Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. G-белки и ГТФ-азы трансляции 8
1.1.1. Общие свойства G-белков 8
1.1.1.1. Структура GTP связывающего центра (G домена) 8
1.1.2. Механизм активации гидролиза GTP 11
1.1.3. Цикл работы ГТФ-азы 13
1.2. Факторы трансляции 14
1.2.1.EF-TU 16
1.2.2. EF-G 18
1.2.3. IF2 20
1.2.4.RF3 22
1.2.5. Роль гидролиза GTP и освобождения Р( в функционировании факторов трансляции 25
1.2.6. Активация ГТФ-азы факторов трансляции при взаимодействии с рибосомой 27
1.3. Заключение 29
2. Транслокация и элонгационный фактор G 31
2.1. Механизм действия EF-G и гидролиз GTP в процессе транслокации 31
2.2. Расположение EF-G на рибосоме 37
2.3. Структурные изменения EF-G и рибосомы в процессе транслокации 40
2.4. Роль спирали 34 в транслокации 43
3. Результаты и обсуждение 46
3. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой 46
3.1. Места введения фотоаффинного реагента в EF-G 46
3.2. Модификация фотоаффинным реагентом 46
3.3. Проверка функциональной активности модифицированного фактора 49
3.4. Формирование рибосомных комплексов с модифицированным EF-G 50
3.5. Анализ сшивок радиоактивно меченного EF-G 51
3.6. Применение иммунологических методов для анализа продуктов фотохимического сшивания 52
3.7. Заключение 54
4. Мутации в спирали 34 16S рРНК 55
4.1. Выбор мест введения мутаций в 16S рРНК 55
4.2. Введение мутаций в 16S рРНК (мутагенез) 57
4.3. А7 штамм для экспрессии мутантных рРНК (МС250) 58
4.4. Измерение времени удвоения клеток 59
4.5. Выделение рибосом и проблема диссоциации рибосом 60
4.6. RT-анализ наличия мутаций в рРНК и определение чистоты популяции рибосом 61
4.7. Зависимость степени диссоциации рибосом от концентрации Мд2+ 62
4.8. Инициация и зависимость эффективности инициации от концентрации Мд2+. 64
4.8.1. Инициация при 7 мМ Мд2+ 64
4.8.2. Зависимость выхода образования инициаторного комплекса от концентрации Мд2+ 65
4.9. Эффективность связывания аа-тРНК с А участком рибосомы и образования претранслокационного комплекса 66
4.10. Связывание с А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном 67
4.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) 70
4.12. Метод престационарнои кинетики (остановленного потока) и оборудование для него 75
4.12.1. Устройство установки для проведения кинетических экспериментов методом остановленного потока 75
4.12.2. Профлавин - флуоресцентная метка втРНКРЇ1е 76
4.13. Престационарная кинетика связывания аа-тРНК с А участком рибосомы 77
4.14. Престационарная кинетика элементарного акта транслокации 80
4.15 Определение точности трансляции in vivo 84
4.16. Пробинг 16S рРНК 89
4.16.1. Химический пробинг всей последовательности 16S рРНК 90
4.16.2. Пробинг 16S рРНК в инициаторном комплексе 92
4.17 Заключение 97
5. Протонированные основания в рРНК 99
5.1. Роль протонированных нуклеотидов 23S рРНК в пептидилтрансферазной реакции и катализе гидролиза GTP на EF-G 99
5.2. Боргидридный метод определения заряженных оснований в РНК 100
5.3. Пара CH+2575-U2511 101
5.4. НуклеотидА1528 103
5.4. Заключение 104
6. Материалы и методы 106
6.1. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой 106
6.1.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G 106
6.2. Выделение и очистка EF-G 106
6.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом 107
6.4. Формирование комплекса EF-G с рибосомой 108
6.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном 108
6.4.2. Фосфорилирование EF-G в рибосомном комплексе 108
6.5. Разделение модифицированных компонентов рибосомы 108
6.6. Анализ продуктов фотохимической модификации с помощью антител 109
7. Мутации в спирали 3416S рРНК 110
7.1. Трансформация клеток Escherichia coli 110
7.1.1. Получение компетентных клеток 110
7.1.2. Трансформация 110
7.2. Введение мутации в рРНК (мутагенез по методу Кункеля) 111
7.3. Создание А7 штаммов МС250 и AVS69009, несущих мутированный рибосомный оперон на плазмиде pSTLxxxx 112
7.4. Измерение времени удвоения клеток 113
7.5. Стандартная методика выделения рибосом 113
7.6. Выделение рибосом при повышенной концентрации Мд2+ 115
7.7. Проверка наличия мутации врибосомной РНК (RT анализ) 115
7.7.1. Выделение рибосомной РНК 115
7.7.2. Реакция обратной транскрипции 116
7.8. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц от концентрации Мд2+ 117
7.9. Образование инициаторных комплексов 117
7.9.1. Стандартные условия (7 мМ Мд2+) 117
7.9.2. Формирование инициаторных комплексов при различной концентрации Мд2+ 117
7.10. Определение константы скорости траслокации в единичном акте транслокации (престационарная кинетика, метод остановленного потока) 117
7.10.1. Формирование претраслокационного комплекса с профлавинированной TPHKPhe 117
7.10.2. Получение кинетических кривых (метод остановленного потока) 118
7.11. Определение каталитической константы в многократном акте транслокации (стационарная кинетика) 119
7.11.1. Формирование претраслокационного комплекса 119
7.11.2. Получение кинетических кривых 119
7.12. Анализ образования дипептида 120
