Содержание к диссертации
Введение
1. Список принятых сокращений 4
2. Введение 5
3. Структурные мотивы днк-связывающих белков 9
3.1. Введение 9
3.2. Доменная организация днк-связывающих белков 14
3.3. Взаимодействие с днк при участии а-спиралей 16
3.3.1. Спираль-поворот-спираль 17
3.3.2. Цинковые пальцы 23
3.3.3. Лейциновая молния 29
3.3.4. Спираль-петля-спираль 34
3.3.5. Взаимодействие а-спирали с малой бороздкой ДНК 38
3.4. Взаимодействие с днк при участии р-структур 39
3.4.1. Лента-спираль-спираль 41
3.4.2. Трехтяжевой В-лист 45
3.4.3. ТВР-подобный мотив 48
3.4.4. р-петли 1HF 52
3.5. Структурные мотивы доменов интегразы вич-1 56
4. Изучение молекулярных основ взаимодействия интегразы вич-1 с ДНК 61
4.1. Характеристика ферментативных свойств магний-зависимой интегразы ВИЧ-1 64
4.1.1. Характеристика связывания ДНК интегразой ВИЧ-1 66
4.1.2. Характеристика каталитических свойств интегразы ВИЧ-1 70
4.1.3. Изучение кинетики накопления продукта процессинга 71
4.1.4. Кинетика 3'-процессинга в условиях одного оборота 73
4.1.5. Определение содержания активной формы интегразы ВИЧ-1 78
4.1.6. Многооборотный режим 79
4.1.7. Факторы, способствующие однооборотному режиму функционирования интегразы ВИЧ-1 81
4.1.8. Механизм взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК-субстратом 84
4.2. Изучение молекулярной организации Процессирующего комплекса интегразы ВИЧ-1 87
4.2.1. Дизайн и синтез аналогов субстрата и мишени интегразы ВИЧ-1, содержащих 2'-альдегидную группировку 89
4.2.2. Влияние 2'-альдегидной модификации на специфичность взаимодействия ДНК с интегразой ВИЧ-1 91
4.2.3. Оптимизация условий синтеза конъюгатов 97
4.2.4. Зависимость выхода конъюгата от места расположения альдегидной группы 101
4.2.5. Оптимизация условий обработки трипсином ДНК-белковых конъюгатов 102
4.2.6. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу 103
4.3. Изучение субъединичного строения процессирующего комплекса интегразы вич-1 106
5 Экспериментальная часть 110
5.1. Реактивы 110
5.2. Ферменты 110
5.3. Олигодезоксирибонуклеотиды 110
5.3.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды 111
5.3.2. Состав синтезированных олигонуклеотидов 112
5.3.3. Анализ синтезированных олигонуклеотидов 112
5.4. Буферные растворы 112
5.5. Методы 113
5.5.1. Электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях 113
5.5.2. ДСН-полиакриламидный гель 113
5.5.3. УФ-спектры 114
5.5.4. Температурная зависимость УФ-поглощения дуплексов 114
5.5.5. 5'-[у-32Р-АТФ]-фосфорилирование 114
5.5.6. Выделение [32Р]-фосфорилированных дуплексов 115
5.5.7. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК-дуплексами 115
5.5.7.1. Гель-электрофорез в неденатурирующих условиях 115
5.5.7.2. Метод поляризации флуоресценции 116
5.5.8. Изучение влияния модификаций 115-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1 116
5.5.9. Ацилирование 2'-аминогруппы в дуплексе UB-7N/UA 117
5.5.10. Получение конъюгатов интегразы ВИЧ-1 с ДНК 118
Выводы 120
- Доменная организация днк-связывающих белков
- Взаимодействие а-спирали с малой бороздкой ДНК
- Характеристика каталитических свойств интегразы ВИЧ-1
- Оптимизация условий синтеза конъюгатов
Введение к работе
По данным всемирной организации здравоохранения на декабрь 2005 г число ВИЧ-инфицированных больных достигло 40-миллионого рубежа. Из них от 1 до 2.5 % составляет население России. Быстрые темпы распространения заболевания ставят перед исследователями задачу разработки эффективных лекарственных препаратов.
Современная хемиотерапия ВИЧ нацелена на подавление двух вирусных ферментов: обратной транскриптазы и протеазы, и, как правило, соответствующие ингибиторы этих белков применяют сразу одновременно [1, 2]. Однако, чрезвычайно быстрая скорость мутации вируса приводит к тому, что даже использование подобных терапевтических "коктейлей" со временем оказывается малоэффективным. Именно поэтому поиск новых мишеней и ингибирующих их соединений в случае ВИЧ оказывается крайне актуальным.
Одной из подобных мишеней по праву можно считать вирусный фермент -интегразу. Известно, что вирусы, содержащие дефектный белок, не способны размножаться в клеточной культуре [3]. Полное отсутствие репликации вируса, обладающего дефектной формой интегразы, свидетельствует о том, что в организме человека нет каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. К сожалению, создание эффективных ингибиторов интегразы тормозится, с одной стороны, отсутствием информации о структуре полноразмерного белка и его комплекса с ДНК, и, с другой стороны, неоднозначным пониманием целостного биохимического механизма интеграции.
