Введение к работе
Актуальность проблемы. В семействе факторов регуляции кроветворения человека ідно из ключевых положений занимает гранулоцитарно-макрофагальный :олониестимулирующий фактор (GM-CSF), представляющий собой кислый гликопротеин молекулярной массой 23-29 кДа. Он обладает плейотропным действием в отношении тволовых клеток миелоидного ряда, в частности, стимулирует рост и пролиферацию іредшественников гранулоцитов и моноцитов, а также оказывает влияние на функции релых эффекторных клеток этого ряда. Благодаря свойству GM-CSF стимулировать емопоэз in vivo и активировать нейтрофилы и моноциты открываются широкие іерспективьі его использования в терапии ряда заболеваний иммунной и кроветворной истемы (анемических и миелодиспластических синдромов, нейтропении, СПИДа и .р.), а также последствий лучевой и химиотерапии опухолевых заболеваний, что делает резвычайно актуальной задачу получения этого белка в значительных количествах для іедицинских целей.
Источником GM-CSF в организме человека являются Т-лимфоциты, макрофаги и іекоторьіе другие клетки, синтезирующие белок-предшественник (144 а.о.), зрелая форма второго получается путем отщепления сигнального пептида (17 а.о.) в процессе ранспорта через мембрану эндоплазматического ретикулума. Однако выделение GM-^SF из природных источников затруднено из-за чрезвычайно низкого содержания в [их белка.
В литературе описано получение GM-CSF человека путем экспрессии оответствующего гена в трансформированных клетках млекопитающих или в дрожжах. (первом случае рекомбинантный белок имеет правильную пространственную структуру, о выделение его в больших количествах затруднено из-за невысокого уровня биосинтеза. Ірожжевьіе клетки обеспечивают более высокий уровень экспрессии гена, однако в том случае препятствием для использования препарата является специфическое для рожжей посттрансляционное гликозилирование.
Эти проблемы могут быть решены путем создания бактериальных штаммов-родуцентов. Отсутствие системы гликозилирования белков в бактериальных клетках е является препятствием, поскольку известно, что удаление углеводного компонента е влияет на биологическую активность GM-CSF. Однако высокий уровень синтеза екомбинантного белка может приводить к образованию нерастворимых тел включения, енатурация которых сопровождается деградацией бактериальными протеиназами и евысоким выходом активного препарата. Наиболее перспективным подходом к созданию системы экспрессии гена GM-CSF
человека представляется соединение его с регуляторними и структурными элементен обеспечивающими выход в периплазматическое пространство бактериальной клеті Это позволяет обойти указанные затруднения и получать белок в нативной форі Данная работа была посвящена разработке такой системы и штаммов-продуцен7 рекомбинантного GM-CSF человека. Работа была выполнена в 1991-1995 годах лаборатории химии генов ИБХ РАН. Финансирование проводилось в рамках програмі "Новые методы биоинженерии", раздел "Генная и клеточная инженерия".
Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению возможности использован сигнальных последовательностей различных секретируемых белков для транспорта Gi CSF в периплазматическое пространство Е. coli и созданию штаммов-продуцентов Gi CSF человека. Поставленные задачи также включали подбор условий культивирован! рекомбинантных штаммов, разработку схемы выделения и характеристику полученні белков.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанні работы сконструированы гены гибридных предшественников, включающих сигнальні последовательности белков ОтрА Е. coli и CafI У. pestis и GM-CSF, а также гибридні ген spa-gmcsf, кодирующий гибрид IgG-связывающих доменов белка A St. aureus GM-CSF. Произведен подбор штаммов и условий культивирования, обеспечивающі оптимальный уровень экспрессии полученных генов и транспорта рекомбинантно GM-CSF в периплазматическое пространство Е. coli.
Впервые продемонстрирована возможность использования сигнальне последовательности белка CafI для создания системы гетерологичной секреции. Изучені влияния аминокислотных замен в N-концевой части зрелого GM-CSF показало, ч-нейтрализация положительного заряда остатка аргинина в этой области приводит существенному повышению эффективности транслокации и процессинга гибридно: предшественника Cafl-GMCSF. Полученные результаты способствовали создани штаммов Е. coli - продуцентов N-концевых производных GM-CSF человек, обнаруживающих сходную биологическую активность и взаимодействующих с антителам к рекомбинантному GM-CSF человека, а также разработке схемы выделения эти белков с сохранением их нативного состояния из периплазматического пространстЕ бактерий.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Перво Евроазиатском Симпозиуме по биотехнологии (Турция, 1995 г.) и Первой Всероссийскс конференции по клинической иммунологии (Москва, 1995 г.
