Содержание к диссертации
Введение
1. Роль ионов металлов в функционировании пирофосфата 36
1.1. Пирофосфатазы-ихроль, функционирование в клетке 6
1.2. Первое семейство пирофосфатаз 9
1.3. Второе семейство пирофосфатаз 31
2. Характеристика эффекториого центра неорганической пирофосфатазы escherichia coli 47
2.1. Характеристика мутантных вариантов неорганической пирофосфатазы e.coli 49
2.2. Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе mgpp 67
3. Изучение свойств эффекториого центра с использованием lappi в качестве субстрата 73
3.1. Гидролиз lapp, е-рразой и y-рразой 73
3.2. Влияние метилендифосфоната на гидролиз lapp, 79
3.3. Влияние f" на гидролиз lapp 86
4. Экспериментальная часть 89
4.1. Исходные вещества 89
4.2. Методы исследования 89
4.3. Расчет концентраций компонентов реакционной смеси 91
4.4. Изучение зависимости скорости гидролиза mgpp] от концентрации свободных ионов магния 91
4.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия 92
4.6. Химическая денатурация 92
4.7. Получение тримерных форм е-рразы и изучение их свойств 94
4.8. Гидролиза субстрата гексамерными формами мутаитных вариантов е-рразы 94
4.9. Влияние метилендифосфоната на гидролиз mgpp, 94
4.10 Гидролиз lapp, нативной и мутантными вариантами е-рразы 95
4.11. Влияние метилендифосфоната на гидролиз lapp[ 95
4.12. Влияние?" на гидролиз lapp 96
4.13. Влияние f* и метилендифосфоната на гидролиз lapp, и mgpp 96
4.14. Попытки кристаллизации комплексов нативной е-рразы с lappi и mgpcp. 97
Выводы 100
- Первое семейство пирофосфатаз
- Второе семейство пирофосфатаз
- Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе mgpp
- Влияние f" на гидролиз lapp
Введение к работе
Синтез многих важнейших компонентов клетки протекает с образованием пирофосфата (РР;). К таким процессам относятся, например, синтез белков, нуклеиновых и жирных кислот. Эффективность протекания синтеза обеспечивается смещением термодинамического равновесия за счет элиминирования РР,. Это достигается с помощью неорганических пирофосфатаз, которые с очень высокими скоростями гидроилуют пирофосфат и тем самым регулируют его концентрацию. Такая ключевая роль РРаз в метаболизме создает возможность их выделения практически из любого представителя царства живого.
Пирофосфатазы относятся к конститутивным ферментам, то есть регуляция их активности достигается не на уровне экспрессии генов, а на уровне уже синтезированного белка.
Цитоплазматические пирофосфатазы подразделяются на два семейства. Наиболее хорошо изученными представителями семейства I являются пирофосфтазы из дрожжей и из Escherichia coli (КФ З.6.1.1.; РРазы). Эти ферменты обладают сходным строением активных центров и механизмом действия. Однако отличаются олигомерным строением (пирофосфатаза из E.coli - гексамер, а из дрожжей - димер), числом аминокислотных остатков в субъединице (175 для E.coli и 286 для дрожжей), расположением функциональных групп на поверхности и строением межсубъединичных контактов. Для пирофосфатазы из E.coli главная роль в образовании контактов между тримерами отводится ионным парам Hisl36-Aspl43' и Aspl43 -Hisl36, а также гидрофобному контакту Hisl40-Hisl40'. Другая область контакта сформирована симметрично боковыми цепями участков Asn24, А1а25 и Asp26 двух соседних субъединиц, связывающих межтримерный ион магния. В дрожжевой пирофосфатазе межсубъедипичпый контакт образован за счет гидрофобных взаимодействий ароматических колец Trp52, His87, Тгр 289 с симметрично расположенными остатками в другой субъедипице,
Характерным для РРаз является способность к конформационным перестройкам высокоинтегрированной структуры белков. Действительно, известно, что введение мутационных замен приводит к изменению ряда важнейших свойств ферментов. При взаимодействии с обратимыми ингибиторами проявляется отрицательная кооперативи ость активных центров. Уменьшение олигомеризации (диссоциация на тримеры или димеры), приводящее к снижению активности, по-видимому, является также следствием перестройки структуры.
Одним путем регуляции активности неорганической пирофосфатазы из Е.соП, является наличие эффекториого центра. Впервые он был обнаружен при гидролизе MgPPi тримерной формой фермента. Оказалось, что зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата невозможно описать уравнением Михаэлиса - Ментен, что было объяснено заполнением эффекториого центра за счет связывания с ним свободного пирофосфата. Существование этого центра было подтверждено данными равновесной гель-фильтрации, показывающими включение двух молей пирофосфата на моль субъединицы, и активацией гидролиза субстрата под действием негидролизуемого аналога - метилеидифосфоната.
Важно также, что пирофосфатазы являются металл-зависимыми ферментами. Известно, что физиологический диапазон концентраций Mg в клетке составляет 1-1,5 мМ, а для насыщения активного центра Е-РРазы необходимо 5-6 мМ Mg2+. Поэтому in vivo, по-видимому, этот фермент не насыщен ионами магния, однако, высокая активность пирофосфатаз может указывать на существование некоего компенсаторного механизма.