Интеграза ВИЧ-1 (ИН) представляет собой белок с массой 32 кДа, участвующий в репликативном цикле вируса иммунодефицита человека. В клетке ИН осуществляет перенос ДНК-копии генома вируса в хромосомную ДНК. Подобно ретротранспозонам вирусная ДНК содержит т.н. длинные концевые повторы (LTR), которые в свою очередь, состоят из более мелких структурных фрагментов: U3, U5 и R. Взаимодействие ИН с ДНК in vivo можно разделить на ряд последовательных стадий (Рис. 1):
- узнавание ферментом U3 и ї/5-участков вирусной ДНК-копии (субстрата) и образование с ними прочного комплекса;
- реакция -концевого процессинга, в результате которой гидролизуется межнуклеотидная связь между вторым и третьим от 3 -концов субстрата нуклеотидами, и образуются три фрагмента: пара динуклеотидов GT и укороченная с обоих концов вирусная ДНК;
- неспецифическое связывание клеточной ДНК (мишени);
- реакция переноса цепи, включающая встраивание укороченной ДНК (субстрата) в геном клетки (мишень) за счет атаки образовавшихся на процессированных концах ДНК З -гидроксилов на две фосфодиэфирные связи мишени с последующей их переэтерификацией.
Все описываемые процессы осуществляются ИН без привлечения дополнительных источников энергии и, в конечном счете, без изменения числа фосфодиэфирных связей. Переэтерификации подвергаются межнуклеотидные связи, расположенные в различных цепях ДНК-мишени на расстоянии пяти н.п. одна от другой. Таким образом, ИН связывает и затем расщепляет две молекулы ДНК; при этом расщепление вирусной ДНК строго сиквенс-специфично, а расщепление ДНК-мишени происходит независимо от нуклеотидной последовательности.
Для осуществления катализа ИН необходимо присутствие кофактора - иона металла, которым в природе является Mg2+. Однако основная масса исследований свойств ИН in vitro выполнена на рекомбинантных препаратах, проявляющих свою активность в присутствии ионов марганца по причине более высокой активности белка в этих условиях. В то же время Мп2+-зависимый катализ характеризуется гораздо меньшей специфичностью по сравнению с Mg2+-3aBHCHMbiM. В результате многие ингибиторы интеграции, найденные с использованием марганец-зависимой ИН в экспериментах in vitro, оказались неактивными в условиях in vivo. В этой связи крайне актуальным является изучение ферментативных свойств и механизма действия ИН, активной в присутствии ионов Mg2+, поскольку данные, полученные для такого фермента, можно более адекватно использовать в исследованиях интеграции ВИЧ и создании ингибиторов ИН.
В рамках диссертационной работы ставилась задача выяснения деталей механизма взаимодействия магний-зависимой ИН с ДНК-субстратом и ДНК-мишенью на стадиях связывания и З -процессинга. Для решения этой задачи было необходимо:
(1) оценить ДНК-связывающую и каталитическую активности ИН и определить их основные количественные характеристики;
(2) охарактеризовать комплексы ИН с ДНК-субстратом и мишенью на уровне их структурной организации;
(3) определить субъединичный состав процессирующего комплекса.
В работе использовалась ИН, выделенная в присутствии ионов Zn , стимулирующих мультимеризацию фермента. Благодаря применению такой методики белок проявлял ощутимую каталитическую активность в присутствии ионов Mg . Второй особенностью было отсутствие при выделении каких-либо дополнительных детергентов, которые часто использовались ранее с тем, чтобы избежать агрегации белка. Применение детергентов приводило к значительной потере магний-зависимой активности, характеризующейся высокой степенью сиквенсной специфичности. Эти обстоятельства позволяют считать, что используемая в данной работе ИН в большей степени соответствует природному белку, чем изучавшиеся ранее марганец-зависимые препараты.
При изучении ДНК-связывающей активности показано, что комплексообразование с ДНК протекает одинаково, не зависит от нуклеотидной последовательности и сопровождается формированием одного типа первичного комплекса. В работе впервые проведено всестороннее изучение каталитической активности рекомбинантного препарата магний-зависимой интегразы. Показано, что белок функционирует в принципиально однооборотном режиме. Определены и изучены причины такого поведения интегразы, а также экспериментально получены количественные характеристики активности белка. Оказалось, что эффективные константы 3 -процессингаАГ„, и со/составили 30 нМ и 0.005 мин"1, соответственно. По результатам кинетических экспериментов была выдвинута гипотеза относительно механизма связывания ДНК, рассматривающая последовательные стадии формирования первичного комплекса ИН/ДНК, способного претерпевать медленную конформационную перестройку в случае связывания ДНК-субстрата. Для ее подтверждения использовался метод ковалентного присоединения ДНК к интегразе с последующей идентификацией места присоединения. В качестве активной группировки в составе ДНК использовалась альдегидная группа в 2 -положении углеводных остатков пиримидиновых нуклеозидов. Оказалось, что и ДНК-субстрат, и ДНК-мишень действительно образуют одинаковые первичные комплексы с ИН. Параллельно при помощи этого же метода удалось подтвердить информацию о мультимерной организации процессирующего комплекса интегразы. Полученные данные проливают свет на биологический механизм действия белка и должны учитываться при создании специфических ингибиторов интеграции.
Работа включает обзор литературы, посвященный структурным мотивам ДНК-связывающих белков.