7.13. Кинетика связывания тройного комплекса EF-Tu(His)»GTP«[14C]Phe-TPHKPhePrf с А участком рибосомы (престационарная кинетика, метод остановленного потока) 120
7.13.1. Формирование тройного комплекса в профлавинированной TPHKPhe 120
7.13.2. Формирование инициаторного комплекса 121
7.13.3. Получение кинетических кривых (stopped flow) 121
7.14. Определение точности трасляции in vivo 121
7.14.1. Получение штаммов МС127, содержащих плазмиду pSTLxxxx 121
7.14.2. Определение активности р-галактозидазы 121
7.15. Химический пробинг рибосомных субчастиц, рибосом, рибосомных комплексов и анализ модификаций 122
7.15.1. Реактивы, растворы и буферы 122
7.15.2. Модификация DMS 123
7.15.3. Модификация кетоксалем 123
7.15.4. Модификация СМСТ 124
7.15.5. Выделение суммарной рибосомной РНК 124
7.15.6. Реакция обратной транскрипции 124
8. Протонированные основания в 23S рРНК 126
8.1. Модификация РНК боргидридом натрия 126
8.2. Реакция обратной транскрипции 127
Выводы 128
- Факторы трансляции
- Расположение EF-G на рибосоме
- Формирование рибосомных комплексов с модифицированным EF-G
- Связывание с А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном
Введение к работе
{
Актуальность проблемы. Рибосома является сложным рибонуклеопротеидным комплексом живой клетки, который синтезирует белок, используя в своей работе аминоацил-тРНК и считывая информацию с мРНК. Биосинтез белка является сложным химико-биологическим процессом, на разных стадиях которого с рибосомой взаимодействуют различные факторы трансляции, причем взаимодействие происходит строго определенным образом и с определенными участками рибосомы. Одним из важных процессов в цикле трансляции является транслокация, т.е. перемещение комплекса мРНК-тРНК в рибосоме на один кодон. Этот процесс катализируется элонгационным фактором G (EF-G). В ходе транслокации EF-G взаимодействует с обеими субчастицами рибосомы (30S и 50S). Накоплено много данных о взаимодействии EF-G с 50S субчастицей, однако, молекулярный механизм активации ГТФ-азы EF-G до сих пор неизвестен. Данных о взаимодействии EF-G с 30S субчастицей накоплено немного. Известно, что одним из элементов 30S субчастицы, играющим важную роль в транслокации, является спираль 34 16S рРНК. В данной работе была изучена роль домена IV EF-G и спирали 34 16S рРНК в механизме транслокации мРНК и тРНК на 30S субчастице, а также проведен поиск протонированных нуклеотидов 23S рРНК, которые могут принимать участие в работе функционально важных центров 50S субчастицы. Цель работы:
-
Поиск контакта домена IV EF-G с 30S субчастицей рибосомы с помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции;
-
Исследование влияния важных для транслокации нуклеотидов спирали 34 16S рРНК на функционирование рибосомы in vitro на разных этапах трансляции с помощью сайт-направленного мутагенеза этих нуклеотидов;
-
Изучение влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на точность трансляции in vivo;
-
Исследование влияния мутаций в спирали 34 16S рРНК на структуру декодирующего центра и всей 30S субчастицы с помощью химического пробинга;
-
Поиск в рРНК протонированных оснований, имеющих функциональное значение, с помощью нового метода определения протонированных оснований в РНК.
Научная новизна и практическая значимость. Контакты домена IV EF-G с 30S
субчастицей Escherichia coli исследовали с помощью нового варианта метода
фотоаффинного химического сшивания, разработанного в настоящей работе. Этот
метод позволяет сайт-специфически вводить фотометку на поверхность домена IV
EF-G. О контактах домена IV с компонентами 30S субчастицы можно судить по
образованию сшивок. Было показано, что домен IV EF-G контактирует с элементами
30S субчастицы. Разработанный вариант ме4о$ФЩ№ШЦ>ЩМШ№Щлтеского
1 БИБЛИОТЕКА |
| С. Петербург /V~/ *
і OS 2MrS аак&Э I \
4 сшивания может быть применен для исследования пространственного окружения белков в различных рибонуклеопротеидных комплексах.
Для исследования участия спирали 34 16S рРНК в процессах трансляции, в частности, в транслокации, в настоящей работе методами сайт-направленного мутагенеза заменяли ряд нуклеотидов. Выбор мест мутаций производили на основании данных о консервативности этих нуклеотидов, защитах их от химической модификации и расположению в третичной структуре 30S субчастицы. Таким образом, нарушали природные контакты внутренних элементов спирали 34, а также контакты спирали 34 с другими элементами 30S субчастицы.
Для анализа фенотипа полученных мутантов измеряли скорость роста клеток, точность трансляции in vivo и изучали протекание отдельных этапов трансляции in vitro. В работе использовали спектр кинетических методов, позволяющих исследовать как стационарную, так и престационарную кинетику. Подходы престационарной кинетики (например, метод остановленного потока) позволяют получить информацию об элементарных стадиях механизма функционирования рибосомы на разных этапах трансляции.
В работе был получен ряд мутаций в спирали 34 16S рРНК, оказавшихся нелетальными для клетки. Такие мутантные рибосомы были выделены в чистом виде, без примеси рибосом дикого типа, и исследованы биохимическими и кинетическими методами in vitro.
