Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1. Строение и функция SRP и SR из клеток животных 11
1.1. Структура 7SL РНК 12
1.2. Структура Alu-домена SRP 13
1.3. Структура S-домена SRP 16
1.4. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP 22
1.5. Биогенез SRP 24
1.6. Структура SR 25
1.7. Структура комплекса рибосома/сигнальный nenmud/SRP/SR 30
1.8. Функция SRP и SR: ранние исследования 32
1.9. Функция SRP и SR: сигнальные последовательности 34
1.10. Функция SRP и SR: распределение функций между доменами SRP 36
1.11. Функция SRP и SR: арест трансляции 38
1.12. Функция SRP и SR: длина растущего пептида 39
1.13. Функция SRP и SR: SRP - шаперон 41
1.14. Функция SRP и SR: SRP54 и сигнальный пептид 41
1.15. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP 41
1.16. Функция SRP и SR: взаимодействие рибосомы uSRcc 44
1.17. Функция SRP и SR: роль SR/3 45
1.18. Функция SRP и SR: дополнительная функция гетеродимера SRP9/SRP14 47
1.19. Функция SRP и SR: SRP в посттрансляционном транспорте белков 47
2. Строение и функция SRP и SR-ИЗ клеток S. cerevisiae 48
2.1. Структура scRl РНК 49
2.2. Структура Alu-домена SRP 50
2.3. Структура S-домена SRP 51
2.4. Биогенез SRP 51
2.5. Структура SR 53
2.6. Функция SRP и SR: общие полоэюения 54
2.7. Функция SRP и SR: нарушение генов компонентов SRP 56
3. Строение и функция SRP и SR-ИЗ клеток Е. coli 59
3.1. Структура Fjh 59
3.2. Структура 4.5SРНК 63
3.3. Структура комплекса 4.5S PHK/FfhM. 65
3.4. Структура FtsY 66
3.5. Структура комплекса FjhNG/FtsYNG 67
3.6. Функция SRP и SR: ранние исследования 69
3.7. Функция SRP и SR: взаимодействие Fjh с 4.5S РНК 71
3.8. Функция SRP и SR: общая схема работы SRP бактерий 72
3.9. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP 74
3.10. Функция SRP и SR: роль SecA 76
3.11. Дополнительная функция 4.5S РНК 77
4. Заключение 78
2 Результаты и обсуждение 79
1. Взаимодействие SRP с рибосомой Е. coli 79
1.1. Влияние остатков 4-muo-U в составе 4.5S РНК* на образование комплекса FJh-6His/4.5S РНК 79
1.2. Образование комплексаpu6ocoMa/Ffh-6His/muo-4.5S РНК*, фотохимическое сшивание 81
1.3. Изучение взаимодействия 4.5S РНК* с рибосомными белками 83
1.4. Изучение взаимодействия 4.5SPHK* с 23Su 16S Ррнк 84
1.5. Определение остатков 4-muo-U в 4.5S РНК*, участвующих в образовании сшивок 87
1.6. Модель взаимодействия 4.5S РНК с рибосомой 90
2. Влияние нарушения синтеза SRa на биосинтез компонентов SRP-пути и на взаимодействие SRP с рибосомой в клетках S. cerevisiae 95
2.1. Создание штамма дрожжей с регулируемой экспрессией SRa 95
2.2. Зависимость количества компонентов SRP-пути от количества SRa в клетке 97
2.3. Влияние нарушения синтеза SRa на взаимодействие SRP с рибосомой 103
3. Влияние нарушения синтеза FtsY на биосинтез белкового компонента SRP в клетках . coli 107
3.1. Создание бактериального штамма с регулируемой экспрессией белка FtsY 107
3.2. Зависимость количества Ffh от количества FtsY в клетке 108
3 Материалы и методы 111
1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы 111
2. Клонирование 117
2.1. Выделение плазмидной ДНК 117
2.2. Определение концентрации ДНК в растворе 117
2.3. ПЦР 117
2.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 118
2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 118
2.6. Приготовление векторов и вставок 118
2.7. Цитирование 119
2.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli 119
2.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli 119
2.10. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру 120
3. Получение 4.5SРНК*, определение соотношения muo-U:Ue 4.5SPHK* 121
3.1. Создание конструкции pSL-ffs 121
3.2. Получение 4.5S РНК* с помощью Т7-транскрипции 121
3.3. Определение соотношения 4-THO-U:U в полученной 4.5S РНК 122
4. Выделение белка Fjh-6His 123
4.1. Создание конструкции pET-Ffh-6His 123
4.2. Выделение белка Ffh-6His HaNi-NTA агарозе 123
4.3. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 124
5. Образование комплекса 4.5S PHK*/Fjh-6His 125
6. Получение мРНК р-лактамазы 125
7. Трансляция мРНК Р-лактамазы in vitro, выделение транслирующих рибосом 126
7.1. Трансляция мРНК р-лактамазы in vitro 126
7.2. Трансляция мРНК р-лактамазы in vitro 126