Доменная организация днк-связывающих белков
За последние десятилетия концепция белковых доменов и их структурных семейств приобрела высокую популярность в науке. Подразделение третичной структуры того или иного белка на отдельные домены предвосхищает достоверное и точное предсказание его функции. Конечно, модель, рассматривающая функции мультидоменного белка как сумму функций его отдельных частей, является сильно упрощенной и не учитывает эффекты взаимного влияния доменов и кооперативность. Тем не менее, такой подход вполне оправдан в качестве первичной оценки свойств белковых молекул. На сегодняшний день под понятием "домен" подразумевается пространственно компактная часть белковой молекулы, имеющая определенную структуру, а довольно часто и определенную функцию в изолированном состоянии [17]. Важно, что структура домена не зависит от окружающего контекста. Более того, тот факт, что одни и те же домены порой присутствуют в совершенно различных белках, говорит о гораздо более сильной консервативности доменного уровня организации по сравнению с первичной структурой. Хорошим примером, иллюстрирующим последнее положение, являются каталитические домены аденилатциклазы и ДНК-полимеразы. Несмотря на отсутствие схожести аминокислотных последовательностей, в обоих белках наблюдается одинаковое строение активных центров, катализирующих сходные процессы [18]. Доменная организация способствует большей внутренней гибкости белковых молекул, обеспечивая тем самым необходимую динамическую подвижность ее отдельных частей. Анализ структур показывает, что некоторые из доменов имеют древнюю историю, поскольку присутствуют во всех трех формах клеточной жизни: археях, бактериях и эукариотах. Постоянство структур доменов свидетельствует об их пригодности для выполнения самых разнообразных задач. Можно сказать, что существуют "типовые проекты" строения белковых глобул, и что набор наблюдаемых укладок ограничен определенными физическими закономерностями. Действительно структурные мотивы, слагающие домены, являются не чем иным, как компактной упаковкой слоев (обычно двух-трех) вытянутых стандартных твердых тел (а-спиралей и р-участков). Подобная упаковка наиболее выгодна с точки зрения свободной энергии, т.к. в ней будут насыщены почти все водородные связи, а гидрофобные участки объединены в одно общее ядро.
Статистический анализ показывает, что для случайной последовательности аминокислот образование непрерывных гидрофобных участков (в 3-4 остатка) на поверхностях а-спиралей и Р-листов - вполне обычное явление. Таким образом, доменная организация благоприятна для полипептида. Если же в такой упаковке допустить возникновение "структурного дефекта" - например, погружение края р-листа в гидрофобное ядро - это сразу приведет к дестабилизации глобулы. Конечно, наверняка можно было бы придумать такую последовательность аминокислот, которая бы для сохранения целостности структуры нарушенного домена внесла бы дополнительную стабилизацию. Однако это будет очень специальная, т.е. очень редкая последовательность [19]. Для связывания ДНК поверхность белка должна быть приблизительно комплементарна поверхности двойной спирали. Тогда выступы белковой поверхности смогут глубоко внедриться в желобок ДНК, и уже там его боковые группы смогут провести тонкое опознание последовательности нуклеотидов. Одним из центральных наблюдений, следующих из анализа структур и сравнения аминокислотных последовательностей, является то, что многочисленные ДНК-связывающие белки можно сгруппировать по классам в зависимости от присутствующего в них структурного мотива узнавания. Эффективная длина сайта связывания зависит от конформации и размеров белкового ДНК-связывающего домена, от количества "читающих головок", мультимерного состояния белка и его способности образовывать комплекс с другими ДНК-связывающими белками. Обычно отдельный домен способен контактировать в пределах 4-10 пар оснований. Контакты, образующиеся между белком и углеводо-фосфатным остовом ДНК, ориентируют обе молекулы таким образом, чтобы могли образоваться специфические контакты между аминокислотными остатками и группами гетероциклических оснований. Именно эти взаимодействия совместно с сиквенсзависимой конформацией и подвижностью ДНК приводят к тому, что связывание осуществляется с высокой селективностью по конкретному сайту или группе сайтов. Однако не стоит забывать о том, что даже в рамках одного и того же структурного домена может наблюдаться значительный разброс наблюдаемых структур ДНК-белковых комплексов, связанный с различиями во взаимной ориентации контактирующих участков [20]. 3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК ПРИ УЧАСТИИ а-СПИРАЛЕЙ Большая часть известных на сегодняшний день ДНК-связывающих белков контактирует с ДНК посредством внедрения а-спиральной единицы в большую бороздку В-формы дуплекса. Можно выделить два наиболее общих типа таких контактов в зависимости от набора аминокислотных остатков, лежащих вдоль одного общего направления бороздки. Если обозначить порядковый номер аминокислоты, образующей контакт с поверхностью ДНК, буквой /, то обычно следующий из контактирующих остатков находится на расстоянии трех или четырех аминокислотных звеньев, т.е. имеет номер i+3 или i+4 [21]. Такое положение вещей не случайно и диктуется периодическим строением самой а-спирали, содержащей примерно 3.6 остатка на виток [19]. Как правило, а-спираль способна образовывать контакты с 3-4 последовательно расположенными парами оснований при помощи трех собственных витков. При этом в сумме во взаимодействие вовлекается около четырех аминокислотных остатков.