В задачу настоящего исследования входила детальная характеристика эффекторных свойств РРазы из Е.соН. Работа включала три части. В первой части были получены и изучены свойства ряда мутаптных форм Е-РРазы. Характерным для них оказалось нарушение эффекториого центра, перестройка структуры и изменение эффективных параметров химической и термической денатурации. Для мутантаых вариантов, содержащих замену Lysll2, действие эффектора проявлялось только при гидролизе LaPPj, по не MgPPj, Во второй части исследований установили природу эффектора, активирующего гидролиз субстрата, показали, что Е-РРаза является субстрат-активируемым ферментом. При использовании в качестве альтернативного субстрата - LaPPj в последней части работы была выявлена положительная кооперативность активных центров в гексамерной Е-РРазе. Кооперативность была характерна также для димериой молекулы дрожжевого фермента. Связывание в эффекторпом центре негидролизуемого аналога субстрата - магний метилеидифосфоната вызывает ускорение гидролиза LaPPj под действием не только Е-РРазы, ее мутаптных вариантов и тримерной формы этого фермента, а также дрожжевой РРазы, причем удается достичь скорости гидролиза LaPPj близкой к той, с которой гидролизуется природный субстрат - MgPPj. В присутствии эффектора не только растет скорость гидролиза, но также происходит исчезновение асимметрии субъединиц и сильно возрастает сродство ферментов к LaPPj.
Обзор литературы посвящен роли ионов металлов в функционировании пнрофосфатаз обоих семейств. Характерной особенностью этих ферментов является участие в катализе 3-4 ионов двух валентных металлов, среди которых наибольшая активность в семействе РРаз I проявляется в присутствии ионов магния, а в семействе II -ионов марганца.
Первое семейство пирофосфатаз
В пирофосфатазе из E.coli ион металла в центре Ml координирован тремя остатками аспарагиновой кислоты: Asp65, Asp70 и Aspl02 (рис. 1). Оставшиеся три координационные валентности металла дополнены водой до октаэдрическои конфигурации. Лигаидом второй координационной сферы является остаток Asp67, с которым ион металла связывается через молекулу воды [4, 9, 31]. Существует несколько равновесных методов определения констант диссоциации комплексов ионов металлов с ферментами. В случае РРаз использовали в основном диализ и спектрофотометрическое титрование. В таблице 2 представлены соответствующие константы диссоциации комплексов РРазы с ионами металлов в центре Ml, Из таблицы 2 видно, что ион металла в центре Ml связывается достаточно прочно с обоими ферментами. В дрожжевом ферменте константу диссоциации иона металла можно определить с помощью флуоресцентного титрования, для Е-РРазы это невозможно, так как в ближайшем окружении Ml нет остатка Тгр. Следует обратить внимание на то, что измерения для Ml, проведенные в разное время, находятся в одном диапазоне концентраций. В то же время некоторые различия можно наблюдать в зависимости от природы используемого буферного раствора (например, Kj, в Ml, измеренная в Tris-HCl буфере для Е-РРазы равнялась 76 мкМ [34], тогда как в MES-NaOH буфере она составила около 22 мкМ [35, 38]). Одной из первых структур комплексов неорганической пирофосфатазы с ионами металлов была решена структура Е-РРазы, содержащей Мп2+ в центре Ml, с разрешением 2,2 А [12]. Детальный анализ этой структуры был проведен в 1998 году, и были выявлены изменения структуры белка, которые происходят в ответ на связывание первого иона металла с ферментом. Связывание ионов Мп2+ в Е-РРазе приводит к смещению не только групп активного центра, но и тех участков цепей, в состав которых эти группы входят (рис. 2) [39]. Надо отметить, что присоединение иона металла увеличивает количество молекул воды, которые, в свою очередь, участвуют в образовании системы нековалентных взаимодействий. Одним из следствий связывания иона марганца является появление большого числа новых связей в молекуле РРазы, что проявляется в снижении свободы теплового движения многих боковых групп и Са - атомов полипептидной цепи.
