Введение к работе
Актуальность проблемы. Работа ферментов матричного биокатализа лежит в
основе процессов, ответственных за сохранение, воспроизведение и реализацию генетической информации. Именно понимание механизмов функционирования этих ферментов позволило заложить фундамент современной молекулярной биологии. Изучение ферментов матричного биокатализа является в настоящее время одной из наиболее бурно развивающихся областей науки. Однако, несмотря на достигнутый прогресс, многие принципиальные моменты, связанные с функционированием полимераз в системах репликации, репарации и транскрипции, остаются неясными. К их числу относятся механизм перемещения полимераз вдоль матричной цепи при пронессивном синтезе полинуклеотидов и критерии отбора корректного нуклеозидтрифосфатного субстрата в каждом новом хатал'.гпгческом цикле. Сложность этих двух вопросов определяется тем, что оба процесса связаны с быстрыми конформационными изменениями в структуре ферментов, и изучение таких изменений с помощью существующих на сегодняшний день методов выглядит проблематичным. В последнее десятилетие были получены кристаллы ряда ДНК- и РНК-полимераз, которые были изучены методом рентгеноструктуриого анализа с достаточно высоким разрешением. Однако даже столь детальная структурная информация не позволяет дать точных ответов на указанные выше вопросы, поэтому остается крайне актуальным развитие новых методов исследования функционирования полкмеваг.
Цел_ьаботьі_ В настоящей работе преследовалось несколько целей' !) Разработка модели транслокации ДНК-полимероз №>.: матричной цепи -npoutcca, слабо исследованного даже на уровне гипогез Основанием служили известные экспериментальные данные, метопом - компьютерное моделирование
-
Синтєі ряда модифицированных аналогов рибо- .; дезоксі:рибонуклеозид-->'-трнфосфатов, несущих остатки, флуоресцентных красит. ;.;й или фзтоактивируемые группировки и обладающих хорошими субстратными сномствак'и для полимераз
-
Исследование возможности использования модифицированных (d)NTP в различных системах матричного биокатализа для получения информации о структуре и функционировании ДНК- и РНК- полимераз.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе предложена модель транслокашш ДНК-полимераз на примере обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека - одного из наиболее изученных в настоящее время ферментов матричного биокатализа. Согласно этой модели, транслокация происходит в результате перехода участка дуплекса, расположенного внутри ДНК-связывающего кармана фермента, из А- в В-форму на стадии конформащюнной подстройки субстратной молекулы dNTP в активном центре
Впервые синтезированы производные UTP, несущие остатки флуоресцентных красителей - флуоресцеина или тетраметилродамина - введенных по положению С5 ппримидинового основания Были получены полноразмерные РНК-зонды, меченные флуоресцеином, которые были использованы при скрининге хромосомспецифичной
клонотеки для построения контига клонов из района 13-ой хромосомы человека, сцепленного с болезнью Вильсона-Коновалова.
Синтезирован набор фотоактивируемых аналогов (d)UTP, (d)ATP и dCTP, несущих 2-нитро-5-азидобензоильную, н-азидотетрафторбензоильную или 0-(/1-азидотетрафторбензилиденаминоокси)-метнлкарбамоильнуіо группу, присоединенную по положению гетероциклического ядра, которое не участвует в комплементарных взаимодействиях (С5 пиримиднновых и CS пуриновых нуклеотидов).
Показано, что сингезированные флуоресцентно меченые и фотоактивируемые аналоги (d)NTP являются субстратами ДНК- и РНК-полимераз и могут быть использованы для получения соответствующих меченых полинуклеотидов и для изучения различных ДНК- и РНК-полимераз вирусов, прокариот и эукариот и их комплексов с другими белками.
Показана возможность применения фотоактивируемых аналогов (d)NTP для высокоселективного мечекия белкоь репликативного комплекса представителя низших эукариот - Physamm polycephalum. Установлено, что в ядерном экстракте Physamm polycephalum активны ДНК-полимеразы а и є. В случае ДНК-полимеразы а активной является только интактная субъединица с поллмеразной функцией - р]40. Проведен сравнительный анализ размеров ДНК-связывающих карманов ДНК-полнмераз а и е Physamm polycephalum.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях «Геном человека-93» (Черноголовка, 1993), «Геном человска-94» (Черноголовка, 1994), 3-ем германо-российском биотехнологнческом симпозиуме (Берлин, 1994), международных конференциях «Регуляция репликации эукариотической ДНК» (Монреаль, Канада, 1994), «Репликация эукариотической ДНК» (Колд Спринг Харбор, США, 1995), российско-французском симпозиуме по регуляции экспрессии генов (Новосибирск, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждешю, описания использованных материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы из 233 наименований. Работа содержігг 1 таблицу и 16 рисунков.