7.3. Выделение транслирующих рибосом 126
8. Фотохимическое сшивание комплекса 4.5S PHK*/Ffh-6His с рибосомами 126
9. Анализ продуктов фотохимического сшивания 127
9.1. Пошаговое центрифугирование 127
9.2. Гидролиз 4.5S РНК*, 16S и 23S рРНК с помощью рибонуклеазы Н 128
9.3. Гидролиз 4.5S РНК* и фотоадцукта 4.5S РНК* с 23S рРНК с помощью рибонуклеазы ТІ 128
9.4. Анализ фотоадцуктов 4.5S РНК* с рибосомными белками с помощью антител 129
10. Создание дрожжевых штаммов ONA11 и ONA 72 129
10.1. Получение ПЦР-фрагмента I 129
10.2. Трансформация клеток S. cerevisiae 129
10.3. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 130
10.4. ПЦР с геномной ДНК S. cerevisiae 131
10.5. Иммунодетекция белка Srp72p-4,5Z в клетках S. cerevisiae 131
10.6. Вестерн-блоттинг белков 131
11. Детекция scRl РНК и мРНК белков Srpl4p, Srp21p, Sec65p, а- и (3-субъединиц SR, карбоксипептидазы Y 132
11.1. Наращивание клеток S. cerevisiae 132
11.2. Выделение суммарной РНК из клеток S. cerevisiae методом горячей фенольной депротеинизации 133
11.3. Приготовление зондов для нозерн-блот-анализа 133
11.4. Нозерн-блот-анализ scRl РНК и мРНК белков SrpHp, Srp21p, Sec65p, а- и р-субъединиц SR, карбоксипептидазы Y 134
12. Анализ количества белка Srp72р-4,5Z в клеточных фракциях S. cerevisiae 135
13. Создание штамма XDPBADFISY 136
13.1. Создание конструкции pET23-Py-kanR-PBAoFtsY' 136
13.2. Получение ПЦР-фрагмента II 137
13.3. Трансформация клеток Х90 (DE3), содержащих плазмиду pKD46, ПЦР-фрагментом II 138
14. Вестерн-блот-анализ белков FtsY и Fjh 139
Выводы 140
- Структура Alu-домена SRP
- Функция SRP и SR: длина растущего пептида
- Структура Alu-домена SRP
- Функция SRP и SR: общая схема работы SRP бактерий
Структура Alu-домена SRP
В работах П. Уолтера было показано, что белки SRP9 и SRP14 по отдельности не проявляют РНК-связывающей активности. Эти белки в отсутствии 7SL РНК образуют очень прочный гетеродимер, который способен затем связываться с РНК [25, 26]. Связывание гетеродимера происходит с Alu-участком 7SL РНК, точнее с нуклеотидными остатками 1—47 (так называемый S Alu-домен) и с остатками 48-64 и 283-301 (так называемый 3 Alu-домен) [27, 28]. Связывание осуществляется стехиометрически, с высокой аффинностью, независимо от других белков [15, 21, 29]. С помощью сайт-направленного мутагенеза было показано, что в обоих белках содержатся домены, важные для образования комплекса с РНК [30]. Точечные мутации высококонсервативных нуклеотидных остатков в Alu-домене 7SL РНК нарушают образование комплекса гетеродимера SRP9/SRP14 с РНК [31]. Был также сконструирован химерный белок, содержащий в одной полипептидной цепи последовательности белков SRP9 и SRP14 в порядке SRP9-SRP14 или SRP14-SRP9, разделенные линкером в 17 аминокислотных остатков. Такой химерный белок способен структурно и функционально заменять гетеродимер SRP9/SRP14 [29]. Кристаллическая структура химерного белка мыши, содержащего белки SRP9 и SRP14 в порядке SRP14-SRP9, была получена с разрешением 2,5 А и была первой кристаллической структурой белков, входящих в Alu-домен SRP (рис. 4). Как оказалось, белки SRP9 и SRP14 структурно похожи друг на друга, оба содержат одинаковый структурный мотив а-{3-Р-Р- х. В составе гетеродимера они образуют общий антипараллельный шести-тяжевой Р-лист, на выпуклой стороне которого находятся четыре а-спирали, а на вогнутой стороне расположены положительно заряженные аминокислотные остатки. Данная структура помогла смоделировать структуру гетеродимера со спиралью РНК [32]. В 2000 году были получены две кристаллические структуры комплекса SRP9/SRP14 из клеток человека с Аш-подобными участками РНК [33]. Первая структура, полученная с разрешением 3,2 А, соответствовала комплексу SRP9/SRP14 с молекулой РНК длиной 50 нуклеотидных остатков (SA50), содержащей 5 -домен Alu-участка (рис. 5, Б, В). РНК оказалась свернута в структуру псевдоузла, а гетеродимер SRP9/SRP14 взаимодействует с U- поворотом, находящимся между спиралями. Вторая структура, полученная с разрешением 4,0 А, представляла комплекс SRP9/SRP14 с молекулой РНК длиной 88 нуклеотидных остатков, содержащей 3 - и 5 -домены Alu-участка (SA88) и представляющей собой минимальный Alu-домен 7SL РНК [34].