В 1996 году была получена структура комплекса Е-РРазы с металлом-активатором Mg2+ с разрешением 2,3 А. Этот комплекс содержал 1,5 иона Mg2+Ha мономер. Один ион металла связывается в центре Ml, а еще один - между двумя субъединицами. Роль этого межтримерного иона Mg + будет рассмотрена ниже. При анализе этой структуры было показано, что связывание иона металла в центре Ml приводит к перераспределению водородных связей. В апоструктуре остаток Туг55 является центром сети водородных связей, которые стабилизируют расположение Asp70. В структуре комплекса Е-РРазы с ионами металлов эта роль принадлежит остатку Lys 104. Asp70 взаимодействует с Glu20 через молекулу воды (рис. 3). Карбоксильная группа Glu20 образует водородную связь с азотом пептидной группы Не32 и тем самым способствует фиксации между ними петли (20-32) (рис.4) [9]. Карбоксильная группа Glu20 образует водородную связь с азотом пептидной группы Не32 и тем самым способствует фиксации между ними петли (20-32) (рис.4) [9]. Из таблицы видно, что консервативные замены, например, аспарагиновон кислоты па глутаминовую или лизина на аргинин, обычно приводят к небольшому ухудшению связывания ионов металла в Ml, Но при замене Aspl02 на Val (когда убран отрицательный заряд боковой цепи) - имело место ухудшение связывания более, чем на порядок. С другой стороны, замены на Val остатков Asp97 и Glu98, которые не являются лигандами Ml, приводит лишь к незначительным ухудшениям сродства. Было показано, что связывание фосфата и аналога субстрата -гидроксиметилендифосфоната, строго говоря, не влияет сродство к центру Ml ни для нативного фермента, ни для мутантных вариантов с консервативными заменами остатков активного центра. И авторы делают вывод, что ион металла в Ml достаточно индифферентен к связыванию лигапдов в активном центре [34]. В дрожжевом ферменте лигандами иона металла в Ml также являются три остатка дикарбоповых кислот: Aspl 15, Aspl20 и Aspl52, гомологичных остаткам в Е-РРазе (65, 70 и 102, соответственно ). Оставшиеся три координационные валентности тоже дополнены водой до октаэдрической. Во вторую координационную сферу этого иона металла входит остаток Aspl 17 (аналогичный Asp67 в Е-РРазе) [11]. При анализе данных по связыванию ионов металлов в центре МІ для Y-РРазы и Е-РРазы, полученных равновесным диализом (таблицы 3 и 4), можно выявить некоторые важные различия между двумя ферментами, несмотря па сходство их активных центров [3, 41, 42]. Из таблицы 4 видно, что ион металла в Ml связывается в 37-108 раз прочнее в дрожжевом ферменте, чем в Е-Разе (см. таблицу 2). Чувствительность к связыванию Ml в случае двух мутаций Asp/Glu в двух ферментах - Е-РРазе и Y-РРазе - обратная. Так, у Е-РРазы замена Asp65GIu (табл.3) заметно уменьшает сродство к Ml, a Asp70Glu слабо сказывается, тогда как у Y-РРазы замена Aspll5Glu не влияет на сродство к Ml, но Aspl20Glu его заметно ухудшает [36].
Такие различия в связывании металлов, вероятно, происходят из-за более плотной упаковки активного центра в Y-РРазе [34]. Помимо Mg , в центре Ml может связываться другой металл-активатор - Mn , который имеет те же лигапды, что и Mg , но связывается более прочно, и металл -ингибитор Са +, Так как ион кальция обладает большим ионным радиусом, чем Мп и Mg2+ - 0,99 против 0,74 и 0,65 А, соответственно, то он предпочтительней образует комплексы с семью лигандами [13], нежели Mg и Mn , которые всегда имеют по шесть лигандов. Кристаллическая структура, полученная для термофильной пирофосфатазы из Sulfolobus acidocaldarius (S-РРаза), показывает, что в этом ферменте металл связывается в положении схожем, но не идентичном Ml мезофильных РРаз, Ион Mg в S-РРазе координируется только двумя белковыми лигандами Asp65 и Aspl02, что является принципиальным отличием данного фермента. Причиной такого свойства является смешение петли 63-67 приводящее к сдвигу ионов металлов в положении Ml на 0,73 А, Это связано с тем, что петля 63-67 содержит остаток - Asp65, который отодвигается на 0,85 А от Asp70, что хорошо видно из рис.5А при сравнении S-РРазы и Mg],5 Е-РРазы. Б. Ионные взаимодействия, стабилизирующие петлю, содержащую остаток активного центра - Asp65 показаны для S-РРазы, Т-РРазы и Е-РРазы (ключевые остатки показаны цветом той же цепи, из которой они пришли) [8]. Следует заметить, что положение остатка Asp65 в S-РРазе такое же, как в Т-РРазе (в отсутствие иона металла в Ml) и в S-РРазе (с ионом металла в МІ) рис. 5А. Контакты, которые смещают петлю 63-67, образованы различными ионными парами в S- и Т-РРазах, но отсутствуют в Е-РРазе (рис. 5Б). Сходство между структурами S- и Т-РРаз -это наличие добавочной ионной пары, стабилизирующей петлю 97-101 [8]. Свойства ионов металлов в центре М2. Единственным белковым лигандом в центре М2 Е-РРазы (рис. 1) является второй кислородный атом Asp70, который принадлежит одному из трех подвижных участков, обрамляющих вход в активный центр (Leu62-Asp70) [42], оставшиеся пять координационных валентностей заняты молекулами воды [12]. Остаток Asp70, как было отмечено выше, одновременно связывает металл в центре Ml. Во вторую координационную сферу иона металла в центре М2 входят Glu20 и Туг55. Наложение структуры апоформы фермента на структуру с двумя ионами Mg показало, что присоединение двух Mg + индуцирует перестройку нековалентных связей фермента, которое хорошо видно на рис. 6, например, карбоксильных групп остатков Asp42nGlu31 [39]. Константа диссоциации иона металла в центре М2 Е-РРазы была определена различными способами; в отсутствие субстрата - равновесным диализом и спектрофотометрическим титрованием, а в присутствии субстрата из кинетических экспериментов. В таблице 5 представлены константы диссоциации ионов магния в центре М2 ферментов из E.coli и дрожжей.
