Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ (Обзор литературы)
Введение
Глава I. ААА+-белки
1.1. Строение и классификация AAA -белков
1.2. ААА-АТР-азы и контроль качества внутриклеточных белков
1.2.1. Шапероновые системы бактерии
1.2.2. Широкая специфичность и высокая селективность AAA'-AT?-аз
1.2.3. Адапториые белки
Глава 2. Протеолитические системы, осуществляющие селективную деградацию внутриклеточных белков
2.1. АТР-зависимая деградация белков у эубактерий
2.2. АТР-зависимая деградация белков у эукариот
2.3. АТР-зависимая деградация белков в архебактериях
2.4. Общие характеристики функционирования эиергозависимых нротеиназ и протеолитических комплексов
2.4.1. Общий моторный модуль ААА~-протеиназ
2.4.2. Связь между АТР-азными и петпидазными составляющими
AAA -протеиназ
2.4.3. Общая стратегия узнавания мишеней А ТР-зависимыми протеиназами
2.4.4. Катализ процесса механического разворачивания белков AAA' -А ТР-азами
2.4.5. Энергетическая цена селективного протеолиза
2.4.6. Энергозависимое разрушение стабильных белковых комплексов
Заключение
РАЗДЕЛ 2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli (Результаты работы и их обсуждение)
Глава 1. Структурная характеристика Lon-протеиназы Е. coli
1.1. Доменное строение Lon-протеиназы
1.2. Протеолитические центры ферментов семейства Lon-нротеиназ
1.3. Подсемейства в семействе Lon-иротеиназ
1.4. Активные центры Lon-протеиназ и других пептидгидролаз с каталитической диадой Ser - Lys
1.5. Заключение
Глава 2. Закономерности функционирования нативной Lon-протеиназы Е. coli
2.1. АТР-азная активность Lon-протеиназы in vitro
2.1.L АТР-азная активность Lon-протеиназы и содержание ионов Mg'^
2.1.2. Влияние аденозиндифосфата на АТР-азную активность Lon-протеиназы
2.13. Дополнительные центры связывают белкового субстрата в структуре Lon-протеиназы
2.1.4. Функциональное значение эффекта активации гидролиза АТР
Lon-протеиназой в присутствии белкового субстрата
2.1.5. Заключение
2.2. Активность протеолитических центров Lon-протеиназы in vitro
2.2.1. Выбор субстратов для исследования функционирования протео.їитических
центров Lon-протеиназы
2.2.2. Сравнительная характеристика гидролиза белковых и пептидных
субстратов Lon-протеиназой (в стандартных условиях)
2.2.3. Влияние нуклеотидов и ионов магния на функционирование тптидазных
центров Lon-протеиназы
2.2.4. Взаимовлияние субстратов протеолитических центров Lon-протеиназы
2.2.5. Заключение
Глава 3. Мутантные формы Lon-протеиназы и их характеристика
3.1. Мутантные формы Lon-протеиназы, несущие замены в ААА*-модуле
3.1.1. Получение мутантов Lon-протеиназы
3.1.2. Энзиматические свойства мутантних форм Lon-протеиназы in vitro
3.1.3. Функциональная активность мутантних форм Lon-протеиназы in vivo
3.1.4. Особенности функционирования мутантних форм Lon-протеиназы
3.2. Уникальные свойства мутанта Lon~K362Q
3.2.1. Влияние нуклеотидов и ионов магния на пептидазную активность
мутанта Lon-K362Q
3.2.2. Комплементация мутаций Lon-K362Q и Lpn-S679A
3.2.3. Олигомерное состояние Lon-протеиназы и мутанта Lon-K3 620
3.3. Заключение
Глава 4. Укороченные формы Lon-протеиназы и их характеристика 173
4.1. Получение укороченных и модифицированных форм Lon-протеиназы 173
4.1 Л. Рекомбинантныеукороченные формы Lon-протеиназы 173
4.1.2. Укороченные формы Lon-протеиназы, полученные ограниченным
протеолазом 174
4.2. Энзиматическая активность укороченных и модифицированных форм