В данном случае (рис. 5, А, Г) также наблюдали взаимодействие гетеродимера с U-поворотом в 5 -домене, и дополнительный слабый контакт с 3 -концевым доменом находящейся рядом второй молекулы РНК (комплекс SRP9/SRP14 с SA88 РНК кристаллизуется в виде димера). Полученные данные позволили авторам смоделировать взаимодействие гетеродимера SRP9/SRP14 с Alu-доменом 7SL РНК (рис. 5, Д, Е), причем предложенная структура хорошо согласовывалась с биохимическими данными по взаимодействию комплекса SRP9/SRP14 с 7SL РНК, полученными ранее [33]. В 2001 году, основываясь на полученных кристаллических структурах, биохимических и биофизических данных, была предложена схема, каким образом протекает сборка Alu-домена. Согласно этой схеме, после димеразации комплекс SRP9/SRP14 вначале взаимодействует с U-поворотом в 5 -домене, затем происходит связывание с 3 -доменом Alu-участка, что приводит к образованию плотной структуры Alu-домена SRP [28, 35]. 1.3. Структура S-домена SRP Как упоминалось ранее, S-домен SRP образуют h6, h7, h8 и часть h5 спирали 7SL РНК, а также белки SRP19, SRP54 и гетеродимер SRP68/SRP72. SRP68/SRP72. При обработке SRP раствором с высокой ионной силой комплекс SRP68/SRP72 ведет себя как стабильный гетеродимер [15]. Этот гетеродимер способен защищать от нуклеазного разрезания довольно протяженный участок в центральной части 7SL РНК, а именно основания спиралей h6 и h8, спираль h7 и участок спирали h5 [36]. В работе [37] было показано, что белок SRP68 содержит в N-концевом участке РНК-связывающий домен и способен самостоятельно взаимодействовать с 7SL РНК. С-концевой участок SRP68 взаимодействует с белком SRP72. Белок SRP72 не проявляет РНК-связывающей активности и способен взаимодействовать с 7SL РНК только при наличии SRP68. В то же время белки SRP68 и SRP72 не способны образовывать гетеродимер в отсутствии 7SL РНК. Скорее всего, сборка комплекса SRP68/SRP72/7SL РНК протекает следующим образом. Белок SRP68 связывается с молекулой 7SL РНК, и затем происходит присоединение SRP72 [21, 37]. Но совсем недавно эти предположения были частично опровергнуты. Было показано, что белки SRP68 и SRP72 могут образовывать гетеродимер без 7SL РНК. За взаимодействие с SRP68 отвечает N-концевой домен SRP72 [38]. Была также продемонстрирована способность белка SRP72 связываться с 7SL РНК. В составе С-концевого участка SRP72 был найден РНК-связывающий домен, и была детектирована область в h5 спирали 7SL РНК, с которой взаимодействует SRP72 [39]. Ассоциация белков SRP68 и SRP72 с молекулой 7SL РНК протекает независимо от SRP19, SRP54 и SRP9/SRP14 [15,36]. SRP19.
В экспериментах по диссоциации SRP на отдельные компоненты с последующей сборкой полноценной SRP из отдельных компонентов было показано, что белок SRP19 независимо от других белков связывается с 7SL РНК [15]. Позднее было показано, что SRP19 взаимодействует со спиралями h6 и h8 [36, 40], причем эти взаимодействия были подтверждены с помощью мутаций в петле на конце h6 спирали [41]. Также было показано, что участок 7SL РНК, содержащий h6, h7, h8 и часть h5 спирали, необходим для связывания с SRP19, при этом основной участок связывания SRP19 с молекулой 7SL РНК находится в спирали h6 [42]. Систематический сайт-направленный мутагенез белка SRP19 показал, что примерно половина аминокислотных остатков являются важными для связывания РНК. Позднее было показано, что РНК-связывающие участки SRP19 локализованы преимущественно в N-концевой части [43, 44]. В 2001 году была опубликована кристаллическая структура с разрешением 1,8 А белка SRP19 человека в комплексе с участком спирали h6, содержащем 29 нуклеотидных остатков (рис. 6А). Как оказалось, белок SRP19 имеет вторичную структуру р-а-Р-{3-а, которая в пространстве сворачивается в трех- тяжевой антипараллельный Р-лист, на одном из конце которого находятся две ос-спирали. SRP19 взаимодействует непосредственно с петлей на конце h6 спирали [28, 45]. В 2002 году были получены кристаллические структуры комплексов, состоящих из белка SRP19, выделенного из архебактерий Methanococcus jannaschii, и S-домена молекулы 7SL РНК человека длиной 128 нуклеотидных остатков (разрешение 2,9 А) или S-домена молекулы 7SL РНК М. jannaschii длиной 97 нуклеотидных остатков (разрешение 2,3 А) [46, 47, 48]. Обе структуры очень похожи. В обоих случаях SRP19 взаимодействует с большой бороздкой в петле, находящейся на конце спирали h6, и с малой бороздкой в петле, которая находится на конце спирали h8. SRP54. Структура белка SRP54 довольно хорошо изучена. В составе белка можно выделить три домена: N-концевой домен, G-домен и находящийся на С-конце М-домен, получивший свое название из-за большого количества остатков метионина. Частичный протеолиз расщепляет белок на два относительно стабильных домена: NG и М [49]. Структура белка SRP54 с разрешением около 15 А, полученная с помощью электронной микроскопии, представляла собой два домена, соединенных между собой небольшим линкером [50]. G-домен содержит структурный мотив, который имеет сходства с СТРазными доменами других белков [51, 52]. В М-домене находятся РНК-связывагощий участок (SRP54M взаимодействует со спиралью h8 SRP РНК) и гидрофобный участок, ответственный за связывание с сигнальным пептидом [49, 51, 52, 53, 54, 55, 56]. В 1999 году была опубликована кристаллическая структура SRP54M человека с разрешением 2,1 А [57]. SRP54M состоит из семи а-спиралей al-a7 (рис. 7). Спираль al несколько выпетлена, остальные спирали образуют компактную структуру, которая стабилизирована взаимодействием нескольких гидрофобных остатков, а также сетью водородных связей и солевыми мостиками. В структуре SRP54M можно выделить
