Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосома является сложной молекулярной машиной рибонуклеопротеидной природы. В ходе трансляции она осуществляет биосинтез белка, перекодируя информацию нуклеотидной последовательности мРНК в первичную структуру полипептидных цепей. В качестве субстратов этой реакции используются аа-тРНК, и на разных этапах цикла трансляции с рибосомой взаимодействуют различные белки-факторы трансляции, расходуется энергия GTP, происходят постоянные изменения конформации рибосомных субчастиц. Ключевую роль в этих процессах играет рРНК. Роль отдельных ее элементов в процессе связывания тРНК, перемещения ее в рибосоме и в диссоциации комплекса тРНК с рибосомой и мРНК интенсивно изучается. Рибосома имеет три участка связывания тРНК: А, Р и Е, каждый из которых образован малой и большой субчастицами. Известны конкретные нуклеотидные остатки, важные для формирования сайтов связывания тРНК и ее транслокации, но данных об их структурно-функциональной роли накоплено немного. В данной работе была изучена роль двух нуклеотидных остатков этой группы - С2394 и G2061 23 S рРНК, входящих в состав пептидилтрансферазного центра, в цикле трансляции. Цель работы.
Изучить свойства Е-сайта рибосомы с помощью сайт-направленного мутагенеза 23SpPHK;
Выяснить, каким образом эффективность связывания тРНК с Е-сайтом влияет на точность трансляции, на взаимодействие рибосомы с EF-G и на прохождение транслокации;
Определить, каким образом мутация C2394G влияет на формирование Р/Е-гибридного сайта связывания тРНК рибосомами;
Выяснить роль нуклеотида G2061 в процессе транслокации и в работе пептидилтрансферазного центра.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были получены варианты рибосом, несущих мутации в 23 S рРНК: C2394G и G2061C. Первая мутация привела к сильному снижению жизнеспособности клеток, вторая оказалась летальной. Фенотипы данных мутаций исследованы in vivo и детально охарактеризованы in vitro. Изучение функционирования рибосом, несущих мутацию C2394G, позволило понять роль связывания тРНК с Е-сайтом рибосомы в трансляции и, в частности, в функционировании фактора элонгации G. Тем самым были разрешены многие противоречия, более десяти лет существовавшие в научной литературе. Показана
важность формирования Р/Е-гибридного сайта связывания тРНК для стимуляции ОТРазной активности EF-G. В ходе экспериментов in vivo с применением репортерных конструкций с генами Р-галактозидазы выяснилось, что мутация C2394G вызывает повышение частоты ошибочного прочтения стоп-кодонов и вызывает сдвиг рамки считывания. Таким образом, впервые экспериментально показано, что Е-сайт участвует в поддержании рамки считывания в процессе трансляции в живой клетке.
Планируя введение мутации G2061C в 23 S рРНК, мы исходили из структуры комплекса 50S субчастицы с аналогами пептид ил-тРНК, и предполагали, что роль этого высококонсервативного нуклеотида состоит во взаимодействии с пептидной группой пептидил-тРНК. Это взаимодействие, возможно, обеспечивает более высокое, чем для аминоацил-тРНК, сродство пептидил-тРНК к Р-сайту, что, в свою очередь, важно для обеспечения направленности транслокации. В ходе экспериментов на очищенных препаратах рибосом роль G2061 в обеспечении селективности Р-сайта к пептидил-тРНК не была обнаружена, поэтому мы прибегли к постадийному анализу эффективности функционирования рибосом, несущих мутацию G2061C. Выяснилось, что замена G2061C приводит к угнетению пуромициновой реакции мутантных рибосом, изменяет аффинность рибосом к Phe-тРНК е и нарушает взаиморасположение нескольких нуклеотидных остатков, расположенных в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Также в ходе работы впервые показано, что нуклеотидный остаток G2061 необходим для взаимодействия рибосомы с белком RMF в условиях стресса.
Для выяснения роли G2061 была создана тестовая система пошаговой трансляции с контролем всех этапов, включая стадию терминации. Для ее проверки использовали антибиотики, влияющие на различные этапы работы рибосомы. Выяснилось, что, используя эту систему, можно тестировать механизм действия неизученных ингибиторов биосинтеза белка, в одном тесте определяя стадию цикла трансляции, ингибируемую антибиотиком. С учетом того, что среди известных антибиотиков большая доля действует именно на рибосому, создание тестовой системы ингибиторов трансляции может иметь важное практическое значение для поиска и проверки новых антибиотиков.
Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова, на семинарах лаборатории Ниерхауса AG Ribosomen Института молекулярной генетики Макса Планка, Берлин, Германия; докладывали на конференциях: HHMI Meeting of International Research Scholars. Ashburn,
VA, США. Сентябрь 26-29, 2006; 21st tRNA WORKSHOP, Бангалор, Индия. Декабрь 2-7, 2005; RNA 2006. The eleventh annual meeting of the RNA society. Университет Вашингтона, Сиэтл, Вашингтон, июнь 20-25, 2006.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован 27 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 130 цитированных работ.