Lon-протеиназы 175
4.2.1. АТР-азная и протеолшпическая активность укороченных и модифицированных форм Lon-протеиназы 178
4.2.2. Пептидазная активность укороченных и модифицированных форм
Lon-протеиназы 182
4.3. Заключение 185
Глава 5. Кристаллическая структура индивидуальных доменов
Lon-протеиназы 186
5.1. Описание структур протеолшпического и а-спиршшзованного доменов 186
5.2. Олигомерное строение протеолитического домена Lon-протеиназы 191
5.3. Протеолитический центр Lon-протеиназы 193
5.4. Сопоставление протеолитического домена Lon-протеиназы Е. coli и ряда
протеиназ, имеющих каталитическую диаду Ser - Lys в активных центрах ] 96
5.5. Различия в связывании субстратов Lon-протеиназой и сериновыми протеиназами, имеющими в активном центре триаду Ser-His(Glu)-Asp 200
5.6. Заключение 202
Перспективные направления в исследовании протеиназ семейства
Lon (заключение) 203
РАЗДЕЛ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 205
3.1. Материалы 205
3.1.1. Реактивы 205
3.1.2. Ферменты 206
3.1.3. Штаммы Е. coli 206
3.2. Методы _ 206
3.2.1. Сопоставление аминокислотных последовательностей белков 206
3.2.2. Процедуры, использованные при работе с клетками 206
3.2.3. Сайт-направленный мутагенез гена ton 207
3.2.4. Выделение и очистка Lon-протеиназы, ее мутантных и укороченных форм 207
3.2.5. Ограниченный протеолнз Lon-протеиназы и ее мутантных форм. Выделение фрагментов фермента 209
3.2.6. Исследование смешанных олигомеров Lon-протеиназы 211
3.2.7. Тестирование ферментативной активности 211
3.2.8. Исследование олигомерного состояния натавной Lon-протеиназы 214
3.2.9. Кристаллизация индивидуальных доменов Lon-протеиназы 215
ВЫВОДЫ 216
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 219
ПРИЛОЖЕНИЕ 247
Источники Lon-протеиназ 248
Индексы последовательностей Lon-протеиназ в базе данных MEROPS 249
Сопоставление первичных структур LonA-протеиназ (табл. А1-А9) 250
Сопоставление первичных структур LonB-протеиназ (табл. В1-В7) 274
Введение к работе
Глава I. ААА+-белки
Строение и классификация AAA -белков
АААЛ'-АТР-азы и контроль качества внутриклеточных белков
Шапероновые системы бактерии
Широкая специфичность и высокая селективность AAA'-AT?-аз
Адапториые белки
ААА+-белки
В последнее десятилетие сформировалось представление о существовании суперсемейства ААА+-белков как важнейшего сообщества АТР-аз, вовлеченных в протекание широкого круга самых разнообразных фундаментальных процессов, включающих внутриклеточную деградацию белков, разрушение комплексов белок-белок или белок-нуклеиновая кислота, слияние мембранных везикул, биогенез органелл, реорганизацию цитоскелета и клеточных мембран, репликацию и рекомбинацию ДНК, а также активацию транскрипции. Аббревиатура «AAA» означает весьма мало конкретизированное определение «АТР-азы, ассоциированные с различными клеточными активностями», нивелирующее разнообразие членов сообщества, функциональная активность которых отражается в специфической номенклатуре. Вместе с тем наиболее обобщающей характеристикой ААА"7-белков можно считать определение их как «медиаторов сборки и диссоциации макромолекулярных комплексов», данное в публикации, резюмирующей материалы IV Конференции по AAA-белкам [7]. Отнесение какого-либо белка к ААА+ суперсемейству основывается на наличии ряда характерных элементов первичной структуры, которые, в свою очередь, лежат в основе уникальной структурной организации этих белков.
