белка. Это характерно для всех стероидных гормонов и отличает их от белковых и пептидных гормонов, которые воздействуют на уровне клеточных мембран. Ключевым этапом является образование эстрадаолом комплексов со специфическими внутриклеточными белками-рецепторами. Изучение динамики связывания [б,7 - н] эстрадаола в клетке матки in vivo я in vitro показало что эстрадеюл вначале связывается с цитоплазматическим рецептором и затем появляется в ядре, где его взаимодействие с хроматином инициирует различные клеточные процессы.
На основании этих представлений была поставлена задача исследовать взаимодействие структурных и пространственных аналогов эст-радиола, синтезированных в нашем лаборатории, с рецепторной системой матки на разных этапах функционирования рецепторов (цитоплазма-транслокация-ядро), чтобы помимо корреляций между структурой и функцией этих аналогов изучить, зависит ли специфичность рецепторов от места их функционирования. Таким образом, целью работы было, с одной стороны, изучение рецепторного связывания производных эстрадаола в зависимости от строения молекулы стероида ("структура-функция"), с другой - сравнение специфичности разных стадий взаимодействия эстрогена с рецепторами, что могло бы позволять лучше понять механизм действия эстрадаола.
Сродство эстрадиола к рецептору и способы его определения
Рецепторные белки образуют с эстрадиолом комплексы, обладающие высокой прочностью. Константа ассоциации Касс#, характеризующая сродство гормона к рецептору, одна из самых высоких величин в биологических процессах (5 10 М х). Было установлено, что эстрада ол способен образовывать комплексы с цитоплазматическим рецептором матки просто при добавлении к цитосолу при 0. Для связывания не требовалось ни ферментов, ни источника энергии /21/. Для определения количества связавшегося [ Н] эстрадиола было предложено много различных методов. Наиболее точными являются метод равновесного диализа /88, 89/ и ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы /24, 27, 90/ или глицерина /91/. Однако, из-за необходимости дорогостоящего оборудования и большой трудоемкости они не получили широкого распространения в обычной лабораторной практике, а используются в специальных целях и для подтверждения результатов, полученных другими методами. Наиболее употребительными стали методы с применением адсорбентов, которыми служили покрытый декстраном уголь, поглощающий из инкубационной среды свободные стероиды /92-94/, или оксиапатит, адсорбирующий образовавшиеся комплексы /59, 95, 96/. Для определения связывания применялась и фильтрация на колонках с сефадек-сом G -25/66, 77, 97/, сефадексом G-75 /98/, сефакрилом S -200 /99/. Использовались также ДЭАЭ-целлюлоза /100, 101/ и тонкослойная гель-фильтрация /102/. Количество связавшегося гормона измеряли также и после осаждения [ Н ]эстрадиол-рецепторных комплексов протамин-сульфатом /103, 104/. Сообщалось о возможности применения микрофильтров /105/, гель-электрофореза /106/, изо-электрофакусировки /107/, об использовании радиоиммунного метода /108/, флуоресценции красителя, связанного с белком /109/, но обычно предпочтение отдается методам адсорбции, осаждения и гель-фильтрации, преимуществам которых являются быстрота и простота исполнения. Все методы дают возможность узнать концентрации свободного и связанного гормона при наступлении равновесия между гормон-рецеп-торным комплексом и свободными гормоном и рецептором.