Второе семейство пирофосфатаз
Первичная структура пирофосфатаза семейства II известна для нескольких десятков представителей, обнаруженных в основном в бактериальных источниках. Рентгеноструктурный анализ сделан для трех ферментов: это пирофосфатазы из Bacillus subtilis, Streptococcus mutans, S. Gordonii. Ни для одного из ферментов не описаны пространственные структуры комплексов с субстратом или продуктами. Известны лишь комплексы с аналогом продукта - сульфатом (SO4). Пространственные структуры всех пирофосфатаз семейства II оказались схожими. Все они являются гомодимерами; для субъединиц характерна двухдоменная структура, между которыми расположен активный центр (рис.11). N-концевой домен (остатки 1-188) содержит центры связывания металлов (Ml и М2). С-концевой домен (остатки 196-309) содержит остатки Lys205, Arg295 и Lys296, которые участвуют в связывании субстрата и продукта. Два домена в составе субъединицы соединены подвижным линкером [59]. Эти домены могут смещаться друг относительно друга на 10 ангстрем, приводя к двум отличающимся конформациям активного центра, называемых открытой и закрытой. При связывании субстрата происходит превращение открытой конформации в закрытую[60]. Во втором семействе пирофосфатаз ионы металлов, связываясь в соответствующих центрах, играют важную роль. Главная их функция, как и в случае семейства I, заключается в активации атакующей молекулы воды. Кроме того, ионы металла, связываясь в центре высокого сродства, стабилизируют димерную структуру. Влияние различных ионов металлов в г\ептрах Ml и М2 на структуру и каталитические свойства пирофосфатаз семейства П. Как уже было сказано, представители второго семейства пирофосфатаз тоже являются металлозависимыми, но в отличие от семейства I, наиболее эффективным кофактором выступают ионы Мп +. Долгое время исследователи не могли разобраться, который центр, Ml или М2, связывает ион металла с высоким сродством, а какой - с низким. Возможная причина такой путаницы может заключаться в том, что эти центры, сходные кристаллографически и близкие по сродству к ионам металла, характеризуются отрицательной кооперативпостыо при связывании кофактора, которая, по мнению авторов, возникает в результате электростатического отталкивания двух близко расположенных ионов металла. Основываясь на последних данных [26] и для простоты изложения ниже, центр высокого сродства обозначается как М2, а центр низкого сродства как Ml. Центры Ml и М2 второго семейства показаны на рис, 12 на примере пирофосфатазы Bs-РРазы. Лигандами ионов металлов в центре Ml являются His9, Aspl3 (бидентантный лиганд) и Asp 75, которая является мостиковым лигандом для обоих ионов металла.
Ион металла в центре М2 помимо Asp75, координирован еще Aspl5, Aspl49 и His97. Сравнение центров связывания ионов металла Ml и М2 в двух семействах РРаз показывает, что если центр МІ в обоих семействах имеет несколько белковых лигандов, то центр М2 по количеству белковых лигандов заметно отличается. Только один белковый лиганд связывает ион металла в М2 в случае первого семейства [12] и четыре - во втором семействе. Однако только один ион металла в семействе II может связываться в активном центре с высоким сродством [60]. Расстояние между ионами металлов в центрах Ml и М2 во втором семействе РРаз в отсутствие субстрата - 3,6 А и между ними находится одна мостиковая молекула воды (рис.12), тогда как в семействе I РРаз расстояние между ионами металлов в этих центрах в отсутствие субстрата - 4,9 А, и они разделены двумя молекулами воды [59]. Если ион металла в центре МІ пирофосфатаз семейства II является шестикоординированным, так же как и в случае семейства I [28, 61], то ион металла в центре М2 в семействе РРаз II является пятикординированным (геометрия квадратной пирамиды), тогда как у семейства I - это октаэдр. Интересно, что центр высокого сродства специфичен для переходных ионов металлов: KD ДЛЯ МП2+ лежит в наномолярном диапазоне, Cd2+ и Zn + имеют константу, близкую или даже лучшую, чем Mn2+, а К0 для Mg2+ на шесть порядков хуже. Однако связывание в центре высокого сродства ионов Zn2+ и Cd2+ инактивирует фермент [60]. Связываясь в этом центре, ион металла может контролировать активность несколькими путями. Во-первых, заполнение только одного этого центра сдвигает равновесие димер - мономер в сторону димера. Димерная форма пирофосфатазы семейства II значительно активней, чем мономерная, и субстрат связывается с ней на порядок лучше. Моиомерную же форму удается получить только в отсутствие ионов металлов [29]. Каталитические свойства РРаз семейства II зависят не только от условий предварительного выдерживания фермента, по и от характера металла-активатора, с которым прединкубировали фермент. Оба параметра, kcat и Кт, увеличиваются в присутствии ионов марганца, но сильнее растет kcat. Таким образом, замена иона магния на ион марганца в центре высокого сродства всегда активирует фермент, но этот эффект проявляется при более высоких концентрациях субстрата (табл. 8). Кроме того, присутствие Mn + расширяет субстратную специфичность: в его присутствии возможен гидролиз даже CaPPj, что исключено в случае пирофосфатаз семейства I.