Если смотреть в направлении оси, белковая а-спираль имеет выпуклую поверхность, и именно это имеет решающее значение при взаимодействии с ДНК, поскольку вогнутая геометрия бороздок ДНК как нельзя лучше способствует огибанию а-спирали. Даже для изолированных а-спиралей, не испытывающих какого-либо влияния со стороны других регионов белка, обычно свойственна очень жесткая пространственная форма при связывании с ДНК. В то же время более детальное рассмотрение демонстрирует, что радиус кривизны большой бороздки оказывается немного большим, чем это необходимо для идеальной подгонки двух контактирующих поверхностей. Это является причиной достаточно большого числа наблюдаемых взаимных способов ориентации ДНК и а-спирали (Рис. 4). С другой стороны, имеется принципиальная возможность взаимодействия а-спирали и с малой бороздкой дуплекса, при умеренном расширении последней. Такая ситуация, например, реализуется в случае Риг-репрессора [22]. Для того чтобы достигнуть наиболее плотного контакта с белком в любом из случаев, необходимо деформировать двойную спираль в направлении сужения большой или расширения малой бороздок, что, как показывает опыт, обычно осуществляется согласованно [23]. Достаточно часто описываемая деформация достигается благодаря изменению скрученности двойной спирали на подвижных РугРиг-участках (сайты связывания белков CAP, Е2 и др.). В случае Риг-репрессора (связьшающегося по малой бороздке) такая деформация сосредоточена в CG-участке. Можно сказать, что, в целом, ДНК фактически вынуждена изогнуться вокруг своей большой бороздки. Далее будут рассмотрены основные структурные мотивы, использующие а-спиральные единицы для осуществления ДНК-белкового узнавания. 3.3.1. Спираль-поворот-спираль (helixurn-helix, НТН) Классический домен состоит из двух а-спиралей, соединенных петлей "поворота". Одна из спиралей непосредственно участвует в образовании сети контактов с большой бороздкой ДНК и носит название "узнающей". В среднем для образования полноразмерного мотива необходимо около 25 аминокислотных остатков. Поворот обычно содержит 3-4 аминокислотных остатка, одним из которых чаще всего является глицин, а другие гидрофобны. Оси двух спиральных участков составляют между собой угол 70±15 [24]. Вторая спираль НТН единицы лежит над узнающей спиралью поперек большой бороздки ДНК и отвечает за правильное размещение узнающей спирали относительно участка узнавания. Как правило, данная спираль образует контакты с углеводо-фосфатным остовом ДНК. Однако такая двуспиральная единица не может правильно укладываться сама по себе и, следовательно, не может функционировать. Она всегда является частью другого более крупного ДНК-связывающего домена.
Взаимодействие а-спирали с малой бороздкой ДНК
Примеры белков, использующих а-спиральные участки для образования взаимодействий с малой бороздкой ДНК, достаточно редки. Известные структуры комплексов двух прокариотических репрессоров транскрипции LacR и PurR демонстрируют возможность такого контакта при условии внесения существенных деформаций в структуру двойной спирали [22, 67]. Подобные деформации приводят к значительному расширению малой борозки. В случае PurR а-спирали двух взаимодействующих мономеров, состоящие из двух витков каждая, контактируют с центральной частью симметричного сайта узнавания со стороны малой бороздки ДНК. Это вызывает изгиб оси ДНК-дуплекса примерно на 45 в противоположную от белка сторону, сопровождающийся разворачиванием спирали и нарушением стэкинга центральной пары оснований (Рис. 25). Последнее реализуется в серьезной мере благодаря интеркаляции гидрофобных остатков лейцина [22]. Известно, что аналогичные примеры интеркаляции гидрофобных аминокислот, приводящие к расширению малой бороздки, осуществляются и в комплексах представителей других структурных семейств ДНК- связывающих белков, таких как, например, ТВР или HMG, что будет подробнее рассмотрено в последующих разделах. До сих пор рассматривались лишь те ДНК-связывающие мотивы, в основе узнающей части которых лежит а-спираль. Как уже было отмечено выше, альтернативой этому может служить антипараллельный Р-лист, который также может быть размещен в большой бороздке двойной спирали. В отличие от узнающих ДНК а-спиральных участков, изогнутая геометрия р-листа позволяет ему образовывать значительно большее число контактов, вовлекая во взаимодействие до семи аминокислотных остатков. Соответственно увеличивается и длина эффективного сайта связывания ДНК, достигая у операторов белков MetJ или ArcR шести последовательных пар оснований, а у оператора GBD - девяти. Надо отметить, что структура Р-листа не является плоской, и что ей всегда присуща определенная степень кривизны [68, 69].