Использование величин концентраций связанного и свободного гормона позволяет рассчитывать равновесную константу ассоциации К„сс (или равновесную константу диссоциации Кдисс#) и концентрацию связывающих мест N , которые определяются из графиков Скэтчарда /ПО/ или Лайнуивера-Берка /III/. Особый интерес представил случай связывания стероида системой, содержащей несколько связывающих компонентов. В работе Болье и др. /88/ был предложен так называемый метод "пропорциональных граф" ("proportional graph "), с помощью которого можно определять графически КасСв и U для каждого компонента. Во многих случаях исследователи сталкиваются с так называемым неспецифическим связыванием, приводящим к искривлению прямолинейных графиков Скэтчарда и Лайнуивера-Берка. Оно вызвано присутствием белков (скорее всего, сывороточного альбумина), имеющих небольшое сродство, но высокую связывающую емкость. Для определения связывания с истинными рецепторами часто применяется обычный способ: параллельно определяется связывание меченого стероида в присутствии большого избытка немеченого лиганда. Считается, что полученная величина представляет собой неспецифическое связывание, которое затем вычитается из величины общего связывания, то есть полученного в отсутствие избытка немеченого стероида. В опытах с рецепторами эстрогенов в качестве такого немеченого лиганда применяет диэтилстильбэстрол из-за его высокой специфичности /112, ИЗ/. Наличие в системе нескольких связывающих компонентов или присутствие неспецифических белков отражается на графическом представлении данных о связывании. Так, кривизна графика Скэтчар да может указывать на присутствие более чем одного типа связывающих мест. Например, в последнее время в цитосоле матки крысы помимо истинного рецептора, обладающего высоким сродством (Касс агісг М ) и низкой емкостью мест, был обнаружен и второй компонент /114, 115/. Концентрация его связывающих мест была в 4 раза выше, a KQCC# была меньше в 30 раз. Эти два типа мест отличались друг от друга и другими свойствами, например, способно- стью взаимодействовать с ядрами. Вообще, на результатах, получаемых с помощью графиков Скэт-чарда, могут сказываться различные неточности: разделение связанной и свободной форм гормона до наступления равновесия; наличие ферментов, разрушающих рецептор, и замедление этого разрушения после образования комплекса; неполное обнаружение и определение связанного гормона /116/, Причины нелинейности графиков Скэтчар-да были обобщены следующим образом /117/: 1) гиперболическая форма графика - наличие нескольких рецепторов с одним связывающим местом у каждого; 2) выпуклость или вогнутость графика - рецептор один, с несколькими связывающими местами, при этом происходит положительная или отрицательная кооперативность; 3) различные другие причины, включающие денатурацию рецептора при низких концентрациях лиганда /116/, гетерогенность связывающих мест, агрегация рецептора. Относительно кооперативности при связывании эстрадаола с рецепторами имеются разные мнения. Одни исследователи сообщали о ее существовании, тогда как другие никакой кооперативности не наблюдали вовсе. Более того, Болье в опубликованном недавно обзоре указывал, что для каждого природного стероидного гормона есть рецептор, имеющий только одну категорию связывающих мест с высоким сродством, что нет никаких доказательств кооперативного эффекта и что сообщения о нем и о гетерогенности рецептора это артефакт /118/.
Такое представление возвращает нас как бы к началь ному периоду исследования рецепторов, когда существовала ясная точка зрения: в цитоплазме клеток, являющихся мишенями стероидных гормонов, существует один рецептор с определенными свойствами, который способен связывать гормон и удерживать его против градиента концентраций. 2.3. Кинетические и термодинамические параметры связывания эстрадиола с рецептором. Определению кинетических и термодинамических параметров взаимодействия эстрадиола с рецепторами матки различных животных посвящен немногочисленный ряд работ. Эксперименты проводились на матке кролика /35, 119/, крысы /73, 120/, мыши /121/, телки /72, 122/ и на миометрии человека /56, 93/. Для определения константы скорости дисскоциации Цци00 ) было использовано несколько способов и с их помощью были получены близкие результаты /119/. Один из способов заключался в инкубации образовавшихся [ н] эстрадиол-рецепторных комплексов с суспензией угля-декстрана. Измерение через разные промежутки времени количества радиоактивных комплексов (после удаления угля) позволяло изучать кинетику диссоциации гормона. Часто при определе-msi дисс. к [ ] эстрадаол-рецепторным комплексам после наступления равновесия добавляли 1000 - 10000-кратный избыток немеченого эстрадиола, после чего изучали изменение концентрации комплексов во времени /35, 123/. Было установлено, что диссоциация эстрадиол-рецепторных комплексов подчиняется кинетике 1-го порядка, и из графика в полулогарифмических координатах зависимости концентрации комплексов от времени ( inB = inB - ктемлл t ) можно определить величину кдйсс . Кинетическое изучение связывания эстрадиола с рецептором матки показало, что высокое сродство является результатом низком скорости диссоциации гормон-рецепторного комплекса /72, 73/. Величины Ь_исс# У комплексов всех стероидных гормонов находятся в пределах 10"" - 10 сек"" /124/. Часто наблюдалась двухстадийность диссоциации: на первом этапе она протекала с более высокой скоростью (k_j порядка 10 сек ) а затем продолжалась медленнее (к,_2 порядка 10 - КГ сек""1) /35, 93,125, 126/, Однако, имеются также сообщения я об одноком-понеятном характере диссоциации комплексов цитосола матки при низких температурах (0 - 4С) /73, 120/. Впоследствии было установлено, что двухстадийность диссоциации эстрадиол-рецепторных комплексов лучше проявляется при повышенных температурах (20 -30) и может не наблюдаться при низких температурах. Существование в цитосоле двух компонентов, диссоциирующих с разной скоростью, было соотнесено с явлением активации цитосольного рецептора (см. раздел "Активация рецептора").