С помощью химического пробинга было установлено, что мутации в спирали 34 влияют как на локальную структуру декодирующего центра, так и на структуру участков 30S субчастицы, важных для ее взаимодействия с 50S субчастицей.
Таким образом, в работе был применен комплексный подход, основанный на методах определения точности трансляции in vivo и in vitro, а также различных вариантах химического пробинга структуры РНК, позволяющих исследовать роль нуклеотидов рРНК в функционировании рибосомы. Этот подход может быть успешно использован для исследования широкого круга рибонуклеопротеидных комплексов и его разработка является важным этапом в развитии методов изучения процессов трансляции.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: VII Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-2000, Москва, Россия, 2000 г.; Международная конференция "Trends In Nucleic Acid Chemistry", Москва, Россия, 2000 г.; Международная конференция, посвященная юбилею А.С.Спирина, "Синтез белка", Пущино, Россия, 2001 г.; Международная конференция "The Dinamics of Ribosome Structure and Function", Квинстаун, Новая Зеландия, 2002 г.; 6-я Международная конференции памяти В.А. Энгельгардта по молекулярной биологии, Москва, Россия, 2003.
5 Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 74 рисунками и 14 таблицами. Библиографический указатель включает 211 цитированных работ.
Факторы трансляции
Элонгационные факторы Tu (EFu) и G (EF-G), принимающие участие в трансляции, также как инициаторныи фактор 2 (IF2), структурно схожи и принадлежат к одному и тому же классу ГТФ-аз [10]. Были получены пространственные структуры следующих комплексов факторов трансляции: EFu»GDP [30-32], EFu GDPNP [33, 34], тройного комплекса EFu«GDPNP«aaPHK [35, 36], EF-G [37] и EF-G GDP [38, 39], инициаторного фактора IF2/elF5B в свободной форме, в неактивной GDP-связанной форме и активной GTP-связанной форме [40] (рисунок IA.4). Пространственная структура фактора терминации RF3 на данный момент не определена. GTP-связывающие домены белков EF-G, EFu и IF2/elF5B подобны по структуре. Также очень сходны по структуре домены 2 EF-G и EFu и С-концевой домен IF2 [40-42]. Домены 3, 4 и 5 EF-G подобны домену аа-тРНК (антикодоновая и D петли) в комплексе EFu»GDPNP«aaPHK по пространственному расположению, форме и распределению отрицательного заряда, что позволило предположить и функциональное подобие — "молекулярную мимикрию" [35,43-45]. "Молекулярная мимикрия" была затем распространена на другие факторы трансляции, т.е. высказано Для факторов трансляции механизм гидролиза GTP, скорее всего, отличается от механизма действия Ras-подобных белков, так как детальная структура их активного центра отлична от структуры активного центра Ras-подобный белков и Ga белков [50]. Собственная (некатализируемая) ГТФ-азная активность факторов трансляции очень мала и увеличивается на несколько порядков при взаимодействии с рибосомой. До сих пор неизвестно каким образом рибосома катализирует гидролиз GTP. Согласно существующему на данный момент мнению рибосома либо предоставляет остаток, который непосредственно участвует в катализе, либо индуцирует и стабилизирует структурное изменение в самом факторе, которое и приводит к гидролизу GTP. Общий механизм действия G-белка предполагает, что белок переключается между двумя состояниями: "неактивным", в котором он связан с GDP, и "активным", в котором в активном центре белка находится молекула GTP [1]. Роль гидролиза GTP заключается в "выключении" контактов G-белка с белком-эффектором. До недавнего времени полагали, что ГТФ-азы трансляции функционируют подобным же образом [51], т.е. как молекулярные переключатели.
Однако, в свете последних данных стало ясно, что только механизм функционирования EFu и фактора терминации RF3 можно вписать в рамки этой модели, в то время как для EF-G и IF2 механизм функционирования другой [52-54]. IA.2.1. EFu EFu в виде комплекса EFu GTP aa-тРНК катализирует связывание аа-тРНК с А участком рибосомы. На основании данных, полученных многими лабораториями и исследовательскими группами за последние 30 лет, была предложена схема функционирования EFu (рисунок IA.5) [55, 56]. На первом этапе происходит начальное связывание тройного комплекса EFu GTP aa-тРНК с 70S рибосомой [57], за которым следует стадия узнавания кодона, что приводит как к стабилизации комплекса 70S«EFu GTP aaPHK, так и к активации ГТФ-азы EFu. На следующем этапе происходит гидролиз GTP [56, 58, 59] и освобождение неорганического фосфата [60]. Далее происходит конформационное изменение в EFu и его переход в GDP-связанную форму [31, 32], что существенно уменьшает его сродство к аа-тРНК [61]. Следствием этого является освобождение аминоацилированного конца тРНК из комплекса с EFu и его позиционирование в пептидилтрансферазном центре на 50S субчастице, что позволяет ему в дальнейшем принять участие в реакции транспептидации, в то время как EFu«GDP уходит из рибосомы [56]. Рисунок IA.6. Структурная перестройка декодирующего центра 30S субчастицы при узнавании правильной тРНК [67]. Скорость гидролиза GTP в свободном тройном комплексе EFu»GTP aaPHK или в EFu-GTP очень мала (10"5-104 с1) [62,63]. ГТФ-азная активность EFu увеличивается при связывании с рибосомой, причем степень ее увеличения зависит от степени соответствия кодона тРНК антикодону мРНК в А участке 30S субчастицы. Если кодон полностью некомплементарен антикодону, то увеличение незначительное (до 10"3-10"2 с"1) [57,64], в то время как при полном соответствии кодона антикодону скорость гидролиза GTP увеличивается до 500 с1 [56]. Интересно, что при некомплементарности только одного нуклеотида в кодон-антикодоновом дуплексе скорость гидролиза GTP меньше и составляет 50 с"1, что свидетельствует о том, что распознавание кодона в декодирующем центре и активация ГТФ-азы -взаимосвязанные события [56]. Распознавание кодона приводит к структурной перестройке 16S рРНК в декодирующем центре [65], что, в свою очередь, активирует ГТФ-азу EFu. Было показано, что в случае несовпадения только одного нуклеотида в кодоне с антикодоном при добавлении в систему паромомицина (аминогликозидный антибиотик), который увеличивает частоту прочитывания неправильных тРНК, скорость гидролиза GTP увеличивается до 500 с"1 [66]. Паромомицин стабилизирует хорошо охарактеризованное конформационное состояние декодирующего центра 16S рРНК [65], которое, скорее всего, отражает ситуацию, когда в декодирующем центре происходит узнавание правильной тРНК (рисунок IA.6) [67]. Можно предположить два пути передачи сигнала из декодирующего центра 30S субчастицы в ГТФ-азный центр 50S.