Из рисунка видно, что при связывании аналога продукта (сульфат иона) происходят изменения в положении нуклеофильной воды, она двигается на 1 А практически перпендикулярно плоскости, образованной Ml, М2 и Су-атомом Asp75. Причем движение происходит всегда в сторону от входящей сульфатной группы, в результате чего нуклеофильная вода располагается благоприятно для атаки. Такое движение приводит к смещению His97 от Asp75 также па 1 А, что влечет за собой незначительные изменения в центре М2. Наблюдаемый угол нуклеофильная вода-фосфат-мостиковый атом кислорода составляет 170 , что близко к углу атаки on-line -180. Детальное сопоставление трех структур Bs-РРазы с Мп , Sg-РРазы с Мп и сульфатом и Sg-РРазы с Zn2+ и сульфатом позволило описать геометрию расположения лигапдов вокруг металлов и ее изменение при связывании сульфата. На рисунке 14 представлена геометрия металл - связывающих центров Ml (слева) и М2 (справа). Лиганды иона марганца в центре М2 образуют неправильную квадратную пирамиду или тригональную бипирамиду (рис. НА). В структуре с сульфатом или возможно и с фосфатом, координация иона металла в М2 меняется от пятикоординационной квадратной пирамиды (с Мп ) или тригональной бипирамиды (с Zn ) к шести координационному октаэдру (только для Мп ). Таким образом, ион металла М2, может принимать пятикоординационнуга геометрию, но предпочитает октаэдрическую, что приводит к благоприятным информационным изменениям в ферменте и максимальной активности в присутствии Мп +. Схожее, хотя пока не объясненное изменение координационного числа, происходит и в МІ: в отсутствие субстрата геометрия иона металла представляет собой октаэдр, который, однако, имеет одну или две очень длинные связи ( 2,45 А). Из рисунка 14А видно, что Ml имеет шесть лигандов, но координация несимметричная. Одна связь Ml-052 (Aspl3) находится на расстоянии 2,7 А, в то время как другие расстояния 2,1-2,3 А. Такая конфигурация ближе всего к тригонильной бипирампде. Углы для экваториальных лигандов составляют 105-137 , а для аксиального Mis9 и нуклеофильной воды - 175. М2, в отличие от Ml, связан только с пятью лигандами, а возможный шестой лиганд удален па 3,6 А. Расположение в этом случае лигандов наиболее близко к квадратной пирамиде. Связывание сульфата в активном центре (рис. 14 Б) изменяет геометрию Ml и М2 с пятикоординировашгой на октаэдрическую. Предполагается, что уход продукта и восстановление Этот вывод согласуется с большей способностью продукта (в 8-11 раз) покидать активный центр Мп формы фермента, по сравнению с Mg - формой. Рисунок 14С показывает, что Zn+ в центре М2 неспособен принимать октаэдрическую конформацию, что и объясняет его ингибиторное действие. За возможность Мп в центре М2 менять свое координационное число и обнаруживать два "лица" в комплексе с субстратом и без него, авторы ион металла в этом центре остроумно назвали Янус - металлом. Такое двуличие является немаловажным при уходе продукта, а также при других стадиях катализа [26].
Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе mgpp
Как обсуждалось выше, тримеру WT РРазы и ряду мутантиых вариантов для достижения максимальной активности при гидролизе MgPPj требуют заполнения эффекторпого центра. При этом предполагалось, что эффектором является свободный пирофосфат. В настоящей работе этот вопрос обследовался более детально. Для этого получены зависимости скорости гидролиза в широком диапазоне MgPPj при изменении концентрации ионов магния от 200 до 5000 мкМ и концентрации субстрата от 3 до 400 мкМ. Часть полученных данных представлена на рис 29. Далее на основе этих данных, проанализировано изменение активности при постоянной концентрации MgPPj (Л) или PPj (Б) или Mg + (В), представленное в таблице 19. Из серии А следует, что несмотря на снижение концентрации PPj при постоянной концентрации MgPPj с ростом концентрации Mg2+ активность растет. Увеличение активности еще в большей степени происходит при постоянной концентрации PPj, но при увеличивающейся концентрации MgPPj (серия Б), но в этом случае рост скорости гидролиза можно было бы приписать увеличению концентрации ионов Mg2+. Однако, при постоянно и высокой концентрации Mg + (серия В), видно, что решающую роль в активации фермента играет еще одна мoлeкyлaMgPPi, которая связывается в центре, отличном от активного. Приведенная схема (2) хорошо описывает экспериментальные данные тримерпой формой WT-РРазы в присутствии активатора (рис. 30); по уравнению (4) можно оценить кинетические параметры гидролиза, которые при значении keat 250 ME дают р = 2,5 и Ks -132 мкМ. Важно было попытаться выяснить природу активатора при гидролизе MgPPj и под действием WT-РРазы. Из рис. 23 следует, что активация фермента происходит уже при очень низких концентрациях субстрата, что свидетельствует об очень высоком сродстве к эффектору. Это свойство, разумеется, затрудняет такой анализ. Поэтому в случае нативиого фермента необходимо было использовать низкие концентрации субстрата - MgPPi и низкие концентрации Mg , в условиях, когда можно одновременно следить за заполнением активного и эффекторного центров (табл. 21).