AAA -белки выполняют очень большую и тяжелую работ; в клетке: именно они организуют или диссоциируют комплексные структуры, разворачивают или разгибают макромолекулы, осуществляют внутриклеточный транспорт макромолекул. Такая механическая работа нуждается в хемо-механическом преобразователе, и эту роль выполняет основной структурный модуль ААА+-белков - АТР-азный модуль [7]. Этот «моторный модуль» связан с другими доменами ААА+-белков, которые служат «действующими головками», взаимодействуя с субстратами-мишенями либо непосредственно, либо через адапторные молекулы. Таким образом, сочленения между моторной и действующими частями служат в качестве сопрягающих устройств, превращающих движения мотора в специализированные действия, требуемые для проявления той или иной активности [7].
К настоящему времени с помощью структурного и филогенетического анализа обозначено место AAA -белков в общей совокупности АТР-гидролизующих ферментов, выявлены уникальные свойства и механизмы функционирования ряда ААА+-белков, в некоторых случаях установлены связи между ферментативными свойствами ААА -белков (такими как гидролиз АТР, информационные изменения, активация протеолиза) и их биологическими проявлениями (например, воспрепятствование образованию аберрантных белковых агрегатов в клетках). Таким образом, все более выявляется важность AAA -белков как внутриклеточных регуляторных систем и вместе с тем как моделей для структурного и механистического исследования АТР-зависимых ферментов, функционирующих по принципу переноса энергии.
Основой функционирования ААА+-белков является сопряжение гидролиза АТР с изменением копформаиии белка, что приводит к переорганизации (рефолдингу) или ремоделированию их молекулярных субстратов (шатроиовая активность ААА+-белков). К настоящему времени достигнут значительный прогресс в определении трехмерной структуры ряда AAA-белков методами рентгеноструктурного анализа или электронной микроскопии, что позволило приблизиться к пониманию структурных основ хемо-механического сопряжения, катализируемого этим уникальным сообществом АТР-аз. Получены сведения о регуляторных факторах и адапторных белках, которые определяют участие тех или иных ААА-АТР-аз в соответствующих процессах in vivo, обеспечивая их уникальную селективность по отношению к клеточным мишеням и иногда даже изменяя природу протекающих реакций. Наконец, до сих пор открываются все новые и новые проявления роли AAA -белков в физиологических процессах наряду с накоплением примеров того, как недостаточность в функционировании ААА+-белков у человека может приводить к ряду заболеваний.
Структурная характеристика Lon-протеиназы Е. coli
АТР-зависимая Lon (или Ьа)-протеииаза (ЕС 3.4.21.53; MEROPS, клан SJ; Ш: S16.001 [ , "J]) - первая протеиназа, принадлежащая к суперсемейству ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с другими клеточными активностями) [2!], была обнаружена в 1970-х годах [107, 1П, 2вА, 2( ] в клетках Е. coli. В дальнейшем аналоги Lon-протеиназы Е. coli были найдены практически во всех исследованных объектах бактериального происхождения, а также в эукариотах и архебактериях. К настоящему времени известен уже ряд АТР-зависимых (или ААА+-) протеиназ (Lon. FtsH, ClpAP, ClpXP. HslUV), функционирующих в цитозоле клеток прокариот и в митохондриях клеток эукариот, а также мультикаталитические комплексы (протеасомы), включающие АТР-азы ААА+-типа. которые функционируют в цитозоле эукариот и архей (см. Раздел 1 - Обзор литературы).
АТР-зависимые протеиназы отличаются от классических протеолитических I ферментов наличием следующих уникальных характеристик (см. Раздел 1):
1 - АТР-зависимые протеиназы проявляют высокую селективность, поскольку производят отбор мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться.
2 - Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР.
3 - Деградация белков-субстратов происходит по процессиєному механизму, т.е. без высвобождения высокомолекулярных промежуточных продуктов. При этом специфичность ферментов по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемую связь, не выражена.
4 - Все АТР-зависимые протеиназы являются мультисубъединичиыми
ферментами - гомо- или гетероолигомерами.