Активация и трансформация цитосольного рецептора
Связывание гормона с рецептором ведет к перераспределению рецептора, в результате чего большая часть его обнаруживается в ядре /167/. Это перемещение рецептора из цитоплазмы в ядро есть результат сложного процесса, первой стадией которого является "активация". Связанные с этой стадией явления поняты еще плохо и точная химическая природа активации неизвестна. Рецептор (это он считается модулятором транскрипции) должен приобрести способность влиять нужным ооразом на нужные гены и оказаться возле гена, подвергающегося воздействию, то есть попасть в ядро (транс- локация) и связаться с хроматином. Взаимодействие с хроматином влияет на транскрипцию специфических м РНК. Увеличение сродства к ядрам и появление способности взаимодействовать с хроматином и есть активация рецептора. Активированный комплекс имеет ряд свойств, отличающих его от неактивированного. Было показано, что активированная форма стимулирует РНК-полимеразу /168/. Помимо ядерного связывания и присоединения к хроматину она может связываться с ДНК-целюллозой, фосфоцеллюлозой, АТФ-сефарозой /14, 167-176/. Связывание с ДНК-целлюлозой означало, что рецепторы имеют ДНК-связывающее место /170/ и было использовано для изучения и очистки эстрадиольного рецептора /177/, а также рецепторов других стероидов /171, 178, 179/. Таким же свойством разделять активированные и неактивированные формы комплекса обладает и фос-фоцеллюлоза. Был описан метод определения активированных комплексов титрованием гомологичными ядрами, установлены его точность и специфичность /180/. В результате активации происходит также изменение способности рецептора удерживаться на ДЭАЭ-целлюлозе и ДЭАЭ-сефадексе: сильнее удерживается неактивированный комплекс. Такое изменение свойств рецепторов стероидов позволило предположить, что с рецепторнои молекулой происходят структурные или кон-формационные изменения /181/, приводящие к появлению или демаскированию положительно заряженных групп на поверхности белка рецептора /182, 183/. Для глюкокортикоидного рецептора местом взаимодействия с ДНК-целлюлозой и ядрами даже назывались положительно заряженные остатки лизина /176/. Уже в самом начале изучения механизма эстрогенного действия было установлено, что сродством к ядрам и способностью к транс-локации обладает измененная ("трансформированная") форма рецептора /24, 161/.
Было показано, что эстрадиольяый рецептор: в присутствий высокой концентраций соли изменяет коэффициент седиментации с 4 s до 5 s . Для трансформации необходимо было присутствие эстрадйола /167, 181, 184/. В работах Нотйдес и др. /30, 185/ сообщалось о кинетических исследованиях трансформации эстра-ДЙОЛЬНОГО рецептора, показавших, что превращение 4 s — 5s является реакцией димеризации (изменение молекулярного веса с 70000 до 140000). Трансформация приводила к уменьшению скорости диссоциации комплекса и к увеличению сродства рецептора к эстрадаолу /30, 185/. Здесь также обнаруживались видовые различия, так как у рецептора матки телки при трансформации сродство увеличивалось в 25-30 раз, тогда как трансформированные и трансформированные комплексы матки крысы имели одинаковое сродство /185/. Кинетика диссоциации [ Н] эстрадйола из комплекса дает чувствительный метод различия между двумя состояниями комплекса /127, 185/. Кинетический и термодинамический анализ активации рецептора показали, что активированный и неактйвированный комплексы мало отличаются друг от друга по энтальпии и энтропии, но энергия активации этого процесса высокая - около 20 ккал/моль /180, 185, 186/. Таким образом, понятия активации и трансформации оказались тесно связанными между собой. Зависимость активации от нагревания предполагала необходимость источника энергии для этого превращения. Хотя не было показано участие в активации реакций фосфорилиррваяйЯг-дефбсфорилйро-вания, но сообщалось, что АТФ взаимодействует с рецептором, влияет на его активацию и предполагалось, что АТФ может поставлять энергию для ядерной транслокации /187/. Последующие исследования установили, что кроме повышения температуры активация ±п vitro может вызываться увеличением ионной силы, разведением, гель-хроматографией яли диализом цитосола /161,167,173-176,178,183,188,189/ Данные последних работ говорят о более сложных процессах, связанных с активацией. Так, активация может проходить и при низкой температуре (0), хотя со значительно меньшей скоростью /187, 190/. Было показано, что активация эстрадиольного рецептора при низкой температуре происходит при инкубации с 5-Ю мК АТФ, и обсуждалась роль АТФ в действии стероидов /187, 191, 192/. Согласно последним результатам, важную роль в активации рецептора может играть цитоплазматический низкомолекулярный ингибитор /189, 193-195/. Гель-фильтрация или диализ цитосола вызывали активацию рецептора in vitro при низкой температуре и без гормона, причем последующее нагревание не вызывало дальнейшей активации рецептора.