Во-первых, конформационное изменение 30S субчастицы может передаваться на 50S субчастицу через контакты между субчастицами [68], индуцировать структурное изменение в ГТФ-азном центре 50S субчастицы и тем самым активировать ГТФ-азную активность EFu. Это предположение согласуется с результатами анализа мутаций и футпринтинга на 23S рРНК [6, 69, 70] и 16S рРНК [71-73]. Другим, прямым способом передачи сигнала является передача сигнала непосредственно через молекулу тРНК, которая находится в контакте как с элементами декодирующего центра, так и с EFu. Такая модель постулирует конформационное изменение или перемещение тРНК, которое становится следствием кодон-антикодонового узнавания, и приводит к изменению контактов акцепторного конца аа-тРНК и EFu в тройном комплексе [74]. По данным кинетических и спектроскопических исследований кодон-антикодоновое узнавание сопровождается структурными перестройками как в тРНК [75], так и в G домене EFu [58], которые, по-видимому, приводят к образованию GTP-активированного состояния EFu и быстрому гидролизу GTP [56]. Изменение структуры тройного комплекса после кодон-антикодонового узнавания, когда активное состоянии EFu зафиксировано антибиотиком кирромицином, было показано с помощью криоэлектронной микроскопии [76-78]. По сравнению со структурой свободного тройного комплекса [35] антикодоновый домен тРНК смещается в сторону декодирующего центра, a G домен EFu остается фиксированным относительно структурных элементов 50S субчастицы [76], скорее всего, благодаря прочному связыванию с а-сарциновой петлей 23S рРНК [79]. Если предположить, что структура тРНК достаточно жесткая, то перемещение антикодонового домена должно приводить к перемещению всей молекулы тРНК и при помощи акцепторного домена активировать ГТФ-азу. Согласно этой модели не должна происходить активация ГТФ-азы EFu, если вместо тройного комплекса с целой молекулой тРНК с рибосомой будет связан комплекс EFu, содержащий только аминоацилированный акцепторный конец и Т петлю, а так же отдельно фрагмент тРНК, состоящий из антикодоновои и D петли, что в действительности и происходит [64]. Однако, скорее всего, в передаче сигнала между субчастицами задействованы одновременно оба пути. 1А.2.2. EF-G EF-G катализирует процесс транслокации на рибосоме, в ходе которого происходит синхронное перемещение деацилированной тРНК и пептидил-тРНК вместе с мРНК из возвращение рибосомы в исходное состояние диссоциация EF-G их претраслокационных положений в Р и А участках в их посттранслокационые положения в Е и Р участках, соответственно. Деацилированная тРНК затем самопроизвольно диссоциирует из Е участка. На основании экспериментов с негидролизуемыми аналогами GTP долгое время полагали, что EF-G функционирует как классический белок-"переключатель"; транслокация происходит при связывании EF-G с рибосомой, причем гидролиз GTP следует за перемещением молекул тРНК, что, в свою очередь, необходимо для освобождения EF-G из рибосомы [51].
Расположение EF-G на рибосоме
Взаимодействие EF-G с рибосомой изучалось различными методами -иммуноэлектронной микроскопией [143], криоэлектронной микроскопией [105, 106], химическим сшиванием [144], химическим футпринтингом [6, 145] и с помощью функциональных тестов [146]. Совокупность этих методов позволила определить несколько районов взаимодействия EF-G с рибосомой, которые преимущественно находятся на 50S субчастице: место расположения белка L7/L12 и два участка 23S рРНК - а-сарциновая петля (область нуклеотида 2660) и участок связывания тиострептона (область нуклеотида 1070) [147]. Информация о расположении EF-G на рибосоме была также получена с помощью пробинга посттранслокационного комплекса рибосомы свободными радикалами, полученными из EF-G, к различным аминокислотам на поверхности которого были прикреплены комплексы Fe2+-EDTA [148]. Посттранслокационный комплекс стабилизировали фусидовой кислотой, антибиотиком, который ингибирует освобождение EF-G GDP из рибосомы после реакции транслокации. Участки расщепления свободными радикалами были обнаружены как в 23S рРНК, так и в 16S рРНК. Как и предполагалось, связывание EF-G происходит в районе сс-сарциновой петли и участке связывания тиострептона. Другим местом связывания оказался район нуклеотида 1920 23S рРНК, который в общепринятой модели рибосомы располагается вблизи декодирующего центра малой субчастицы рибосомы. В 16S рРНК районы расщепления свободными радикалами входят в три области, вовлеченные во взаимодействие с тРНК - петли 790 и 1338 и район нуклеотида 1400, который находится вблизи Р участка декодирующего центра 30S субчастицы [149,150]. Места расщепления также были обнаружены вблизи района связывания белка S4. Рисунок IB.4. Расположение EF-G на рибосоме по данным пробинга посттранслокационного комплекса радикалами [148]. Структура представлена со стороны 30S субчастицы. На основании этих данных было сделано предположение о расположении EF-G на рибосоме (рисунок IB.4). Так, EF-G располагается вдоль поверхности 30S субчастицы, обращенной к 50S субчастице, от района белка S4 до основания "пальца" - структуры большой субчастицы (шпилька 38 23S рРНК), расположенной рядом с А участком. Глобулярная часть EF-G (домены I, II и V) находится между районом связывания белка S4 на малой субчастице и белка L11 на большой субчастице, при этом домен EF-G связывающий GTP, повернут в сторону 50S субчастицы. Домен IV направлен вверх, в сторону декодирующего центра 30S субчастицы.