Для гетероолигомерных АТР-зависимых протеиназ (ClpAP, ClpXP, HslUV) в последнее время определены пространственные структуры и охарактеризованы отдельные стадии фермент-субстратного взаимодействия. Для гомоолигомерных AAA -протеиназ -Lon и FtsH - такие данные до недавнего времени не были получены. Только в 2002-2003 г.г. стала доступной пространственная структура АТР-азного модуля FtsH (см. Раздел 1). Первые сведения о пространственной структуре фрагментов Lon-протеиназы Е. coli являются одним из результатов настоящего исследования. Вместе с тем для всех АТР-зависимых протеиназ остаются во многом нерешенными проблемы выяснения роли сопряжения гидролиза ATP и протеолиза и механизма этого процесса, а также установления принципов селективного узнавания ферментами белковых субстратов мишеней.
Общая задача настоящего исследования состояла в выявлении особенностей строения и функционирования Lon-протєиназ, которые определяются сопряжением протеолиза и гидролиза АТР и отличают Lon-протеиназы как от "классических" протеиназ, так и от других АТР-зависимых протеиназ. В качестве модельного фермента была выбрана Lon-протеиназа из Е. coli (далее - Lon-протеиназа или cLon),
Для исследования эффективности функционирования протеолитических центров Lon-протеиназы были использованы белковый субстрат - fi-казеин (мол, масса 23623 Да, далее - казеин), олигопептидный субстрат - мелиттин (мол. масса 2847 Да) и низкомолекулярный субстрат - тиобензиловый эфир трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ, мол, масса 632 Да). Эффективность функционирования АТР-азных центров оценивали по степени гидролиза АТР,
Материалы
В работе были использованы: дрожжевой экстракт, триптон, бакто-агар ("Difco", Англия); агароза ("Bio-Rad", США); трис-(гидроксиметил)-аминометан (Tris). 3-(N-морфолино)-пропансульфоновая кислота (MOPS), Н-(2-гидроксиэтил)пиперазин Ы "(2-этансульфоновая кислота) (HEPES), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), додецилсульфат натрия (SDS), [З-меркаптоэтанол, НК,Ы .]\ -тетраметшгэтилендиамин (TEMED), персульфат аммония (PSA), кумасси R-250, дитиотреитол (DTT), глицерин, бычий сывороточный альбумин (BSA), а-казеин, (3-казеин, дефосфорилированный казеин, бромистый этидий, фенилборная кислота (PheBfOH) ), фенилметилсульфонилфторид (PMSF). 4.4 -дитиодипнридин (DTDP), Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ), ADP, а,3-метилєн-АТР (АМРСРР), изопропил-р-О-тиогалаїсгопиранозид (IPTG) ("Sigma", США); аллил(58,68)-6-[" )-ацетоксиэтил]-пенем-3-карбоксилат (ААРС) (Англия); АТР ("Boehringer Mannheim", Германия); 2 -дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (dNTPs) ("Reanal". Венгрия); акриламид, метиленбисакридамид ("ВІо-Rad", США); ампициллин, нитроцеллюлоза, сцннтиллятор ("Serva", Германия); бромфеиоловый синий ("Koch Light", Англия): глицин, глюкоза, трихлоруксусная кислота (ТХУ), трифторуксусная кислота (TFA), гуанидин гидрохлорид, мочевина, ацетат натрия, ацетат цинка дигидрат, молибдат аммония ((ТЯН4)бМо70;4 х 4Н2О), фенол, метанол, этанол, изопропанол, хлороформ, ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), мочевина, дигидрофосфат калия, тригидрат гидрофосфата калия, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, соляная кислота ("Реахим", Россия), голубой декстран и белковые стандарты для электрофореза ("Pharmacia , Швеция); нитроцеллюлозные мембраны NA-45 ("Schleicher & Schueli 7, Германия).
В качестве компонентов буферов использовали соли фирмы "Мегк"(Германия) и отечественного производства квалификации "ос.ч." или "х.ч."
Для выделения белков использовали сорбенты: фосфоцеллголоза Р-11 ("Whatman". Англия); DEAEoyopearl, DEAE-Sephacel, Q-сефароза, гепарин-сефароза, Superose-6, Sephacryl S-300, Superdex 75 ( Pharmacia", Швеция), глутатион-агароза ("Sigma", США).