Функция SRP и SR: длина растущего пептида
Зависит ли эффективность взаимодействия SRP с сигнальной последовательностью от того, как далеко она ушла от рибосомы, от длины растущего пептида? По-видимому, да. Эффективность взаимодействия SRP с работающей рибосомой изучали в зависимости от времени синтеза секретируемого белка. В течение некоторого времени проводили инициацию трансляции in vitro, затем ингибировали дальнейшие акты инициации трансляции и проводили элонгацию, получая, таким образом, синхронизированные транслирующие рибосомы. Через определенные промежутки времени добавляли SRP и микросомальные мембраны и измеряли количество белка, прошедшего через липидный бислой. При трансляции легкой цепи IgG (ее длина составляет 230 аминокислотных остатков), если рибосома синтезировала 28% длины белка, то добавление SRP приводит к 100% аресту трансляции и 100% транслокации; если рибосома синтезировала 50% длины белка, то добавление SRP также приводит к 100% аресту трансляции и 100% транслокации; если рибосома синтезировала 75% длины белка, то добавление SRP приводит к 50% аресту трансляции и 50% транслокации; если рибосома синтезировала 95% длины белка, то добавление SRP не приводит ни к аресту трансляции, ни к транслокации [107]. Если проводить трансляцию in vitro мРНК разной (возрастающей) длины без стоп-кодона, то все рибосомы будут останавливаться, синтезировав пептид определенной длины. Добавление к таким рибосомным комплексам SRP и микросомальных мембран, приводит к схожим результатам [108]. Эффективность взаимодействия SRP с растущим пептидом также изучали с помощью сшивания. Оказалось, что SRP пришивается к растущему препролактину в некотором диапазоне его длины. Наибольший выход сшивки наблюдался на ранней стадии трансляции, а с увеличением длины растущего пептида выход сшивки падает [109]. Исследования, проведенные в 2003 году, несколько уточняют данное утверждение. Встраивание в сигнальный пептид флуоресцентной метки дало возможность оценить довольно высокую аффинность SRP к пептиду. Удлинение растущего пептида не влияло на сродство SRP к сигнальному пептиду. Возможно, что при удлинении растущего пептида SRP остается в комплексе с сигнальной последовательностью, а растущий пептид при увеличении его длины начинает мешать ассоциации SRP с SR [ПО]. Известно, что некоторые цитозольные факторы с активностью шаперона, а именно белок TF (trigger factor, TF), способны поддерживать секреторные и мембранные белки в компетентном для транслокации состоянии. Очищенный белок proOmpA после инкубации при 0С в течение 15 часов полностью терял способность к транслокации.
Если белок proOmpA инкубировали в тех же условиях в присутствии TF, то он сохранял способность транслоцироваться. Т.е. TF может поддерживать белки в компетентном для транспорта состоянии. Поведение SRP в такой ситуации было аналогично поведению TF. Иными словами, помимо узнавания сигнального пептида и направления его к месту транспорта, SRP имеет дополнительную функцию поддержания сигнального пептида в состоянии, компетентном для транслокации [111]. 1.14. Функция SRP и SR: SRP54 и сигнальный пептид S-домен SRP, а точнее входящий в его состав М-домен белка SRP54, связывается с сигнальным пептидом [49, 53, 55, 112]. Мутантная SRP, содержащая М-домен белка SRP54 вместо SRP54, сшивается с сигнальным пептидом чуть хуже, чем нормальная SRP [51]. При этом сигнальный пептид взаимодействует только с SRP54, делает это независимо от других компонентов SRP, поскольку свободный SRP54 тоже может связывать сигнальный пептид [112]. Свободный SRP54M тоже дает сшивку с сигнальным пептидом, но выход продукта сшивания ниже, чем в случае белка SRP54, поэтому нельзя исключать возможность того, что SRP54NG тоже может принимать участие в связывании сигнального пептида [49, 51]. 1.15. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP Один из этапов работы SRP - это взаимодействие с SR. В результате этого взаимодействия транслирующая секреторный или мембранный белок рибосома оказывается связанной с мембраной. В ранних исследованиях были установлены некоторые основные характеристики этого взаимодействия. Во-первых, взаимодействие SR с SRP, приводящее к снятию ареста трансляции, не является замещением SRP на SR, поскольку SR не способен напрямую образовывать стабильный комплекс с транслирующей рибосомой [ИЗ]. Во-вторых, отсутствие контакта между SR и рибосомой предполагает существование на мембране рецептора для рибосомы. Действительно, если обработать микросомальные мембраны протеазой, а потом провести встраивание SR, то такие мембраны не способны связывать рибосомы. Позднее было показано, что рибосома контактирует с транслоконом, представляющим собой комплекс мембранных белков Sec61 [21]. В-третьих, была исследована зависимость взаимодействия SRP с SR от трансляции. Оказалось, что комплекс транслирующая рибосома/SRP связывается с мембраной при 0"С, когда нет трансляции, т.е. взаимодействие SRP с SR протекает независимо от элонгации [113]. SR, взаимодействуя с SRP, разрушает контакт SRP с сигнальной последовательностью растущего пептида, причем для этого необходим GTP [114].