Следует сказать, что первое предположение об участии ингибитора в рецептор-ядерном взаимодействии было сделано в работе по ядерному связыванию глюкокортикоидного рецептора печени крысы Д83/. Активация, вызванная удалением ингибитора, не сопровождалась изменением коэффициента седиментации, из чего следовало, что трансформация не является обязательной для активации ядерного связывания /189/. В недавней работе, проведенной с рецепторами эстрогенов, глю-кокортикоидов и андрогенов было показано, что наличие гормона необходимо для тепловой активации рецептора in vivo /196/. Образование комплекса с гормоном делает рецептор более чувствительным к повышенной температуре, в молекуле рецептора происходят изменения, приводящие к удалению ингибитора, и рецептор приобретает способность связываться с хроматином. В связи с этим большое внимание привлекли ингибиторы активации. Сообщалось о различных соединениях, обладающих этим свойством при взаимодействии с рецепторами эстрадиола, прогестерона, глюкокортикоидов: о-фенантролин, рифамицин АР/оіз 9 пиридоксаль 5 -фосфат, HaJfoO , аурин-трикарбоксильная кислота. Предполагалось, что молибдат может быть универсальным регулятором активности рецепторов стероидных гормонов. Очень вероятно, что эффективным ингибитором транслокации эстрадаол-рецепторного комплекса является пиридоксаль 5 ФС" фат. Это соединение затрудняет трансформацию 4S 5S и ядерное связывание в иятактной ткани и бесклеточной системе. Видимо, пиридоксаль 5 -фосфат имеет много точек действия, так как ингиби-рование активации происходит вместе с влиянием на уже трансформированный комплекс /197, 198/. Это соединение вызывало также быструю потерю ДНК-связывающей активности у активированного рецептора глюкокортикоидов /176/. 3.3. Транслокация эстрадиол-рецепторного комплекса в ядро. Пока мало работ посвящено механизму проникновения стероида в ядро, но ясно, что при транслокации стероид-рецепторный комплекс каким-то образом взаимодействует с ядерной мембраной. Некоторые авторы не исключают, что на этом этапе может осуществляться контроль действия стероидных гормонов. Ядерная транслокация - быстрый процесс и завершается за 30 мин. при 25, что было показано для матки крысы, мыши, овцы и свиньи /33, 199-201/. Известно, что перенос части белков в ядро осуществляется через поры ядерной мембраны, но имеется ограничение в размере белковой молекулы. Так, было сделано предположение, что белки с молекулярным весом более 60000 могут проникать в ядра в очень ограниченной степени и очень медленно /202/. По мнению Лефевра и Новосад /203/, транспорт комплекса сквозь мембрану, независимо от того, происходит транслокация через поры или нет, сопровождается особой серией взаимодействий с компонентами ядерной оболочки. Имеется также сообщение о связывании [ НІ эстрадиола с местами, располагающимися на ядерном матриксе (структуре, получаемой после того как обработанные детергентом ядра экстрагируются 0,2 М KCI и подвергаются действию ДНК-азы и РНК-азы) /204/. К противоположному выводу относительно транслокацяи эстрадя-ол-рецепторных комплексов в матке крысы in vivo пришли Линки и Сиитери /205/. По их мнению, происходит простая диффузия комплексов из цитоплазмы в ядро, и ядерная аккумуляция объясняется теорией, согласно которой вещества движутся в ядро из-за различий в водной концентрации между цитоплазмой и ядром.