Чтобы более четко понять эту тенденцию, надо представить бесконечный двухтяжевой антипараллельный р-лист, закрученный с образованием правой спирали (Рис. 26). Для того, чтобы двухтяжевой Р-лист был плотно уложен в бороздку ДНК, и при этом оба тяжа могли образовать контакты с ней, существует две принципиальные возможности. Одна из них подразумевает формирование ДНК-связывающей поверхности выпуклой формы (выступ), а другая - вогнутой (впадина). При всех прочих вариантах укладки в образовании контактов может участвовать лишь один р-тяж. Когда Р-лист располагается в большой бороздке, связанный в виде "выступа", N— С направление каждого из тяжей совпадает с 3 — 5 направлением углеводо-фосфатного остова ближайших к ним цепей двойной спирали, а при связывании в малой бороздке - с 5 —+3 направлением. И обратно: при связывании "впадины" ситуация меняется на противоположную (Рис. 26). Как правило, Р-структурный "выступ" употребляется для глубокого проникновения в область большой бороздки с образованием контактов вблизи ее дна. Теоретически при сближении поверхности р-листа с бороздкой ДНК аминокислотные контакты могут быть образованы /, i+2 и i+4 остатками одного из тяжей uj,j+2 nj+4 остатками другого, где / и/- порядковые номера аминокислотных остатков, с которых начинаются сами р-тяжи. Дальнейшее расширение набора взаимодействующих с ДНК аминокислот невозможно из-за пространственного удаления контактирующих поверхностей вследствие их природной кривизны. Иными словами любое удлинение Р" листа будет приводить к его выходу за пределы размеров двойной спирали. По этой же причине со стороны ДНК во взаимодействии могут принимать участие не более шести последовательно расположенных пар гетероциклических оснований. Ширина большой бороздки ДНК (12 А) позволяет разместить выпуклый В-лист, и это благоприятствует специфическому взаимодействию белка с ДНК, поскольку именно там экспонировано наибольшее разнообразие функциональных групп и их сочетаний. Вогнутая поверхность р-листа способна следовать естественной кривизне двойной спирали. Однако большая площадь, покрываемая при таком контакте, приводит к затруднению в проникновении Р-листа вглубь большой бороздки. Поэтому данному типу геометрии обычно свойственны контакты с углеводо-фосфатным остовом обеих цепей, ограничивающих малую бороздку двойной спирали. По-видимому, относительно меньшая ширина малой бороздки (6 А) приводит к тому, что образовать этот тип контакта оказывается проще именно здесь. В дополнение к сказанному, малая бороздка существенно менее глубокая, что сильно увеличивает пространственную доступность гетероциклических оснований. Однако меньшее разнообразие экспонированных функциональных групп ведет к тому, что при белково-нуклеиновом узнавании все большую роль начинает играть "непрямое" чтение последовательности, т.е. в игру включается уже сиквенс-зависимая конформация всего дуплекса [70]. 3.4.1. Лента-спираль-спираль (ribbon-helix-helix) Рис. 27.
Взаимодействие с ДНК белков, содержащих домен "лента-спираль-спираль". (А) Модель димера, содержащего домен "лента-спираль-спираль"; (Б) Схема комплекса двух димеров белка ArcR с ДНК (PDB код: 1PAR). Наиболее простыми представителями группы "лента-спираль-спираль" можно назвать белки MetJ, ArcR и Mnt. Все они являются прокариотическими репрессорами транскрипции и взаимодействуют с ДНК в виде димеров (Рис. 27). В каждом мономере данный домен формируется примерно 40-45 аминокислотными остатками, образующими два а-спиральных участка, соединенных глициновым поворотом, и один Р-тяж. Исключением является лишь белок MetJ, в структуре которого вместо упомянутого остатка глицина присутствует более длинный фрагмент. При образовании димера, р-тяжи разных субъединиц образуют антипараллельный Р-лист, который, будучи уложен в большую бороздку своей выпуклой стороной, непосредствено взаимодействует с ДНК [71, 72, 73]. Если условно обозначить порядковый номер аминокислоты, с которой начинается каждый из антипараллельных р-тяжей индексом /, то остатки i+2 положений Р-листа (лежащие в его середине) будут находиться на наиболее близком расстоянии от поверхности ДНК и, следовательно, иметь наибольшую свободу в выборе контактирующей группировки со стороны двойной спирали. Действительно, каждая из них потенциально способна образовать контакты с любым нуклеотидом двух соседствующих пар, в то время как на более удаленные / и i+4 остатки приходится только по одной паре [74]. Чтобы соединить наиболее удаленные от ДНК концевые участки Р-листа с поверхностью большой бороздки на одном из концов каждого из пары тяжей обычно находится аминокислотный остаток с длинной боковой цепью. Например, і положения Р-листа MetJ и TraY заняты остатком лизина (см. Lys23 в MetJ), a i+4 положения ArcR и MetR - аргинина (Рис. 28). Надо отметить, что Са-атомы двух соседствующих аминокислот, боковые цепи которых направлены в одну и ту же сторону относительно поверхности Р-листа (например, і и i+2 остатков), разделяются промежутком примерно в 6.6 А. В то же самое время расстояние между соседними парами гетероциклических оснований в дуплексе оказывается в районе 3.4 А. Можно заключить, что основания, контактирующие с боковыми цепями подобной пары аминокислот, должны быть разделены 1-2 нуклеотидами в последовательности ДНК. В реальности это количество варьируется от 1 до 3 нуклеотидов (см. контакты Gln9, Asnl 1 и Argl3 на Рис. 29 Б).