Выше было показано, что при рН 6,0 и 10 мМ Mg , где сродство всех лигандов сильно уменьшено и нет достоверных констант диссоциации комплексов, наблюдается активация гидролиза MgPPj под действием метилендифосфоната. В настоящем разделе работы удалось показать, что MgPPj связывающийся в эффекторном центре и обеспечивающий активацию фермента, может быть замещен негидролизуемым аналогом субстрата при нейтральном значении рН, то есть в физиолигических условиях функционирования фермента. На рис. 31 представлены результаты гидролиза под действием тримера Е-РРазы концентрацией субстрата и ионов магния при рН 7,5 в присутствии низкой, но увеличивающейся концентрации РСР. Полученные данные указывают на существование в ферменте центра связывания метилендифосфоната, связывание с которым активирует фермент. Аналогичные результаты получены и для гексамерной Е-РРазы, которую отличает лучшее сродство к эффектору и поэтому большие трудности его замены на РСР. При низких концентрациях субстрата и при низких концентрациях Mg = 0,5 мМ при рН 7,5 активация наблюдается в том случае, когда реакциониая смесь содержит сопоставимые с субстратом количества MgPCP: Эти наблюдения также подтверждают, что MgPPi в эффекторном центре может быть замещен MgPCP. Надо специально заметить, что в отличие от описанной выше активации гидролизы 5 мкМ MgPPi под действием Lysll2Gln-PPa3bi в присутствии 0,5 мМ Mg при рН 7,5 показал, что с увеличением концентрации РСР активации фермента не происходит. Данный факт подверждает нарушение эфекториого центра в этом мутантом белке. Сложностей в интерпретации результатов гидролиза MgPPj и, особенно, WT-РРазой в присутствии эффектора, обусловленная многокомпонентностыо системы, высокими скоростями процесса и большим сродством и субстрата, и эффектора, удается в определенной степени избежать, используя альтернативный субстрат- LaPPi, что будет показано ниже. Эти наблюдения также подтверждают, что MgPPi в эффекторном центре может быть замещен MgPCP. Надо специально заметить, что в отличие от описанной выше активации гидролизы 5 мкМ MgPPi под действием Lysll2Gln-PPa3bi в присутствии 0,5 мМ Mg при рН 7,5 показал, что с увеличением концентрации РСР активации фермента не происходит. Данный факт подверждает нарушение эфекториого центра в этом мутантом белке. Сложностей в интерпретации результатов гидролиза MgPPj и, особенно, WT-РРазой в присутствии эффектора, обусловленная многокомпонентностыо системы, высокими скоростями процесса и большим сродством и субстрата, и эффектора, удается в определенной степени избежать, используя альтернативный субстрат- LaPPi, что будет показано ниже. Существует работа, где в качестве субстрата использовали LaPP; [49].
В ней было показано, что дрожжевая РРаза способна гидролизовать субстраты, в состав которых входит трехвалентный ион металла. В настоящей работе обнаружено, что под действием Y-РРазы, как и в присутствии Е-РРазы зависимость скорости гидролиза от концентрации LaPPj описывается также уравнением Хилла и характеризуется низкой скоростью и плохим связыванием субстрата, где h = 2; Км около 140 мкМ мкМ и Утих=18МЕ(рис.34). Известно, что важным фактором, влияющим на ход гидролиза MgPP,, является концентрация ионов магния, поэтому важно было определить константу связывания активаторного иона металла (иона металла в центре М2) при гидролизе LaPPj. Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ LaPPj от концентрации Mg + (0,5-10 мМ) для Е-РРазы выявляет две константы связывания Mg (Ко 1,28 мМ и 11,2 мМ), что четко видно при представлении данных в двойных обратных координатах (рис.35). Обе константы несопоставимы со сродством ионов магния к фермент-субстратаному комплексу в случае гидролиза MgPPj, где она равна 0,3 мМ (см. стр.50 табл.12). Эти данные показали, что связывание LaPPj очень сильно изменяет сродство Mg2+ к активному центру фермента. Поскольку связывание LaPPj к ферменту приводит к появлению неодинаковых субъединиц, неудивительно, что выявляются две константы связывания металла. Однако увеличение в среде концентрации Mg + с 2 до 15 мМ достаточной для насыщения одного из обнаруженных центров, существенным образом меняет картину гидролиза (рис. 36). При увеличении концентрации ионов магния в реакционной среде, во-первых, происходит некоторое увеличение активности (здесь следует обратить внимание, что больше, чем 75 мкМ LaPPi при 15 мМ Mg использовать невозможно из-за появляющейся опалесценции раствора). Во-вторых, что наиболее интересно, отсутствует сигмоидальный характер зависимости скорости гидролиза от концентрации LaPPi, что означает исчезновение асимметрии субъединиц. В-третьих, происходит увеличение сродства к субстрату. Вследствие этого Км для LaPPi становится равной 100 мкМ. Аналогичные закономерности проявляются и при гидролизе LaPPj Y-РРазой. Можно напомнить, что дрожжевой фермент является димером, и наблюдаемая сигмоидалыюсть подтверждает предположение об индуцировании в присутствии LaPP; двух различных состояний субъедипиц в молекуле. Дрожжевому ферменту свойственно большее сродство к ионам магния (см обзор литературы, стр.18, 21), поэтому более высокая скорость гидролиза LaPPi наблюдается уже при 0,5 мМ Mg2 , Изучение зависимости скорости гидролиза 50 мкМ LaPP; от концентрации ионов магния для дрожжевого фермента также выявили две константы связывания Mg2+ (Ко 0,2 мМ и 2,3 мМ), что четко видно при представлении данных в двойных обратных координатах (рис.37). Но, как и в случае гидролиза MgPPj, при гидролизе LaPPi выявляется также лучшее сродство к ионам магния у дрожжевого фермента по сравнению с Е-РРазой.