Зависимость рецепторного связывания эстрогенных стероидов от их структуры
Для изучения зависимости сродства эстрогенов к рецепторам матки был выбран ряд аналогов эстрадиола. Эти аналоги имели различные структурные и пространственные изменения в молекуле по сравнению с природным эстрогеном эстрадиолом (I) (рис.9). Структурными аналогами были как природные - D-эстрон (П), D-эстри-ол (Ш), так и синтетические стероиды D-3-дезоксиэстрадиол (ІУ), D-17-дезоксиэстрадиол (У), D-з, 17-бисдезоксиэстрадиол (эстра-триея) (УІ), D-3-дезоксиэстрон (УП), DL-D-гомоэстрадиол (ХШ), БЬ_17_дезоксй-Б-гомоэстрадиол (ХІУ). Пространственные аналоги отличались от D-эстрадиола обращением одного или нескольких асимметричЕоких центров: L-эстрадиол (ХП), оптический антипод D-эстрадиола, рацемическая смесь DL-эстрадиол (ХУ1),о-8 --эстрадиол (УШ), DL-б -эстрадиол (ХУП), D -ЭД-эстрадиол (IX), DL -9/#-эстрадиол (ХУШ), DL-8ot-, 14/3-эстрадиол (X), DL-8 , 9/3, 14/ -эстрадиол (XI), BLSoi- D-гомоэстрадиол (ХУ). а) Способы определения конкурентной способности. Поскольку в нашем распоряжении находился только меченый D -эстрадаол ([ Н] эстрадаол), то способность немеченых аналогов взаимодействовать с компонентами рецепторної! системы матки определялась по их влиянию на связывание [ Н ] эстрадиола в сравнении с влиянием немеченого D-эстрадиола. Этот способ часто применяется в экспериментах, такого рода. Использовался он и при изучении связывания стероидных и нестероидных эстрогенов с эстради-ольным рецептором матки, а также при изучении рецепторного связывания других стероидных гормонов. В опытах по ингибированию связывания Г Н "I эстрадиола аликво- ты клеточных фракций, содержавших рецептор, инкубировали либо с одним Г НJ эстрадаолом, либо со смесью [ Н] эстрадиола и немеченого стероида (см. "Экспериментальную часть"). Наличие у такого немеченого стероида сродства к рецептору приводило к снижению, то есть ингибированию, связывания [ Н ] эстрадиола. Ингибирование может быть конкурентным, когда ингибитор связывается с тем же местом, что и меченый лиганд (происходит "конкуренция";, и неконкурентным, если молекула рецептора имеет разные места для связывания меченого лиганда и немеченого ингибитора. Требовалось выяснить характер ингибирования, чтобы иметь возможность по результатам ингибирования рассчитать равновесную константу связывания ингибитора. Рис.Ю График связывания меченого лиганда в отсутствие ингибитора (aQ) и в присутствии возрастающих концентраций ингибитора Ij- I2 I3 (aj, а2, а«) Присутствие ингибитора в связывающей системе приведет к изменению графика связывания меченого гормона.