Характеристика каталитических свойств интегразы ВИЧ-1
После того, как стадия связывания ДНК магний-зависимой интегразой была количественно охарактеризована, мы приступили к изучению каталитических свойств белка на примере реакции З -процессинга. Для этого использовался радиоактивно меченый по процессируемой цепи (UB) 21-звенный С/5-субстрат (Рис. 46). По образованию укороченного на два нуклеотида 19-звенного продукта мы судили о протекании процессинга. Надо сказать, что интеграза способна осуществлять перенос ДНК-субстрата в самого себя. При анализе состава реакционных смесей при помощи гель-электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 45 А) продуктам реакции переноса цепи соответствовали более высокоидущие полинуклеотиды. Однако, поскольку в используемых нами условиях можно было пренебречь продуктами реакции переноса цепи по причине их малого количества ( 5%), во всех экспериментах по изучению каталитической активности фермента мы рассматривали исключительно стадию З -процессинга. Прежде всего, нами был исследован ход реакции 3 -процессинга во времени, для чего измерялось накопление продукта реакции в условиях сильного избытка белка по сравнению с ДНК-субстратом (3 нМ ДНК и 100 нМ ИН), в качестве которого выступал 21-звенный синтетический дуплекс UB/UА, имитирующий Ш-участок вирусной ДНК (Рис. 46). Как демонстрируют наши данные, такие условия являются оптимальными с точки зрения получения максимальной активности (Рис. 45). За образованием продукта процессинга следили при помощи электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Как видно из рисунка (Рис. 50 Б) на кривой накопления продукта процессинга можно выделить три характерных участка. Начальная лаг-фаза (I) длится 15-20 минут, после чего, даже несмотря на сильный избыток белка по отношению к субстрату (т.е. несоблюдение условий кинетики Михаэлиса-Ментен), наблюдается фаза линейного роста концентрации продукта реакции (II). Спустя 2 часа, по мере расходования субстрата, на смену линейной фазе приходит фаза насыщения (III). Надо отметить, что наблюдаемое плато соответствует примерно 80%-ной конверсии начального количества субстрата и не достигает его полного превращения. Это не случайно - данное значение хорошо согласуется с рассчитанным нами средним значением константы диссоциации ( 43 нМ), которое подразумевает связывание 85% ДНК в активный комплекс в условиях описываемого эксперимента. Разница в 5%, по всей видимости, связана с неактивными молекулами ИН, которые, тем не менее, способны связывать ДНК, не процессируя ее.
По величине занимаемого промежутка времени мы предположили, что первая фаза, наиболее вероятно, обусловлена медленным связыванием субстрата интегразой. По данным кинетического эксперимента (Рис. 47) можно сделать заключение, что в процессе комплексообразования равновесие наступает примерно за тот же временной промежуток, какой соответствует наблюдаемой лаг-фазе. Чтобы доказать взаимосвязь лаг-фазы с образованием комплекса, мы изменили схему эксперимента и сначала провели инкубацию 3 нМ UB/UA со 100 нМ ИН в течение 20 минут при 25С, а потом нагреванием до 37С стимулировали протекание З -процессинга. При температуре 20-25С белок способен связывать ДНК, не осуществляя его каталитического превращения. Как видно из рисунка (Рис. 51), предварительная инкубация субстрата с ИН, привела к исчезновению лаг-фазы. Кроме того, предварительная инкубация субстрата с интегразой привела к увеличению скорости накопления продукта на начальном участке в среднем в полтора раза. Подобное стимулирующее влияние ДНК было ранее обнаружено Д.А. Бугреевым с соавт. [97] и объяснялось способностью олигонуклеотидов инициировать формирование активных димеров белка. Наши результаты также свидетельствуют в пользу накопления потенциально каталитически активных комплексов при 25С. Более грамотное сравнение кривых (Рис. 51) показывает, что 30-минутная точка на пунктирной кривой практически совпадает по ординате с 15-минутной точкой сплошной кривой. Учитывая 20-минутный период предварительной инкубации, эти данные неплохо согласуются. Дальнейшее увеличение времени постепенно нивелирует эффект стимуляции, и, в конечном счете, спустя шесть часов наблюдаются одинаковые концентрации продукта процессинга как при использовании предварительной инкубации, так и без нее. Все это свидетельствует в пользу одинакового течения каталитической реакции после осуществления связывания. Вторая фаза кинетики накопления (Рис. 50 Б) демонстрирует явный линейный характер и протекает гораздо медленнее связывания. Прямолинейная зависимость увеличения концентрации продукта процессинга похожа на многооборотное функционирование фермента согласно принципам кинетики Михаэлиса-Ментен, однако, это сходство оказывается чисто внешним. Поскольку в экспериментах по изучению каталитической активности ИН используется большой избыток белка относительно ДНК-субстрата, мы имеем дело с типичными однооборотными условиями, где использование стандартного формализма Михаэлиса-Ментен недопустимо. В связи с этими соображениями нами был предложен другой математический аппарат, объясняющий поведение ИН в квази-стационарном приближении для однооборотных реакций.