В присутствии негидролизуемого аналога GTP (GMPPNP) SRP сохраняет способность образовывать комплекс с SR, но этот комплекс не диссоциирует, SRP остается связанной с мембраной и не может участвовать в последующих раундах транслокации [115]. С помощью анализа первичной структуры в составе белка SRa удалось найти GTP-связывающий домен, G-домен [114]. В первичной структуре белка SRP54 также был найден GTP-связывающий домен, причем между этими доменами наблюдалось значительное сходство [6, 116]. GTP-связывающий домен, а именно аминокислотные мотивы, характерные для всех GTP-связывающих белков, в белке SRa были мутированы, и была проведена функциональная проверка этих мутантов. Мутанты теряли частично или полностью способность образовывать комплекс с SRP в присутствии GMPPNP, и были неспособны осуществлять транслокацию [117]. Мутации в GTP-связывающем домене SRP54 давали тот же эффект [118]. Т.е. гидролиз GTP сопряжен с диссоциацией комплекса SRP/SR. Действительно, было показано, что GTP- связывающая и GTP-гидролизирующая активности отдельных белков SRP54 и SRoc очень низки. Образование комплекса SRP54/SRct сопровождалось значительным ускорением гидролиза GTP [119]. Таким образом, было показано, что помимо узнавания сигнального пептида, белок SRP54 выполняет еще одну функцию SRP -взаимодействие с SR. Следует сказать, что в так называемой классической модели работы GTPa3bi можно выделить два пограничных состояния ОТРазы: активное состояние в комплексе с GTP и неактивное состояние в комплексе с GDP. Переход между этими двумя состояниями позволяет ОТРазам изменять аффинность к другим макромолекулам, добиваясь регуляции биологического процесса. Переход между активным и неактивным состоянием сама GTPa3a осуществляет крайне медленно; катализаторами этого перехода выступают белки, стимулирующие СТРазную активность (GTPase activating proteins, GAPs) или белки, катализирующие диссоциацию GDP (guanine nucleotide exchange factors, GEFs) [76]. Были предложены несколько моделей того, как протекает гидролиз GTP комплексом SRP/SR. Первая модель базировалась на наблюдении, что SR усиливает сродство SRP54 к GTP [120]. Т.е. SRP54 не связан ни с GTP, ни с GDP, когда взаимодействует с сигнальным пептидом. SR, образуя контакт с комплексом транслирующая рибосома/SRP, стимулирует связывание GTP с SRP54. GTP стабилизирует комплекс SRP/SR и способствует высвобождению сигнального пептида [119,121]. Вторая модель предполагала, что SRP54 находится в комплексе с GTP, когда взаимодействует с сигнальным пептидом. SRoc выступает в качестве GAP-белка для SRP54. Гидролиз GTP посредством SRP54 приводит к высвобождению сигнального пептида. SRP54, в свою очередь, служит для SRoc GEF-белком, и связывание GTP белком SRoc приводит к диссоциации SRP [122].
Структура Alu-домена SRP
Белок Srpl4p является гомологом белка SRP14 из клеток животных (гомология составляет 30%) и находится в составе SRP в виде гомодимера [7, 8,135]. Белок Srp21p, как было показано, присутствует не только в SRP S. cerevisiae, но и в других видах дрожжей [136]. Вначале, анализ первичной структуры белка Srp21p не обнаружил гомологии с SRP белками из клеток животных [7]. Однако более тщательное выравнивание позволило выявить некоторое сходство между Srp21p и SRP9 как по первичной структуре, так и по предложенной для Srp21p вторичной структуре [136]. Было показано, что при связывании гомодимера белка SrpHp с scRl РНК наблюдаются защиты от гидроксильных радикалов в 5 -концевой области scRl РНК. Минимальный участок scRl РНК, который способен образовывать комплекс с SrpHp, представляет собой первые 99 нуклеотидных остатков [135]. Для минимального связывающего участка scRl РНК была предложена модель вторичной структуры, но в составе полноразмерной scRl РНК этот участок имеет, скорее всего, другую структуру [133]. К сожалению, на сегодняшний день не известна структура комплекса гомодимера белка Srpl4p с Alu-участком scRl РНК и пространственная укладка многочисленных спиралей Alu-домена scRl РНК. Неизвестны предполагаемые контакты белка Srp21p с белком Srpl4p и/или scRl РНК. Также неизвестен механизм сборки Alu-домена дрожжевой SRP. Белок Srp68p дрожжей имеет сходство с белком SRP68 высших эукариот, 18% аминокислотных остатков идентичны. Белок Srp72p содержит 23% аминокислотных остатков, которые идентичны аминокислотным остаткам в белке SRP72 человека [7]. Было показано, что по первичной структуре белок Sec65p является гомологом белка SRP19 человека [137]. В составе белка Sec65p можно выделить три домена: N-концевой, центральный и С-концевой домены [138]. Причем аминокислотные остатки, гомологичные аминокислотным остаткам белка SRP19, находятся в центральном домене. Белок Sec65p взаимодействует с S-доменом scRl РНК [133]. Белок Srp54p дрожжей содержит 47% аминокислотных остатков, которые идентичны аминокислотным остаткам в белке SRP54 человека. В его структуре также можно вьщелить три домена: N-домен, G-домен и С-концевой М-домен, который также содержит много остатков метионина. G-домен содержит аминокислотные мотивы, характерные для GTP-связывающих белков [100]. Белок Srp54p ассоциирован с S-доменом scRl РНК [133].