На рис. 1и показана гипербола а , выражающая связывания меченого лиганда в отсутствие ингибитора ([l] = 0). В присутствии некой концентрации ингибитора [їх] связывание метки уменьшится и точка AQ сместится в точку Xj, точка У0 - точку У1 Ъ - в Z и т.д., причем смещение будет происходить по прямым, пересекающим оси координат в точках, равных полным концентрациям меченого лиганда (Тх, Ту Tz и т.д.). При увеличении концентрации ингибитора ( [L- ] JLIQJ и т.д.) будет происходить дальнейшее смещение точек по этим прямым: Xg» Xg..., 2 З" z2» z3 и т,д кривая же связывания а0 будет последовательно принимать вад aj, ag, а3 а т.д. При конкурентном йнгйбировании данная концентрация шігябятора не будет влиять на связывание при достаточно большой концентраций меченого лиганда. Поэтому при больших значениях и графики a-j-, ag, а3 и т.д. сольются с кривой связывания меченого лиганда а и присутствие связывающих мест. Таким образом, графики в обратных координатах для различных концентраций конкурентного ингибитора пересекут ось ординат в одной точке, и эти графики могут быть использованы для выяснения характера ингибирования. С этой целью [ Н ] эс-традиол в различных дозах инкубировали с аликвотой рецептор-со-держащей фракции в присутствии немеченого стероида в постоянной концентраций. На рйс. II представлены в координатах Лайнуивера--Берка графики связывания [ HJ эстрадиола с КСІ-экстрактом ядер матки кролика. Из него видно, что прямые связывания, полученные для различных ингибиторов ( L-эстрадиол, D-эстрон, D-эстрадиол) пересекают ось ординат в одной точке с прямой для связывания [ Н ] эстрадиола в отсутствие ингибитора. Изменение концентрации ингибитора ( L-эстрадиол, графики 4 и 5) приводит к изменению наклона графика, но точка пересечения оси ординат остается той же. Это же наблюдалось и для всех других изученных аналогов эстрадиола, когда они связывались с рецепторами цитосола, цитосола--КСІ или KCI-экстракта ядер матки. Такой характер ингибирования был присущ как рецепторам матки кролика, так и рецепторам матки морской свинки, и свидетельствовал о конкурентном иягйбирований связывания [ Н 1эстрадиола. Конкурентность ингибирования позволила применить формулы Это уравнение позволяет рассчитывать константу ассоциации ингибитора для любых концентраций меченого лиганда и немеченого конкурента. В работе Бест-Бельпомма и Дессена /251/ была составлена иная система уравнений для конкурентного ингибирования.
Преобразуя ее, авторы получили уравнение: (ж) где К и Кт - константы ассоциации меченого лиганда и немеченого конкурента; (РХ) - концентрация меченого комплекса; (X) - концентрация свободного меченого лиганда; (1Т) - полная концентрация свободного немеченого конкурента; (Рт) - полная концентрация рецептора (обозначения авторов). В уравнении Бест-Бельпомма и Дессена, как видно, неизвестна только величина Кр которую можно рассчитать непосредственно из этого уравнения. Его преобразование приводит к уравнению (9). Чэнг с сотр. /252/ расширил систему уравнений, описывающих конкурентное ингибирование: где KD и Кт - константы диссоциации меченого лиганда и немеченого конкурента; [ЕН]И[НІ]- концентрации комплексов меченого лиганда и конкурента; [HfJnJHf]- концентрации свободного меченого лиганда без конкурента и в его присутствии; [lf]- концентрация свободного конкурента (обозначения авторов). Из этой системы уравнений было получено выражение для определения Кт, преобразование которого привело нас к следующей формуле! где ио - концентрация свободного меченого лиганда, определяемая из графика связывания меченого лиганда в отсутствие ингибитора (рис. 12). Обозначения те же, что для уравнения (9). Рис.12 Определение величины и для расчёта Кт по формуле (10) Часто связывающая способность ингибитора выражается величиной относительного сродства, определяемой по способу, предложенному Коренманом /92/. Лря этом изучают ингибирование связывания с рецептором меченого лиганда при добавления различных количеств конкурентов, в том числе немеченого лиганда, и сравнивают дозы конкурентов, вызывающие снижение связывания меченого лиганда на 50%. Относительное сродство А выражают отношением указанной дозы немеченого лиганда к дозе немеченого аналога. Коренман /141/ и Скядмор с сотр. /253/ предложили несколько различающиеся уравнения для расчета отношения констант ассоциации по величине относительного сродства А, но преобразование обоих уравнений приводит к общей формуле: где В и и - концентрация связанного и свободного меченого лиганда при концентрации конкурентов, вызывающих одинаковое снижение связывания меченого лиганда. Следует отметить, что относительное сродство можно определять не только для двукратного снижения связывания меченого лиганда, но и для любого снижения связывания, вызываемого присутствием конкурента. Из формулы (II) вытекает, что относительное сродство не является постоянной величиной, а зависит от условий ее определения. Можно показать, что величина относительного сродства А больше отношения констант ассоциации и приближается к этому отношению при увеличении и и уменьшении В: Это происходит тогда, когда либо увеличивается полная концентрация меченого лиганда Т (соответственно увеличиваются и концентрации конкурентов, которые необходимы, чтобы вызвать ту же степень ингибирования), либо для данного Т величина А определяется при большей степени ингибирования.