Влияние f" на гидролиз lapp
Еще одно интересное свойство Е-РРазы выявлено при действии ионов F" на гидролиз LaPPj, Известно, что при гидролизе MgPPj ионы фтора являются эффективными ингибиторами РРаз [80]. Ипгибирование наступает в результате замещения ионом фтора молекулы воды, которая является нуклеофилом во время гидролиза фросфоаигидридной связи [42]. Механизм ингибирования - Е-РРазы бесконкурентный, то есть фторид - ион присоединяется к фермент-субстратному комплексу, константа ингибирования составляет около 0,1 мМ [32]. Однако, при гидролизе LaPPj в присутствии F" наблюдается увеличение скорости гидролиза, которая достигает максимальной величины при концентрации F 3 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации фторид иона вплоть до 20 мМ вызывает снижение скорости гидролиза, которая остается тем не менее выше, чем в отсутствие фторид иопа (рис. 47). При исследовании переменных концентраций LaPPj в присутствии 3 мМ фторид-иона выявляется дальнейшее увеличение скорости гидролиза, которое сопровождается улучшением связывания субстрата (Км = 64 мкМ) и изменением характера зависимости с сигмоидального (рис. 48 (кривая 1)) на гиперболический (рис. 48 (кривая 2)) ,что в свою очередь свидетельствует об исчезновении асимметрии субъединиц. Эффекты, оказываемые фторид-ионом на гидролиз LaPPi, подобны ээфектам ионов магния, описанным выше. Для РРазы из дрожжей известно (для Е-РРазы нет данных), что F" способен связываться с ионом магния в центре М2 до появления субстрата с константой диссоциации равной 3 мМ [81]. Не исключено, что при гидролизе LaPPj Е-РРазой нарушена координация между металлами в центрах Ml и М2, что в какой-то мере нивелируется присоединением фторида к одному из ионов металла активного центра. Ниже будет рассмотрена активация гидролиза LaPPi под действием РСР. Здесь же можно отметить, что одновременное присутствие F" и РСР в реакционной среде приводит к снижению активации, что может свидетельствовать о едином или перекрывающемся центре их связывания (табл. 22). Существенно также, что активация гидролиза LaPPj проявляется при сходных концентрациях MgPCP для столь разных ферментов - гексамера Е-РРазы, димера Y-РРазы, тримера Е-РРазы и мутантного варианта с заменой Lys па нейтральную аминокислоту в катионном центре. Следовательно, центр связывания эффектора должен обладать свойствами, присущими всем изученным белкам.