Существуют доказательства того, что белки Srp54p и Sec65p находятся в одном домене SRP и, возможно, взаимодействуют или белок Sec65p, по аналогии с белком SRP19, поддерживает структуру S-домена scRl РНК в компетентном для связывания белка 8гр54р состоянии. Было показано, что при отсутствии Srp54p белок Sec65p входит в состав SRP, тогда как при отсутствии Sec65p белок Srp54p теряет способность связываться с scRl РНК [7]. Избыток в клетке белка Srp54p способен супрессировать эффект от термочувствительного мутанта белка Sec65p [139]. 2.4. Биогенез SRP Благодаря тому, что в дрожжах можно довольно легко проводить различные генетические манипуляции, например, делеции различных генов, экспрессию в клетках генов, кодирующих белки с аффинными эпитопами, был довольно подробно изучен процесс сборки SRP в клетке. Как оказалось, белки SrpMp, Srp21p, Srp68p и Srp72p (так называемые коровые белки) находятся в клетке не только в цитоплазме, но и ядре. В транспорте этих белков в ядро принимают участие белки Кар123р и Pselp (рис. 16). Белок Sec65p также присутствует в ядре, транспорт в ядро зависит от белка Srplp и некоторых белков семейства импортинов. В нормальных условиях scRl РНК в ядре детектировать не удалось, однако ее накопление в ядре происходит при делеции гена любого из коровых белков. После синтеза и процессинга scRl РНК связывается с коровыми белками и с белком Sec65p, после чего происходит экспорт так называемой npe-SRP из ядра. Экспорт из ядра протекает при участии белков Xpolp, Nsplp, Nupl59p и Rrp44p. В цитоплазме к npe-SRP присоединяется последний компонент - белок Srp54p [140]. Рис. 16. Схема сборки SRP. Транспорт коровых белков и белка Sec65p в ядро осуществляется независимо. Отсутствие в клетке одного из перечисленных белков не влияет на локализацию других. При отсутствии scRl РНК коровые белки и белок Sec65p также присутствуют в ядре и в цитоплазме. На локализацию Srp54p не влияет делеция гена любого другого компонента SRP. Белок Srp54p всегда остается в цитоплазме [140, 141]. Используя описанную выше методику поиска генов компонентов SRP с помощью ПЦР с геномной ДНК с использованием праймеров к гомологичным участкам, П. Уолтеру удалось найти ген, кодирующий белок SRa. SRa дрожжей имел 44% аминокислотных остатков, идентичных SRa высших эукариот. Как и в случае SRa из клеток животных, SRa S. cerevisiae представляет собой периферический мембранный белок [142]. Белок SRp, как и белок SR0 высших эукариот, встроен в мембрану и также образует прочный комплекс с белком SRa. Также было показано, что GTP-связывающий домен белка SRP участвует в образовании комплекса с SRa, поскольку мутации в этом домене сопровождались разрушением комплекса [143]. В 2003 году была опубликована кристаллическая структура комплекса GTP-связывающего домена SR0 (31-244 аминокислотные остатки) с Х-доменом белка SRa (1-158 аминокислотные остатки), определенная с разрешением 1,7 А (рис. 17). GTP-связывающий домен белка SRP S. cerevisiae содержит такой же структурный а-Р мотив рі-а1-$2-33-а2-Р4-аЗ-Р5-а4-рб-а5, что и белок SRP мыши.