Предложенная ориентация EF-G [148] очень схожа с положением комплекса EFu#aaPHK на рибосоме, определенным с помощью криоэлектронной микроскопии [76]. Позиция и ориентация EF-G на рибосоме в дальнейшем была подтверждена при исследовании с помощью криоэлектронной микроскопии комплекса рибосомы с EF-G без тРНК в присутствии фусидовои кислоты [105], а также претранслокационного комплекса, стабилизированного тиострептоном, свободного посттранслокационного комплекса и посттранслокационного комплекса, стабилизировнного фусидовои кислотой [106]. Домен V, как показанно с помощью криоэлектронной микроскопии, контактирует с основанием пальца, в то время как G домен находится во взаимодействии с 1_7Л.12-выступом, аналогично домену EFu [76]. Домен IV располагается в районе шеи 30S субчастицы в непосредственной близости от декодирующего центра, что еще раз подтверждает структурное подобие EF-G и комплекса EFunPHK. Таким образом, концепция молекулярной мимикрии подтверждается для посттранслокационного состояния, хотя расположение EF-G на рибосоме в данном случае не дает информации о роли элонгационного фактора в катализе процесса транслокации. Структурные данные, опубликованные в работах [148] и [105], были получены для случая, когда EF-G блокируется в посттранслокационном комплексе (поздняя стадия транслокации) с помощью фусидовои кислоты. Для изучения других состояний Винтермаером и сотрудниками были получены комплексы рибосомы с EF-G, стабилизированные другим антибиотиком - тиострептоном, до и после транслокации. На основании биохимических и кинетических исследований процесса транслокации показано, что тиострептон замедляет все стадии транслокации после гидролиза GTP и значительно снижает скорость транслокации [111]. Таким образом, можно получить претранслокационный комплекс рибосомы с EF-G. При более длительной инкубации транслокация все равно происходит, но освобождение EF-G GDP из рибосомы практически полностью блокировано. Следовательно, использование тиострептона позволяет получить как пре-, так и посттранслокационный комплекс рибосомы с EF-G. Структура обоих комплексов и контрольного комплекса без EF-G была определена с помощью криоэлектронной микроскопии с разрешением 20А (рисунок IB.5) [106]. В претранслокационном комплексе домены I, II и, возможно, домен V ориентированы в сторону 50S субчастицы, домен I образует прочный контакт с 1_7/1_12-выступом, в то время, как домен IV взаимодействует с 30S субчастицей в районе между шеей и головой малой субчастицы, где по данным нейтронографии [151] находится белок S4.
Структура посттранслокационного комплекса, полученного при блокировании транслокации тиострептоном [106], сходна со структурой, полученной в работах Вилсона и Ноллера [148] и Агравала с сотр. [105] в присутствии фусидовои кислоты. В структуре, стабилизированной тиострептоном, происходит смещение EF-G вглубь межсубчастичного пространства и ослабление контакта EF-G с L7/L12, тогда как в блокированном фусидовой кислотой комплексе EF-G также находится в межсубчастичном пространстве, но в основном на выходе из рибосомы, и кроме контакта EF-G с L7/L12 существует также взаимодействие домена V с основанием пальца [105, 106]. Это различие может быть связано с разным механизмом действия этих антибиотиков. Хотя оба антибиотика ингибируют освобождение EF-G из рибосомы, тиострептон связывается с 23S рРНК и, скорее всего, препятствует конформационной перестройке рибосомы, в то время как фусидовая кислота связывается с элонгационным фактором. Возможно, в процессе нормального протекания транслокации состояние, блокируемое фусидовой кислотой, следует за состоянием, которое блокируется тиострептоном. Но в обоих посттранслокационных комплексах, с фусидовой кислотой [105] и тиострептоном [106], домен IV EF-G находится в декодирующем центре или близко к нему, в участке, который занимает пептидил-тРНК до транслокации. На основании этих данных можно объяснить расщепление 16S рРНК в районе декодирующего центра свободными радикалами, генерируемыми на поверхности домена IV EF-G [148]. Это также подтверждает важность взаимодействия домена IV с малой субчастицей рибосомы в процессе транслокации. Такая разница в положении EF-G в пре- и посттранслокационном состоянии означает, что в процессе транслокации элонгационный1 фактор перемещается от L7/L12-BbiCTyna в пространство между субчастицами. IB.3. Структурные изменения EF-G и рибосомы в процессе транслокации До сих пор все попытки охарактеризовать структурные изменения, происходящие в рибосоме в процессе транслокации, ограничены сравнением пре- и посттранслокационного состояния рибосомного комплекса. Методы нейтронного рассеяния показывают некоторые различия в структуре [152], как это обнаружено при прямой визуализации с помощью криоэлектронной микроскопии пре- и посттраслокационного состояния рибосомного комплекса [76, 106]. Однако, различия в структуре пре- и посттранслокационного рибосомного комплекса менее существенны, чем можно было бы ожидать. Возможно, структура посттраслокационного состояния рибосомы не отражает те структурные изменения, которые претерпевает рибосома в процессе транслокации. Структуры 50S субчастицы рибосомы без лигандов [153, 154], с тРНК, связанной с АиРисРиЕ участками [155], в комплексе с EFu»GTP»PhePHKPhe, связанным с А состоянии [105, 106], не сильно различаются, кроме, пожалуй, удлинения пальца L7/L12 в посттранлокационном состоянии, стабилизированном фусидовой кислотой [106]. Для 30S субчастицы наблюдается подобие структуры с ранее полученными претранслокационными комплексами [155], и более существенное конформационное изменение при переходе из претранслокационного состояния в посттранслокационное