Изучение температурной зависимости связывания стероидов с цитосольным рецептором
Для цитосола матки кролика и морской свинки было проведено изучение влияния температуры на ассоциацию аналогов эстрадиола с рецептором. В этом случае определяли Kj по ингибированию связывания [ Н ]эстрадиола после инкубации при различных температурах: 4, 10, 18 и 26. Так как с увеличением температуры равновесие наступало быстрее, то продолжительность инкубации была различной: 22, 20, 6 и 2 часа, соответственно. Инкубация при 37 (I ч) приводила к резкому уменьшению связывания [зН ] эстрадиола, что, возможно, вызвано тепловой инактивацией рецепторного белка. Поэтому опыты по конкуренции при 37 не проводились. По экспериментальт ным данным были рассчитаны величины Kj, которые представлены в координатах Аррениуса на рис.16. Из этих графиков видно, что хотя изменение сродства и происходит, но температура не имеет решающего влияния на Kj. Правда, с увеличением температуры несколько возрастает специфичность связывания, и изменение связывания для разных аналогов происходит неодинаково При этом графики имеют форму, характерную для случая связывания лигандов с белками, когда в комплексообразовании большую роль играют гид- рофобные силы /133/. Это может также служить одним из подтверждений представления Дьюэкса о связывании эстрогена, согласно которому решающую роль играет взаимодействие кольца А стероида с белком. Согласуется это и с полученными нами данными о лучшем связывании алицйклического кольца D в случае эстратриена (УІ), чем кольца D , имеющего кетогруппу (3-дезоксиэстрон (УП). П. ЯДЕРНАЯ ТРАНСЛОКАВДЯ АНАЛОГОВ ЭСТРАДИОЛА В БЕСКЛЕТОЧНОИ СИСТЕМЕ. Связывание горомнов с внутриклеточными рецепторами целевого органа только первый этап специфического воздействия на ткань. Следующий этап это переход, или транслокация, образовавшегося комплекса в ядро. В результате этого процесса гормон оказывается внутри ядра, связывается с определенными структурами и оказывает свое влияние на внутриядерные синтетические процессы. С помощью радиоактивного меченого гормона можно следить за транслокацией и изучать ее. Поэтому следующим этапом нашего исследования стало изучение ядерного переноса аналогов эстрадиола в полной бесклеточной системе матки.
Вначале было изучено ядерное включение [ HJ эстрадиола в зависимости от состава среды для гомогенизации ткани, от концентрации гомогената, от температуры и времени инкубации (см. "Экспериментальную часть"). П.І. Изучение специфичности переноса стероидов в ядра матки 3 результате отработки экспериментального метода были выбраны следующие условия для изучения специфичности транслокации: аликвоту (I мл) гомогената инкубировали с 0,4 нг [ Н]эстрадиола в течение I ч при 25 без конкурента или в присутствии различных доз ингибитора. Ингибирование включения Г Н 1 эстрадиола в ядра гомогената использовалось для определения относительной способности аналогов эстрадиола связываться с ядрами в бесклеточной системе матки. Ингибирующая способность аналогов эстрадиола сравнивалась с ингибирующей способностью D-эстрадиола (I). Количество метки, экстрагированной из ядер (0,4 М КСІ или этанолом), при инкубации в отсутствие конкурента принимали за 100%, Из графика зависимости ядерного связывания [ Н] эстрадиола от дозы немеченого ингибитора определяли концентрации стероидов, вызывающие снижение исходного связывания Г Н 1 эстрадиола в 4 раза. Как было показано выше, при рассмотрении ингибирования связывания с цито-сольным рецептором, относительное сродство, определенное для большей степени ингибирования, ближе к отношению констант ассоциации и поэтому правильнее отражает специфичность процесса. Величина относительного сродства определялась как отношение где С и С - концентрации немеченого D -эстрадиола и аналога, соответственно, которые снижают связывание [ н .-эстрадиола в 4 раза. Из рис. 17 видно, что в данных условиях проведения эксперимента для гомогената матки кролика наступает насыщение ядерного связывания меченого эстрадиола, так как добавление немеченого D-эстрадиола (I) приводит к уменьшению включения [ ,Н ] эстрадиола в ядра, и для дозы D-эстрадиола 0,4 нг связывание снижается почти в 2 раза. В этом случае добавление немеченого эстрадиола приводило вначале к уменьшению ядерного включения Г Н 1 эстрадиола, но затем с увеличением доз снижение замедлялось и даже при высоких дозах связывание метки не достигало Ь0%. Это же наблюдалось и для аналогов эстрадиола. Такой характер ингибирования может указывать на более сложный состав рецепторной системы матки у крысы по сравнению с кроликом и морской свинкой. В связи с этим определение величины Ш для матки крысы не проводилось. На примере нескольких аналогов было исследовано влияние степени разведения гомогената и времени инкубации на величину относительной транслокации. На рис. 19 и в табл. 15 приведены результаты, показывающие конкуренцию DL- D -гомоэстрадиола (Ж) и DL-8 Х- D-гомоэстрадиола (ХУ) при ядерном связывании в гомогенатах с различным разведением (1:6, 1:18, 1:54 г ткани/мл) гомогената. На рис. 20 и в табл. 16 представлены результаты конкуренции D -эстрона (П) и D-эстриола (Ш) с [ Н 1 эстрадиолом при разной продолжительности инкубации (I, 2 и 3 ч). Как видно из приведенных данных, на величину ВТ, определенную по ингибированию ядерного связывания [н] эстрадиола, время инкубации и концентрация гомогената не оказывают значительного влияния.