В пространстве этот мотив располагается аналогичным образом: в центре находится шести-тяжевой р-лист, окруженный пятью а-спиралями. Х-домен белка SRa из S. cerevisiae также содержит мотив Pl-p2-al-p3-p4 p5-a3-a4, пространственная структура которого организована аналогично структуре Х-домена SRa человека: р-тяжи образуют пяти-тяжевой антипараллельный р-лист, с вогнутой (внутренней) стороны находится al спираль, а с другой стороны - С-концевые а2 и аЗ спирали. В структуре можно наблюдать многочисленные контакты между GTP-связывающим доменом SRP и Х-доменом SRa. Петля «switch 1» (61-72 аминокислотные остатки, между al и Р2) белка SRp образует контакты со спиралью al и петлей между тяжами pi и Р2 (10-14 аминокислотные остатки) белка SRa. В образовании комплекса также принимает участие довольно протяженная петля между спиралями аЗ и а4 белка SRa [144]. 2.6. Функция SRP и SR: общие положения Функция SRP cerevisiae практически полностью совпадает с функцией SRP в клетках животных. Было показано, что в дрожжевой системе трансляции in vitro в присутствии микросомальных мембран дрожжевая SRP способна узнавать сигнальный пептид, вызывать «проходимый» арест трансляции и посредством взаимодействия с мембранным рецептором доставлять рибосомы к транслокационному участку мембраны [8,145]. Как отмечалось ранее, в дрожжевых клетках с помощью генетических манипуляций можно оценить, насколько важным для клетки процессом является котрансляционный SRP-зависимый транспорт белков в ER. Делеция генов, кодирующих 7SL РНК или белок SRP54, в дрожжевых клетках S. ротЪе летальна [4, 122]. В то же время, нарушение любого гена, кодирующего компонент SRP или SR, в клетках cerevisiae, не летально, но влечет за собой 4-6 кратное замедление скорости роста клеток. Помимо замедления скорости роста, в клетках, содержащих делению или делеции генов любого из компонентов SRP или SR, происходит накопление непроцессированых форм некоторых секреторных и мембранных белков [7, 131, 137, 139,142, 143]. В дрожжевых клетках, как было показано, выбор между SRP-зависимым и SRP-независимым способами транспорта белков протекает в соответствии с гидрофобностыо сигнальной последовательности: белки с наиболее гидрофобной последовательностью транспортируются преимущественно по SRP-зависимому пути транспорта [145,146,147]. Распределение функций между компонентами SRP из S. cerevisiae подробно не изучалось. Было показано, что белок Srpl4p участвует в аресте трансляции. Известно, что удаление 20 аминокислотных остатков в белке SRP14 делает арест трансляции невозможным. Была сконструирована SRP, в состав которой входил Srpl4p(-29C) белок, с С-конца которого были удалены 29 аминокислотных остатков.
Функция SRP и SR: общая схема работы SRP бактерий
Первая стадия в работе SRP заключается в узнавании сигнального пептида. Эффективность взаимодействия SRP с сигнальным пептидом, так же, как и у эукариот, зависит от гидрофобности пептида: чем больше гидрофобность, тем больше выход сшивки между пептидом и Ffh при сшивании [184]. В клетке сигнальные последовательности различаются между собой. Исследования in vivo так же показали, что белки с более гидрофобной сигнальной последовательностью транспортируются преимущественно по SRP-пути [185]. Следует заметить, что нарушение работы SRP не приводило к тому, что транспорт и последующее созревание белков прекращались вовсе, наряду с предшественниками в клетке обнаруживались и процессированные формы белков. Скорее всего, предшественники мембранных и секреторных белков способны использовать альтернативные пути транспорта в/через мембрану [173, 186]. Как известно, сигнальный пептид взаимодействует с гидрофобным участком М-домена белка Ffh. Также была сделана сшивка между сигнальным пептидом и NG-доменом [491, 105]. Присутствие сигнального пептида приводит к тому, что стабильность М-, NG-доменов и белка Ffh в целом резко снижается, их протеолиз может протекать значительно быстрее. Стабилизирующий эффект 4.5S РНК на белок Ffh преобладает над дестабилизирующим эффектом сигнального пептида [182]. Следующий этап работы SRP - взаимодействие с рибосомой. Было показано, что белок Ffh может образовывать сшивку с белком большой рибосомной субъединицы L23 [11]. Было также обнаружено, что сшивка образуется между N-доменом и белком L23. Присутствие FtsY не оказывало на эффективность образования сшивки никакого влияния [12]. Единственным не решенным на сегодняшний день вопросом остается вопрос о том, способна ли бактериальная SRP вызывать остановку трансляции. Кроме рибосомы и сигнального пептида, SRP взаимодействует также с белком FtsY. В клетке FtsY локализован частично на мембране, частично в цитоплазме. Однако в составе FtsY нет трансмембранных сегментов, скорее всего, это периферический мембранный белок [170]. Никакого структурного или функционального аналога SRp, посредством которого SRa может быть локализован на мембране, найти не удалось.