Формирование рибосомных комплексов с модифицированным EF-G
К модифицированному АРАВ или TDI EF-G добавляли GTP и антибиотик тиострептон, который ингибирует освобождение неорганического фосфата и транслокацию, или фусидовую кислоту, которая не влияет на гидролиз GTP и транслокацию, но предотвращает освобождение EF-G GDP из рибосомы [111]. Для получения функционального рибосомного комплекса с EF-G использовали претранслокационный комплекс рибосомы с мРНК, пептид ил-тРН К, и деацилированной тРНК. К этому комплексу добавляли модифицированный АРАВ или TDI EF-G. Комплексы, образованные в присутствии Cysless EF-G, обработанного фотоаффинным реагентом, а также комплексы, сформированные в отсутствие антибиотика, использовали в качестве контрольных. Полученные комплексы облучали мягким УФ-светом и проводили анализ сшивок. Детектируемый выход сшивки наблюдали в случае комплексов, образованных в присутствии тиострептона. НА.5. Анализ сшивок радиоактивно меченного EF-G Для анализа продуктов сшивания после облучения вводили радиоактивную метку в EF-G с помощью у-[32Р]-АТР и протеинкиназы А. Фосфорилирование Для определения пришивки к рибосомной РНК рибосомные белки и РНК после фосфорилирования EF-G разделяли в градиенте концентрации сахарозы в денатурирующих условиях. При этом 16S и 23S рРНК мигрировали одним пиком (рисунок НА.5). Видно, что происходит включение радиоактивной метки в рРНК. При этом в контрольном комплексе без EF-G или с EF-G, но без облучения УФ-светом, включение радиоактивной метки не наблюдали. Образование сшивки происходило в случае мутантных факторов, содержащих фотоактивируемую группировку, присоединенную к аминокислотам 506 и 591. Для анализа пришивки EF-G к рибосомным белкам отбирали аликвоты соответствующих белковых фракций из градиента и анализировали с помощью электрофореза по методу Лэмли с последующим радиоавтографированием геля. На радиоавтографе видно, что существует несколько радиоактивных продуктов более тяжелых, чем EF-G, которые, скоре всего, соответствуют образованию сшивки EF-G с рибосомными белками (рисунок ІІА.6). ІІА.6. Применение иммунологических методов для анализа продуктов фотохимического сшивания Для анализа продуктов фотохимического сшивания также применяли альтернативный подход, основанный на детекции с помощью иммунологических методов. Используя поликлональные антитела к фактору элонгации EF-G, все стадии реакции фотохимического сшивания можно было систематически контролировать. Кроме того, данный подход позволяет избежать стадии фосфорилирования.
После образования комплекса EF-G с рибосомой в присутствии антибиотика тиострептона и последующего облучения ультрафиолетовым светом модифицированные компоненты рибосом разделяли с помощью трех последовательных ультрацентрифугирований (смотри раздел ІІІВ.5), включающих выделения 70S комплекса, отделенного от избытка EF-G, разделение рибосом на субчастицы, разделение рРНК и белков. В результате такого анализа EF-G был обнаружен во фракциях 30S субчастиц, что свидетельствует о сшивке с компонентами малой субчастицы рибосомы, причем EF-G присутствует как во фракциях, содержащих как 16S рРНК (рисунок ІІА.7А), так и белки малой субчастицы. Выход сшивки был больше для EF-G с модифицированными аминокислотными остатками 506 и 591 и меньше - в случае остатков 541 и 585. Для контроля за специфичностью пришивок, половину комплекса с тиострептоном не подвергали облучению, а сразу после формирования наносили на соответствующие сахарозные градиенты. Присутствие EF-G во фракциях, содержащих 16S рРНК, выделенную из облученных и необлученных комплексов, детектировали с помощью атител (рисунок ІІА.7Б). Видно, что без облучения модификация 16S рРНК не происходит. Также не приводит к модификации 16S рРНК облучение комплекса, содержащего немодифицированный EF-G. Таким образом, происходит специфическая фотохимическая модификация рРНК при облучении рибосомных комплексов с EF-G, несущими фотоаффинную группу в положениях 506, 541, 585 и 591 EF-G. Пришивки EF-G к белковым компонентам рибосомы анализировали с помощью 6% SDS-ПААГ. Видно, что даже без активации фотоаффинной группы происходит образование димеров модифицированного EF-G (рисунок IIA.8A и ІІА.8Б). Анализ фракций градиента концентрации сахарозы после разделения рибосомного комплекса на субчастицы выявил модификацию некоторых рибосомных белков, в особенности, одного из белков малой рибосомной субчастицы (рисунок IIA.8B).