Таким образом, уравнения (10) и (11) позволяют выполнить экспериментальное определение таких параметров ферментативной реакции 3 -процессинга, как Кт и kcat . Для этого была изучена зависимость эффективности процессинга 3 нМ Ш-субстрата от концентрации интегразы в течение заданного промежутка времени (36 или 60 мин). По этим данным при помощи уравнения (10) рассчитывались значения эффективной константы процессинга (к0ь )- Построение зависимости к0ь от концентрации ИН и ее последующая аппроксимация уравнением (11) позволила определить значения аналогов каталитической константы и константы Михаэлиса реакции 3 -процессинга в однооборотном режиме (Рис. 52). В данном эксперименте концентрация ИН варьировалась в диапазоне от 5 до 200 нМ, поскольку именно в этом интервале наблюдается рост каталитической активности по мере возрастания концентрации белка (Рис. 45). Важно, что при такой постановке эксперимента эффективная каталитическая константа не включает шаг диссоциации комплекса ИН/ДНК и, следовательно, отражает только лишь те процессы, которые протекают между стадией связывания и актом процессинга. Рассчитанные по экспериментальным данным значения Кт и kcat составили 30±10 нМ и 0.005±0.001 мин"1, соответственно. Определяемая в однооборотных условиях каталитическая константа демонстрирует чрезвычайно низкое значение. Иными словами WH сое ерик пл OAmfV oeropowv. її!І за время около 220 минут. Сравнительный анализ показывает, что ИН расщепляет фосфодиэфирную связь примерно в 1000 раз медленнее некоторых эндонуклеаз рестрикции [156]. Предложенный нами математический формализм описывает кинетику накопления продукта процессинга в зависимости от начальной концентрации ДНК-субстрата. Для линейной фазы накопления (фаза II) допустимо пренебрежение экспонециальным членом в уравнении (14). Полученное, таким образом, уравнение (15) демонстрирует линейную зависимость стационарной скорости З -процессинга от начальной концентрации субстрата. В качестве еще одного доказательства верности наших предположений, положенных в основу математической модели, была изучена зависимость стационарной скорости накопления продукта процессинга от концентрации субстрата (Рис. 53). Как видно из рисунка, рассчитанные по экспериментальным кинетическим кривым значения стационарной скорости З -процессинга связаны с начальной концентрацией ДНК-субстрата линейной зависимостью, предсказываемой уравнением (15). Более того, тангенс угла наклона прямой на рисунке (Рис. 53 Б) хорошо согласуется с экспериментальными значениями характеристических констант (Кт и кеш ), определенных на предыдущем этапе работы, и соответствует предсказываемой к величине: —rrf— 0.004 (мин ). [Що Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что стадия превращения фермент-субстратного комплекса интегразы (IN DNAs) является намного более медленной, чем связывание. Действительно нетрудно показать, что если в уравнении (3) принять, что ki kcat , стационарная концентрация фермент-субстратного комплекса приближается к нулю, и начальная скорость образования продукта (при /—»0) должна линейно зависеть от концентрации фермента, поскольку:
Оптимизация условий синтеза конъюгатов
В первую очередь мы провели проверку того, что выбранные модифицированные аналоги субстрата (UB-7A/UA, UB/UA-3A) и мишени (ТВ-7А/ТА, ТВ/ТА-ЗА) способны образовывать конъюгаты с ИН. Для этого ДНК-дуплексы (5 нМ) инкубировали с интегразой (100 нМ) при 37С в течение 1 часа, после чего производили восстановление образовавшегося основания Шиффа цианоборогидридом натрия в течение 30 минут. Продукты ковалентного присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли. Как и ожидалось, все указанные дуплексы действительно были способны образовывать ковалентные конъюгаты с ИН (Рис. 66). На примере других белков ранее было продемонстрировано, что реакция альдегидной группы с остатками лизина протекает только в составе специфического ДНК-белкового комплекса [174, 175]. В случае ИН из-за ее способности связывать ДНК как в качестве субстрата, так и в качестве мишени, нельзя однозначно говорить о специфичности взаимодействия. Поэтому на следующем этапе с использованием одного из дуплексов (UB-7A/UA) мы показали, что при помощи выбранной схемы синтеза (Рис. 60) между молекулами ИН и ДНК действительно образуется ковалентная связь. Для этого параллельно с обычным набором операций были проведены синтезы при отсутствии какого-либо из компонентов, упомянутых в схеме (Рис. 60). Как видно по радиоавтографу (Рис. 67), ковалентный ДНК-белковый конъюгат образовывался только при наличии всех необходимых компонентов процесса. Наблюдаемая подвижность полосы комплекса оказалась несколько меньшей, чем у белкового маркера массой 47 кДа, что подтверждало рассчитанное теоретическое значение молекулярной массы комплекса (32 кДа + 6.4 кДа + 6.5 кДа = 44.9 кДа). Это являлось важным подтверждением того, что в результате последовательности всех операций формируется именно ДНК-белковый конъюгат. Отметим, что определенная молекулярная масса в 45 кДа соответствует комплексу, содержащему молекулу ИН и ДНК-дуплекса. В условиях электрофоретического разделения реакционных смесей в присутствии додецилсульфата натрия все используемые нами ДНК-дуплексы оказались устойчивыми.