Возможно, N-концевой А-домен белка FtsY, который содержит много кислотных остатков, способен взаимодействовать с фосфолипидами. Действительно, если заменить А-домен на трансмембранный сегмент, то такой химерный белок вполне функционален [188]. Экспрессия отдельных А-, NG- и G-доменов и изучение их клеточной локализации показало, что NG- и G-домены, также как и А-домен, находятся на мембране, ведут себя как периферические мембранные белки [189]. Исследования in vitro показали, что NG-домен и полноразмерный FtsY белок способны взаимодействовать с фосфолипидами, особенно анионными [190]. Встраивание в мембрану белка FtsY происходит, скорее всего, котрансляционно, причем присутствие липидного бислоя оказывается важным при формировании NG-домена. Встраивание между А- и NG-доменами протяженного линкера (свыше 35 аминокислотных остатков) сохраняет способность мутантного белка взаимодействовать с мембраной, но полностью нарушает его функцию [191]. Существуют противоречивые мнения о важности А-домена для функции FtsY. Так, в одной работе [188] было показано, что частичное или полное удаление А-домена приводит к гибели клеток. В другой работе [192], напротив, были получены данные о том, что NG-домен, содержащий на N-конце 1, 4 или 9 аминокислотных остатков от А-домена, вполне функционален. 3.9. Функция SRP и SR: взаимодействие SRP и SR, гидролиз GTP Взаимодействие между Ffh и FtsY осуществляется посредством NG-доменов обоих белков. В 2004 году было показано, что М-домен белка Ffh также взаимодействует с FtsY [193]. Несмотря на то, что G-домены обоих белков обладают способностью связывать и гидролизовать GTP, по отдельности эти белки связывают GTP с очень низкой эффективностью, и практически не гидролизуют его. Гидролиз GTP протекает только при образовании комплекса Ffh/4.5S PHK/FtsY. Мутация в белке FtsY (D441N), приводящая к смене нуклеотидной специфичности с GTP на ХТР, позволила прояснить, каким образом протекает гидролиз. При образовании комплекса происходит гидролиз GTP и ХТР, т.е. Ffh и FtsY выступают в качестве GAP-белков друг для друга [194]. FtsY в свободном состоянии связывает приблизительно с одинаковой эффективностью как GTP, так и GDP. Самопроизвольный обмен нуклеотидов проходит очень быстро, его скорость сопоставима со скоростью обмена другой GTPa3bi, например белка Ras, в присутствии GEF-белка. Возможно, IBD вставка, которая характерна для SRP GTPa3, является внутренним нуклеотид-обменным фактором [195]. Аналогичные результаты были получены при изучении GTP-связывающей активности белка Ffh. Белок Ffh как в свободном виде, так и в присутствии 4.5S РНК или рибосомы, взаимодействует с GTP и GDP с одинаковой эффективностью. Обмен нуклеотидов протекает самопроизвольно с большой скоростью. На основе полученных данных можно сделать предположение о том, что, скорее всего, в клетке происходит спонтанный обмен нуклеотидов, и белок Ffh, находится преимущественно в комплексе cGTP[196]. Образование комплекса SRP/FtsY сопровождается конформационными перестройками в белке FtsY [197]. Следует отметить, что при образовании комплекса SRP/FtsY специфичность белка FtsY к GTP увеличивается в 103 раз.
Иными словами, SRP стимулирует GTP-связывающую и гидролизирующую активность FtsY [198]. Интересно проследить, какую функцию выполняет 4.5S РНК при образовании комплекса SRP/FtsY. Белок Ffh не способен сам взаимодействовать с FtsY [194]. Известно, что FtsY не взаимодействует и с 4.5S РНК. Однако мутации в концевой тетрануклеотидной петле 4.5S РНК, нарушающие структуру петли и прилегающего к ней спирального участка, не влияли на связывание 4.5S РНК с белком Ffh, но нарушали взаимодействие SRP с FtsY [199]. Как оказалось, 4.5S РНК выступает в качестве катализатора при образовании комплекса Ffh с FtsY, значительно ускоряла как образование комплекса, так и его диссоциацию [200]. Было показано, что 4.5S РНК ускоряла в 400 раз процесс образования комплекса Ffh/FtsY, при этом белки находились в комплексе с GTP. Гидролиз двух молекул GTP протекает значительно быстрее, чем диссоциация комплекса SRP/FtsY [201]. Недавно были получены экспериментальные данные, которые объясняют такое поведение 4.5S РНК. С помощью пробинга с использованием гидроксильных радикалов было показано, что в комплексе SRP/FtsY молекула 4.5S РНК располагается в непосредственной близости от места контакта NG-доменов белков Ffh и FtsY, причем FtsYNG может образовывать контакты с 4.5S РНК [202]. Помимо взаимодействия с SRP, белок FtsY взаимодействует с белком SecY, который входит в состав бактериального транслокона. Это взаимодействие наблюдали между очищенными белками in vitro, а также происходило совыделение белка FtsY при выделении транслокона из клеток. Данные результаты позволяют сделать предположение, что транслокон может принимать участие в регуляции работы SRP. Возможно, транслокон так же, как и в клетках эукариот, посредством взаимодействия SecY с FtsY индуцирует высвобождение сигнального пептида, которое должно происходить только в присутствии незанятого транслокона [203]. 3.10. Функция SRP и SR: роль SecA При взаимодействии рибосомы, транслирующей мембранный или секреторный белок, с транслоконом происходит объединение SRP-зависимого и независимого путей транспорта. Так, после высвобождения из комплекса с SRP сигнальный пептид мог быть сшит с белком SecY (один из компонентов бактериального транслокона) и с белком SecA (один из участников посттрансляционного SRP-независимого транспорта белков) [204]. Для некоторых белков, которые транспортируются по SRP-зависимому механизму, присутствие SecA совершенно необходимо [205]. Дальнейшие исследования показали, что SRP и SecA работают независимо друг от друга, SRP узнает сигнальный пептид и направляет транслирующую рибосому к мембране, a SecA принимает участие в транслокации белка через мембрану [206, 207].
