Введение к работе
Актуальность проблемы. Поддержание стабильности генома из поколения в поколение и в течение жизни индивидуального организма является одним из важнейших процессов в клетке. Существуют различные механизмы восстановления (репарации) повреждений ДНК. Данная работа посвящена изучению особенностей функционирования системы репарации неканонических пар нуклеотидов («мисматчеи») в ДНК - MMR (от англ. Mismatch Repair). Одной из её главных функций является исправление ошибок, появляющихся в ходе репликации ДНК. Система MMR участвует в ответе клеток на повреждения, возникающие под действием мутагенных факторов. К функциям белков MMR также относится координация узнавания и репарации повреждений ДНК с клеточным циклом, предотвращение рекомбинации между сходными последовательностями ДНК, регуляция конденсации хромосом в митозе и сегрегации ДНК, участие в гипермутировании генов иммуноглобулинов (Schofield et al, 2003; Jun et al, 2006). Нарушение функционирования MMR на одном из её этапов приводит к накоплению мутаций, результатом чего является возникновение онкологических заболеваний. Таким образом, необходимо всестороннее изучение системы репарации «мисматчеи» в ДНК.
Система репарации «мисматчеи» была обнаружена во всех царствах живых организмов и характеризуется высокой консервативностью первичной структуры её ключевых белков - MutS и MutL, от бактерий до высших эукариот. Предполагается, что основы механизма репарации «мисматчеи» сходны для всех организмов. Поэтому детальная характеристика белковых ансамблей и их комплексов с ДНК, образующихся в процессе MMR, в том числе в бактериальных клетках, является актуальной задачей.
Функционирование системы MMR обусловлено координированным действием более 10 белков. В клетках Е. coli сенсорный белок системы MMR MutS узнаёт и связывает неканоническую пару нуклеотидов, образуя «начальный» узнающий комплекс, который претерпевает конформационные перестройки, сопровождающиеся формированием «окончательного» узнающего комплекса. Последний в присутствии координирующего белка MutL активирует эндонуклеазу MutH, гидролизующую дочернюю (временно неметилированную по участкам 5'-GATC-3') цепь ДНК. К одноцепочечному разрыву присоединяется ДНК-хеликаза UvrD и расплетает ДНК. Далее неметилированную цепь ДНК гидролизует набор экзонуклеаз. Метилированную (материнскую) цепь ДНК защищают белки SSB (от англ. Single-Strand Binding). ДНК-полимераза III и ДНК-лигаза восстанавливают целостность ДНК. Функционирование белков MutS, MutL и MutH можно считать начальными этапами MMR, действие остальных ферментов - эксцизионными этапами.
В настоящее время определены основные структурные и функциональные характеристики белка MutS. Тем не менее, взгляды на начальные этапы MMR с участием этого молекулярного сенсора все еще противоречивы. Практически не исследовано основное уникальное событие процесса MMR - связывание MutS с ДНК при выявлении единичного «мисматча» среди многих тысяч канонических пар нуклеотидов. Спорные моменты касаются структуры конформационно подвижных
промежуточных комплексов MutS с ДНК и механизма активации этапов эксцизионной репарации. На сегодняшний день ключевые экспериментальные данные по этим вопросам отсутствуют из-за ограниченных возможностей использовавшихся ранее подходов. Перспективной стратегией для характеристики динамически подвижных ДНК-белковых комплексов представляется сочетание физико-химических и молекулярно-биологических методов с ковалентной фиксацией MutS на ДНК. Расширение методологической базы в этом направлении является необходимым этапом изучения процесса MMR.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась характеристика начальных этапов функционирования системы репарации «мисматчей» Е. coli с использованием модифицированных ДНК. В работе решались следующие задачи:
-
Изучение возможности репарации системой MMR остатка тимидингликоля в ДНК. Разработка комплексного биохимического подхода для характеристики начальных этапов функционирования системы репарации «мисматчей».
-
Выявление с помощью ковалентной фиксации MutS на ДНК:
конформационных перестроек ДНК, происходящих при формировании «окончательного» узнающего комплекса MutS с ДНК;
механизма «мисматч»-зависимой активации эндонуклеазы MutH.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено детальное биохимическое исследование влияния остатка тимидингликоля (Tg) -продукта окисления тимидина - в ДНК на функционирование системы MMR. Показано, что появление Tg в составе кольцевых ДНК не активирует белки системы репарации «мисматчей». Это обусловлено отсутствием эффективного связывания сенсорного белка MutS с фрагментами ДНК, содержащими пары G/Tg и A/Tg, и невозможностью формирования изгиба ДНК, характерного для «начального» узнающего комплекса. По-видимому, MutS не способен к специфическому взаимодействию с Tg вследствие его неплоской структуры. Таким образом, нарушение межплоскостных взаимодействий в двойной спирали ДНК, приводящее к её дестабилизации, не является решающим фактором для узнавания повреждений белком MutS.
Разработаны методы ковалентной фиксации MutS на ДНК, позволяющие проводить структурно-функциональные исследования системы MMR. С количественными выходами получены конъюгаты мутантных форм MutS, содержащие единственный остаток Cys на мономер в положении 497 или 469, с фрагментами ДНК, несущими 2'-пиридилдисульфидную группировку или дисульфидную группировку на 3'-конце олигонуклеотида. Разработаны методы очистки ковалентно связанных комплексов MutS с ДНК, обеспечивающие сохранение активности белка в составе конъюгатов.
Предложен подход, позволяющий проследить конформационные перестройки в ДНК на различных этапах её взаимодействия с MutS. Сконструирована ДНК-система, содержащая дисульфидную группировку (для фиксации динамичных комплексов MutS) и флуоресцентную пару (в качестве репортёрной конструкции). Впервые показано, что при образовании «окончательного» узнающего комплекса с MutS
происходит изменение конформации дуплекса, характеризующееся отсутствием характерного изгиба двойной спирали. С помощью метода ковалентной фиксации MutS в области «мисматча» установлено, что дальнейшее перемещение MutS по ДНК не является обязательным условием для активации MutH. Разработанная стратегия может быть использована для реконструкции основных этапов функционирования систем репарации в клетке на молекулярном уровне.
В целом, полученные в настоящей работе результаты расширяют представления об особенностях механизма действия белков системы MMR на начальных этапах и впоследствии могут быть использованы для объяснения причин возникновения неполипозного рака толстой кишки (синдрома Линча).
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на международных научных конференциях молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008, 2009, 2010, 2011), на конференции «Minisymposium of the International Research Training Group Giefien/Marburg-Moscow» (Москва, Россия, 2009), на конференции «Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids» (Вильнюс, Литва, 2010), на конференции «3-rd Giessen Graduate Centre for the Life Sciences, Conference on Life Sciences» (Гиссен, Германия, 2010), на 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (обобщены современные представления о структурно-функциональной организации системы репарации «мисматчей» в ДНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 65 рисунками, 4 схемами, 14 таблицами. Библиографический указатель включает 264 цитированные работы.
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")