В пользу такой интерпретации помимо рассчитанной при помощи значения подвижности молекулярной массы комплекса можно также привести данные по разрушению дуплекса, связанного в интегразном комплексе, при помощи немеченых олигонуклеотидов (см. раздел 4.3). На следующем этапе на примере того же дуплекса (JJB-7A/UA) были подобраны оптимальные условия химического синтеза конъюгата ИН с ДНК. Была исследована зависимость выхода продукта реакции от времени восстановления и концентрации восстановителя. Для этого после формирования ДНК-белкового комплекса при 37С в течение 1 часа на стадии восстановления основания Шиффа мы варьировали либо время обработки цианоборогидридом натрия (1-30 минут), либо концентрацию восстанавливающего агента (1.25-25 мМ). Анализ реакционных смесей осуществляли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли. По экспериментальным данным мы построили графические зависимости выхода конъюгата от рассматриваемых параметров (Рис. 68). В обоих случаях экспериментальные кривые демонстрировали выход на плато (Рис. 68 А, Б). Концентрационная зависимость образования комплекса при трехминутном восстановлении цианоборогидридом натрия выходила на насыщение уже при 10 мМ концентрации восстановителя (Рис. 68 А). Как показывают данные по оптимизации времени обработки восстановителем, за три минуты образуется около 85% от максимально возможного количества комплекса (Рис. 68 Б), а наиболее полное восстановление происходит за 6-10 минут. Таким образом, для последующего препаративного синтеза в качестве оптимальных были выбраны следующие условия: 25 мМ цианоборогидрид натрия и не менее 10 минут восстановительной обработки. Затем мы изучили влияние времени инкубации ДНК с ИН на эффективность образования комплексов на примере обоих модифицированных аналогов субстрата. Для этого варьировали длительность стадии формирования комплекса от 0 до 120 минут. Восстановление проводили в течение меньшего, по сравнению с оптимальным, времени (3 мин). Это было сделано по двум причинам: во-первых, уменьшение времени важно для изучения начального этапа формирования комплекса, где нельзя пренебрегать длительностью восстановительной стадии по сравнению с общим временем инкубации. И, во-вторых, за три минуты все же восстанавливается около 85% комплекса, т.е. с хорошей степенью приближения можно считать, что восстановление завершилось (Рис. 68 Б). Полученные результаты (Рис. 69) хорошо согласовались с экспериментом по изучению кинетики связывания методом поляризации флуоресценции (Рис. 47). За 20 минут кривые комплексообразования практически выходят на плато, что говорит о зависимости формирования ковалентного комплекса от степени связывания ДНК. Также с определенностью можно говорить, что в наших условиях скорость восстановления основания Шиффа примерно в 4-5 раз превосходит скорость связывания. Наконец, мы подобрали концентрационные условия препаративного синтеза. Для этого был изучен выход конъюгата UB-7A/UA с ИН при нескольких концентрациях ДНК и интегразы. На стадии формирования комплекса при концентрации ИН 100 или 200 нМ мы варьировали концентрацию ДНК-субстрата от 10 до 50 нМ (Табл. 4). Такой концентрационный диапазон белка был выбран на основании данных по изучению каталитической активности ИН (Рис. 45), поскольку именно в указанном интервале наблюдается наибольшая скорость и эффективность процессинга, а, следовательно, количество специфического комплекса также должно быть максимальным.
Оказалось, что наибольшие выходы конъюгатов наблюдались при 10-кратном избытке фермента над субстратом. Обобщая приведенные результаты, можно сказать, что наиболее подходящие условия препаративного синтеза подразумевают осуществление восстановления в течение не менее 10 минут 10-25 мМ цианоборогидридом натрия при совместной инкубации десятикратного избытка интегразы по отношению к ДНК в течение, по крайней мере, 20-30 минут. Эти условия и были использованы в дальнейшем для получения ДНК-белковых конъюгатов. 4.2.4. Зависимость выхода конъюгата от места расположения альдегидной группы Полученные в ходе экспериментов по подбору оптимальных условий синтеза результаты демонстрировали явную зависимость выхода конъюгата от места расположения модификации в структуре дуплексов. Например, для дуплекса UB-7A/UA выход составил около 50-60%, в то время как UB/UA-3A присоединялся немного хуже (35-50 %) (Рис. 69, Табл. 5). Зависимость эффективности ковалентного соединения ИН с ДНК от местоположения модифицированного нуклеотида вызвана различным расстоянием между реагирующими альдегидной и аминной группами или их различной взаимной ориентацией в пространстве. После того, как были подобраны оптимальные условия образования ковалентных комплексов и изучена способность модифицированных субстратов участвовать в реакции процессинга был осуществлен препаративный синтез конъюгатов ИН с субстратами и мишенями, содержащими альдегидную группировку в третьем положении Л-цепей или седьмом положении В-цепей. Последующая обработка трипсином позволяет произвести расщепление белковой части по тем остаткам лизина, которые не участвовали в образовании ковалентной связи. Такой подход упрощает идентифицикацию набора присоединившихся к ДНК пептидов. Описываемая стратегия была уже ранее использована для определения контактов, образованных лизиновыми остатками эндонуклеазы рестрикции SsoII [175]. Необходимо отметить, что в нашем случае ковалентное соединение проводилось в присутствии большого избытка ИН над ДНК. В связи с этим было необходимо подобрать подходящие условия обработки трипсином. Как оказалось, благодаря присущей ИН способности образовывать крупные агрегаты, при инкубации с ДНК большая часть белка и ковалентного комплекса прочно сорбировалась на гидрофобную поверхность пластмассовых пробирок. Это свойство позволяло отделить от реакционной смеси несвязавшуюся ДНК простым центрифугированием раствора. После удаления жидкой фазы в пробирку добавляли водный раствор, содержащий трипсин, который осуществлял гидролиз белковой части конъюгатов и несвязанной ИН. Мы провели оптимизацию условий протеазного гидролиза конъюгатов, варьируя время реакции (Рис. 70) и концентрацию трипсина.