В качестве гипотезы можно рассмотреть возможность связывания MgPCP, как и Mgz+ с центром М2. Это предположение основывается на том, что три способа изменения активности при гидролизе LaPPj: увеличение концентрации Mg , добавление фторид-иона и воздействие MgPCP приводят к одинаковому результату - росту активности, исчезновению асимметрии субъединиц и увеличению сродства к субстрату. Как было показано в обзоре литературы (см. стр. 9) ион магния в центре М2 имеет один белковый лиганд - это остаток Asp70, который одновременно связывает два металла в центрах Ml и М2. Связывание MgPCP в центре М2 означает снижение дефицита электронов на ионе металла и ускорение ухода продукта, а, следовательно, и ускорение скорость-лимитирующей стадии. В этом случае ферменты Е-РРаза и Y-РРаза - представители первого семейства сближаются с РРазами второго семейства, для которых типично большое количество лигандов у второго иона металла (см обзор литературы стр. 33). Конкуренция MgPCP с Mg2+ за центр М2 не исключает возможность активации под действием PPj за счет прямого взаимодействия PPj с Mg + в центре М2. Если такое предположение когда-либо подтвердится, то станет попятным необъясненное пока влияние полифосфатов на увеличение скорости распада комплекса, состоящего из фермента, пирофосфата, двух ионов Mg и иона фторида [42, 82]. Уменьшение в этом случае положительного заряда на Mg2+ в центре М2 должно ослаблять связь Mg-F и приводить к диссоциации F" и исчезновению ингибироваЕшя. Ре комби нантная неорганическая пирофосфатаза Е. coli (ЕС 3.6.1.1.) и ее мутантные варианты с единичными заменами Arg43 на Gin, Lysl 12 на Gin, Lysl 15 на Ala, Lysl48 на Gin и два двойных мутанта с заменами Lysl 12/148 на Gin и Lysll2Gln/Lysll5Ala неорганической пирофосфатазы были получены генно-инженерным методом [67]. Asp26Ala-PPa3a и Y-РРаза были любезно предоставлены к.х.и. Куриловой С.А. и д.х.н. А.А. Байковым. Суспензию ферментов хранили в растворе сульфата аммония (90% насыщения) и обессоливали перед использованием на колонке с сефадексом G-50 (fine), уравновешенной 0,05 М Tris-HCl-буфером, рН 7,5. В работе использовали трис-гидроксиметил-аминометан (Tris) фирмы Fluka, N-2-гидроксиэтилпиперазин-г Г-2-этапсульфоновую кислоту (HEPES), хлорид лантана фирмы Fluka, морфолиноэтансульфокислоту (MES) фирмы Fluka, краситель метиловый зеленый фирмы Fluka, пирофосфат натрия фирмы Sigma, Triton Х-305 фирмы Merck, Sephadex G-50 fine фирмы Pharmacia fine Chemical, гуанидингидрохлорид (GuHCl) и метилендифосфоновуїо кислоту фирмы Sigma, MgCl2-6H20 фирмы Fluka. Остальные реагенты были отечественного производства квалификации пе ниже "хч". Во всех опытах использовали титрованные растворы MgCh, все растворы готовили на дважды деионизованной воде.
Кристаллическую П3РО4 растворяли в воде и определяли концентрацию Р; с помощью полуавтоматического анализатора фосфат-иона [70]. 4.2. Методы исследования. Обессоливаиие растворов белка. Все белки хранили в виде суспензии в растворе (N1-14)2804 при температуре 4С. Непосредственно перед использованием необходимое количество суспензии центрифугировали в течение 10 мин при скорости 10000 об/мин, отделяли осадок от раствора методом декантации, полученный осадок растворяли в минимальном количестве 0,05 М Tris-HCl, рН 1,5. Полученный раствор пропускали через колонку (0=4 мм, / = 20 см) с Sephadex G-50 fine, уравновешенную тем же буфером. Собирали фракции по 400 мкл. Определение концентраций веществ. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение при 280 нм и используя величину АЦі 11,8 [80]. Концентрацию базовых растворов MgClj определяли титрованием ЭДТА в присутствии эриохрома черного Т. Определение ферментативной активности. Начальные скорости гидролиза PPj определяли по скорости образования неорганического фосфата путем непрерывного измерения концентрации Pj иа полуавтоматическом анализаторе фосфата [83]. Чувствительность прибора составляла 5-10 мкМ Рі на полную шкалу прибора. Реакцию гидролиза MgPPi или LaPPj проводили в 0,05 М Tris-HCl буфере, рН 7,5, при температуре 25С. Реакционная смесь объемом 10 мл содержала буфер, определенные концентрации Mg и переменные концентрации MgPPj или LaPPj. Реакцию начинали добавлением фермента. Удельную активность выражали в международных единицах (ME). Международная единица активности определяется как количество мкмолей субстрата, расщепляемое 1 мг фермента за 1 мин. Кинетические измерения повторяли 2-3 раза, линейность образования продукта сохранялась в течение всего времени определения активности. Определение олигомерных форм ферментов. Седішентационньїй анализ. Скоростную седиментацию осуществляли на аналитической ультрацептрифуге Spinco Е при 48000 об/мин, 20 или 4С и сканировании при 280 нм. Коэффициент седиментации рассчитывали по стандартной методике [84]. Концентрация фермента составляла от 5мкМ в расчете на субъединицу. Спектрофотометрическое титрование. Спектрофотометрическое титрование проводили на спектрофотометре "Ultraspek"-3000 (Pharmacia Biotech, Швеция). Дифференциальные спектры РРазы и ее мутантных вариантов снимали в диапазоне 230-340 нм при рН 9,0 (0,05 М Tris-HCl) и концентрации белка 20 -30 мкМ. Непрерывное титрование фермента проводили, добавляя аликвоты Mg (5-6 мкл) непосредственно в кювету таким образом, чтобы его концентрация варьировалась в диапазоне от 0,01 до 50 мМ. Конечное изменение объема смеси не превышало 5 %. Константу диссоциации комплекса РРазы с Mg2+ в центре М2 рассчитывали из зависимости максимума поглощения при 240 нм от концентрации ионов Mg2"1", как описано в [71].