Следует отметить, что во всех случаях выход реакции фотоаффинного химического сшивания был недостаточным для полной идентификации продуктов сшивки. Это может быть связано с лабильностью комплекса, который EF-G образует с малой субчастицей рибосомы. Можно предположить, что такое взаимодействие происходит как серия транзитных контактов, причем на разных этапах в нем могут принимать участие как различные рибосомные белки, так и различные участки 16S рРНК. Это приводит к тому, что, хотя в целом выход реакции сшивания с 30S субчастицей достаточно высок, идентифицировать конкретных участников сшивки на малой субчастице не удается, поскольку на разных этапах сшивка образуется с разными ее компонентами. Наши данные свидетельствуют о наличие контакта домена IV фактора EF-G с малой субчастицей рибосомы в процессе транслокации. Видимо, EF-G вызывает конформационные изменения в малой субчастице рибосом, что облегчает процесс транслокации. IIA.7. Заключение В результате данной работы был разработан новый вариант метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции, основанный на присоединении фотометки к определенным аминокислотам на поверхности белковой глобулы. В работе также были предложены два варианта анализа сшивок, основанные как на введении радиоактивной метки в белок, так и на применении иммунологических подходов. Оба метода обладают высокой чувствительностью. Иммунологический метод анализа продуктов фотохимического сшивания является более универсальным и может быть применен в работах по фотохимическому сшиванию в тех случаях, когда введение радиоактивной метки в молекулу белка по тем или иным причинам невозможно. Использованный подход позволил зафиксировать сшивки EF-G с 30S субчастицей рибосом в процессе транслокации, что подтверждает непосредственное взаимодействие домена IV EF-G с рРНК и белками 30S субчастицы. ИВ. Мутации в спирали 34 16S рРНК IIB.1. Выбор мест введения мутаций в 16S рРНК Итак, нами было показано, что EF-G взаимодействует с компонентами малой субчастицы, причем, как с белками, так и с 16S рРНК. Известно, что один из элементов 16S рРНК - спираль 34 (рисунок IIB.1), играет важную роль в процессе транслокации. Со спиралью 34 связывается антибиотик спектиномицин, который ингибирует транслокацию [159-161]. Защита от химической модификации оснований 1054 и 1201 в спирали 34 происходит только в рибосомных комплексах с активным EF-G, т.е. совпадает с прохождением транслокация. В комплексах рибосомы с неактивным EF-G (например мутантными по аминокислотному остатку 583 в домене IV EF-G) защиты этих оснований от модификации не наблюдается [145].
Связывание с А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном
Проверку эффективности связывания с рибосомой аа-тРНК, третий нуклеотид антикодона которой некомплементарен соответствующему первому нуклеотиду кодона мРНК, проводили в модельной системе. Некомплементарность третьего нуклеотида антикодона тРНК первому нуклеотиду кодона мРНК в этой системе моделировали путем использования одной тРНКРИе (GAA антикодон) и двух различных мРНК. У одной из них, MFTI, кодон полностью комплементарен антикодону тРНКР1е, а у другой - 90А -частично некомплементарен (рисунок 1IB.14). Это говорит о том, что данные мутации влияют на точность трансляции на стадии связывания тройного комплекса EFu с аа-тРНК с А участком рибосомы и узнавание правильной аа-тРНК. Все эксперименты проводили при концентрации ионов магния, когда нивелируются различия в начальном отборе различных аа-тРНК, поэтому полученные данные говорят о том, что в двух мутантах C1109A/U961A и A1191G затронута стадия аккомодации аа-тРНК в рибосоме. Ранее с помощью подходов стационарной кинетики было показано, что эти мутации не оказывают влияния на функционирование пептидилтрансферазного центра 50S субчастицы. Поскольку эти эксперименты проводили в условиях, когда нивелируются различия в начальном отборе различных аа-тРНК, полученные данные говорят о том, что в двух мутантах C1109A/U961A и A1191G затронута именно стадия аккомодации аа-тРНК в рибосоме. V Однако какой именно эффект вызывают мутации - локальное изменение структуры декодирующего центра 30S субчастицы или глобальное изменение структуры 30S субчастицы и нарушение передачи сигнала от 30S субчастицы к 50S субчастице - на основании этих данных сказать сложно. Для ответа на этот вопрос необходимо более детально исследовать различные стадии кинетической схемы (рисунок IIB.15) связывания аа-тРНК с А участком рибосомы. Это можно сделать с помощью методов престационарной кинетики (смотри раздел IIB.13). IIB.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) На следующем этапа было проверено влияние мутаций на процесс транслокации. Известно, что при связывании с претранслокационным комплексом и в процессе транслокации EF-G контактирует как с 30S, так и с 50S субчастицей рибосомы, поэтому логично предположить, что изменение локальной структуры декодирующего центра или нарушение передачи сигнала между субчастицами, вызванное мутациями в спирали 34, может повлиять на связывание EF-G с рибосомой и катализ им перемещения мРНК-тРНК.