В табл. 17 приведены результаты изучения ядерного включения аналогов эстрадиола в гомогенате матки кролика. Наблюдается строгая лигаядная специфичность процесса, причем функционирующая рецепторная система чувствительна и к структурным, и к пространственным изменениям молекулы лиганда. Удаление у эстрадиола одной из гидроксяльных групп приводит к сильному уменьшению величины относительной транслокации, что говорит о важности этих групп. Уменьшение ЕШ было одинаковым при удалении любой из ОН-групп (при С-3 и С-І7). Этим ядерное связывание отличается от связывания стероидов с рецепторами цитосола и ядра. Также к значительному уменьшению Ш приводило удаление І7-0Н группы и у DL - D -го-моэстрадиола (Ж). Окисление Ї7-0Н группы эстрадиола или введение дополнительной группы в 16 -положение (эстрон (П) и эстряол (Ш)) вызывали уменьшение способности к ядерной транслокаций почти в одинаковой степени. Очень сильно на относительную транслокацию влияло удаление обеих гидроксильных групп у D -эстрадиола ( D--эстрадаея (УТ)) и 3-ОН группы у D -эстрона (D -3-дезоксиэстрон (УП)). Для этих аналогов связывание [ н] эстрадиола снижалось не более чем на 10% даже при максимально возможной дозе. Поэтому было проведено лишь их сравнение между собой. Как видно из рис. 17 и табл. 17, D -3-дезоксиэстрон (УП) оказался активнее D -эстра-триена (УІ). Эти данные также указывают на отличие лигандной специфичности бесклеточной системы от специфичности цитосольных и ядерных рецепторов. В остальных случаях характер специфичности совпадает. Увеличение кольца D до 6-членного (DL -D -гомоэстра-диол (ХНІ)) также приводит к существенному уменьшению ЕТ. Имеется четкое различие между D- и L-формамя эстрадиола и его рацемической смесью ( DL-эстрадйол). Тот же порядок изменения сродства наблюдается и для стереоизомеров ( D-806-эстрадиол (УШ), БЪ-8 -эстрадиол ((ХУП), ъ-эстрадиол (ХП), DL-8 об, 14уЗ-эст-радиол (X), DL-806, dj3 , 14/3-эстрадиол (XI),DL- 9/3-эстрадиол (ХУШ), D-Эу -эстрадиол (IX)). Хотя изменение асимметрического центра при С-8 атоме у -эстрадиола ( Б-8 -эстрадиол (УШ); и DL-эстрадиола ( DL-8о -эстрадаол (ХУЛ)) вызывает уменьшение сродства, инверсия этого асимметрического центра у DL- D-гомо-эстрадиола ( DL-8c - D-гомоэстрадиол (ЖУ)) приводит к повышению относительного сродства. Закономерности изменения ядерного включения аналогов эстрадиола в гомогенате матки в общем совпадают для кролика и морской свинки. Так как при KCI-экстракции из ядер экстрагировалась только половина [ н] эстрадиола, то ддя сравнения были проведены эксперименты с использованием этанола для экстракции ядер (табл.18). Условия инкубации, осаждения и промывки ядер оставались прежними, а ядра экстрагировали этанолом при 4 в течение 2 или 20 часов (результаты не зависели от продолжительности экстракции).