Для исследования процесса транслокации применяли два подхода - метод стационарной и престационарной кинетики. \ В соответствии с кинетической схемой функционирования EF-G в процессе возвращение рибосомы в исходное состояние диссоциация EF-G \ . Рисунок IIB.17. Кинетическая схема функционирования EF-G в процессе транслокации [60]. транслокации (рисунок IIB.17) [60], стадией, лимитирующей скорость всего процесса транслокации, является переход рибосомы из состояния, в котором возможна транслокация (открытого состояния), в исходное состояние (рисунок IIB.17, стадия 7). C1109A/U961A и A1191G затронута именно стадия аккомодации аа-тРНК в рибосоме. Однако какой именно эффект вызывают мутации - локальное изменение структуры декодирующего центра 30S субчастицы или глобальное изменение структуры 30S субчастицы и нарушение передачи сигнала от 30S субчастицы к 50S субчастице - на основании этих данных сказать сложно. Для ответа на этот вопрос необходимо более детально исследовать различные стадии кинетической схемы (рисунок ИВ.15) связывания аа-тРНК с А участком рибосомы. Это можно сделать с помощью методов престационарной кинетики (смотри раздел ИВ.13). ІІВ.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) На следующем этапа было проверено влияние мутаций на процесс транслокации. Известно, что при связывании с претранслокационным комплексом и в процессе транслокации EF-G контактирует как с 30S, так и с 50S субчастицей рибосомы, поэтому логично предположить, что изменение локальной структуры декодирующего центра или нарушение передачи сигнала между субчастицами, вызванное мутациями в спирали 34, может повлиять на связывание EF-G с рибосомой и катализ им перемещения мРНК-тРНК. Для исследования процесса транслокации применяли два подхода - метод стационарной и престационарной кинетики. возвращение рибосомы в исходное состояние диссоциация EF-G Рисунок ИВ.17. Кинетическая схема функционирования EF-G в процессе транслокации [60]. В соответствии с кинетической схемой функционирования EF-G в процессе транслокации (рисунок ИВ.17) [60], стадией, лимитирующей скорость всего процесса транслокации, является переход рибосомы из состояния, в котором возможна транслокация (открытого состояния), в исходное состояние (рисунок ИВ. 17, стадия 7). Протекание транслокации можно рассматривать с точки зрения классической схемы Михаэлиса-Ментен где в качестве субстрата (S) выступает претранслокационный комплекс, а в качестве фермента - EF-G GTP; переходное состояние (ES) - фермент-субстратный комплекс EF-G с рибосомой и тРНК-мРНК (комплекс Михаэлиса); продукт реакции (Р) -посттранслокационный комплекс.
Такой выбор субстрата и фермента не случаен. Так как формально ферментом является компонент, состояние которого не изменяется после протекания реакции, то ферментом не может быть претранслокационный комплекс, поскольку он претерпевает необратимое изменение - перемещение мРНК и тРНК. С другой стороны, при протекании транслокации происходит гидролиз GTP на EF-G и образование EF-G-GDP, однако замена GDP на GTP протекает на EF-G самопроизвольно и с достаточно большой скоростью [109]. Поэтому можно считать, что фермент (EF-G) в ходе транслокации не изменяется. О стационарной кинетике можно говорить, когда концентрация фермент-субстратного комплекса ES постоянна, то есть образование фермент-субстратного комплекса протекает быстро и скорость лимитирующей является kcat (Км » kcat). При этом концентрация субстрата значительно больше концентрации фермента и можно записать, что весь процесс (одновременно на kcat и Км, рисунок IIB.17, стадия 1, 2 и 3 кинетической схемы), т.е. в этом случае метод обладает максимальной чувствительностью к изменениям в субстрате, Поэтому измерения проводили именно при такой концентрации претранслокационного комплекса. В этом случае ферментативную реакцию можно охарактеризовать, так называемой, константой специфичности, наблюдаемой константой скорости второго порядка k . Видно (рисунок IIB.21), что введенные в спираль 34 16S рРНК мутации не влияют на скоростьлимитирующую стадию транслокации, т.е. структурная перестройка рибосомы после перемещения мРНК-тРНК (передача сигнала между субчастицами на этом этапе) не затронута мутациями. Перемещению тРНК-мРНК предшествует структурная перестройка рибосомы, связанная с переходом в открытое состояние. Для того, чтобы определить, влияют ли мутации на это структурное изменение 30S и, следовательно, на перемещение мРНК-тРНК, необходимо исследовать процесс транслокации с помощью подходов престационарной кинетики. IIB.12. Метод престационарной кинетики (остановленного потока) и оборудование для него Кинетические измерения стационарной кинетики обычно позволяют получить только информацию о значении константы Км, которая может быть или не быть константой диссоциации комплекса фермент-субстрат, а так же о значении кш, которое может быть как элементарной каталитической константой определенной стадии, так и комбинацией элементарных каталитических констант нескольких стадий. Для измерения элементарных констант определенной стадии необходимо проводить кинетические измерения до того момента, когда система достигнет стационарного состояния. Поскольку обычно значения кш находятся в интервале 1-Ю7 с"1, измерения кинетики следует проводить во временных интервалах 10 -1000 мс. Для этого нужна установка, которая позволяла бы быстро смешивать компоненты и затем измерять концентрацию фермента и субстрата. Кроме того, концентрация фермента должна быть соизмерима с концентраций субстрата. Для измерения быстрой престационарной кинетики был разработан ряд методов, одним из которых является метод остановленного потока.
